박테리아에 감염된 형질전환 제브라피시의 광변환 기반 백혈구 추적

백혈구(식세포 면역 세포)에서 광전환 형광 단백질을 발현하는 아가로스 포매, 마취, 형질전환 제브라피쉬 유충이 들어 있는 접시로 시작합니다.

적색 형광 염료 표지 박테리아가 미리 주입된 왼쪽 귀 소포는 접시 바닥에 평평하게 위치합니다.

이낭 내에서 사전 주입된 박테리아는 국소 감염을 일으켜 면역 세포 이동과 케모카인 방출을 유발하여 백혈구가 이낭으로 침윤합니다.

형광 현미경으로 감염 부위에서 녹색 백혈구의 초기 모집과 백혈구에 의한 적색 박테리아의 식

405나노미터 파장으로 이소포를 비추어 광전환 형광 단백질을 녹색에서 빨간색으로 비가역적으로 변형시키고 백혈구에 적색 형광을 부여하여 뚜렷한 시각화와 정확한 추적을 가능하게 합니다.

이제 다양한 깊이에서 두 가지 파장으로 유충을 검사하여 광변환된 빨간색 백혈구와 나머지 녹색 형광 백혈구를 모두 시각화할 수 있습니다.

광변환된 적색 백혈구는 이낭에서 분산되어 몸 전체에 흩어져 광전환 기반 백혈구 추적을 용이

실체 현미경 스테이지의 텍스트 프로토콜에 따라 트리카인으로 아가로스를 준비한 후, 이송 피펫을 사용하여 4-5마리의 마취된 유충을 유리 바닥 접시에 넣습니다. 섭씨 55도의 수조에서 트리카인과 아가로스 용액을 제거하고 실온에서 1-2분 동안 식

동안 마취된 유충에서 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 다음으로 표면의 절반 정도가 덮일 때까지 식힌 아가로스를 접시에 붓습니다. 그런 다음 접시를 휘젓어 아가로스를 퍼뜨립니다. 접시 측면에 떠 있는 유충을 집어 중앙으로 다시 피펫팅합니다. 그런 다음 실체 현미경 아래에서 긴 피펫 팁을 사용하여 유충을 원하는 대로 부드럽게 배치합니다.

귀낭을 영상화하려면 오른쪽 귀낭이 위를 향하고 왼쪽 귀낭이 접시 바닥에 평평하도록 유충을 배치합니다. 접시를 옮기기 전에 아가로스를 약 10분 동안 식히십시오. 그런 다음 아가로스 층 위에 트리카인과 E3 용액을 부드럽게 피펫팅하여 촉촉하게 유지합니다.

샘플을 시각화하려면 488나노미터 및 543나노미터 레이저로 z-스택 스캔을 사용하십시오. 연속 라인 스캐닝을 사용하여 레이저 출력과 검출기 게인을 조정합니다. 실수로 광변환된 적색 형광이 없는지 확인합니다. "이미지 획득 제어" 창의 "자극 설정"에서 "스캐너 사용" 도구를 선택하고 "기본"을 선택합니다. 405나노미터 레이저를 선택하고 70% 출력으로 설정합니다. 그런 다음 원 옵션을 사용하여 귀 소포의 관심 영역을 정의합니다.

"자극 시작 설정"에서 사전 활성화가 1프레임이고 활성화 시간이 60,000밀리초인 " 직렬 활성화"를 선택합니다. "획득 설정" 창의 "시간 스캔" 제목 아래에서 두 개의 분 간격을 선택하며, 각각 사전 변환용과 사후 사진 변환용입니다. 타임랩스 시리즈를 시작하여 정의된 관심 영역의 광변환을 시작합니다. 마지막으로, z-스택과 488 및 543 나노미터 레이저를 사용하여 샘플을 스캔하여 광변환 된 적색 형광과 나머지 녹색 형광을 시각화합니다.