의 번데기 케이스를 통해서 영상 초파리

이 비디오에서는 puer의 구조적 무결성을 손상시키지 않으면서 Drosophila Melanogaster의 pube를 이미지화할 수 있는 새로운 기술을 시연할 것입니다. 동공 사례를 그대로 유지함으로써 번데기의 발달과 생존 가능성에 대한 이미징의 영향을 최소화합니다. 우리는 이미징을 위해 공진 스캐닝 8, 000 헤르츠 컨포칼 현미경을 사용합니다.

중요한 것은 이 현미경의 매우 빠른 스캔 속도와 높은 감도로 인해 표백이 크게 줄어들어 장기간 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 통해 우리는 행동, fop, podia, 형태 형성, phagocytosis 및 유사 분열을 포함한 다양한 세포 생물학적 과정을 시각화 할 수있었습니다. 이 기술을 사용하면 유기체를 손상시키지 않고 장기간 현장에서 사건을 관찰할 수 있습니다.

이러한 방법에서 얻은 관찰은 상대적으로 접근하기 어려운 초파리 발달 단계에서 다양한 생물학적 현상을 이해하는 데 사용할 수 있으며, 치즈 사람들, 적절한 단계, 세포 분열을 연구하기 위해 발달 단계에서 주요 지표를 찾기 위해 바이알에서 여전히 검사하는 동안 이를 조사하고, 머리를 피한 비파를 찾습니다. 그러나 여전히 녹색 패킷과 태변 및 등쪽 복부는 표시되지 않습니다. 촉촉한 붓으로 엿보기 케이스를 만지고 물을 옮겨 타액 접착제를 녹임으로써 개인을 풀어줍니다. 그런 다음 비파를 부드럽게 살짝 밀어 넣고 붓으로 집어 물이 담긴 페트리 접시로 옮깁니다.

사람들은 음식이나 부스러기의 케이스를 청소하기 위해 물로 철저히 씻습니다. 그런 다음 등쪽이 위로 향하게 정렬하여 올바른 단계에 있는지 확인합니다. 조심스럽게 다루십시오.

파이프에 작은 구멍이 뚫리면 쉽게 죽을 수 있습니다. 선택한 개인은 신중하게 배치되고 유리 바닥 페트리 접시와 관심 기능이 커버 슬립에 가장 가깝고 가능한 한 표면과 평행하도록 방향을 지정합니다. 동공 날개를 관찰하기 위해 우리는 번데기를 얇은 길이, 모델링 점토 또는 치과 왁스와 같은 지지대에 대고 배향 후 움직이지 않도록 합니다.

그런 다음 관심 기능이 눈에 띄고 방향이 잘 잡혀 있는지 확인하기 위해 접시를 초대합니다. 일반적으로 한 번에 여러 개의 비파를 장착하면 하나가 형광 단백질을 발현하지 않거나 원하는 단계에 있지 않을 가능성을 방지할 수 있습니다. 비파가 모두 장착되고 방향이 제대로 잡히면 순수한 기름 또는 물로 희석된 물의 굴절률과 일치하는 무독성 산인 디오드 딜린 글리콜을 적신 붓으로 각 비파의 바닥을 만집니다.

이것은 동공 케이스의 회절을 줄이고 침수의 굴절을 줄이는 이중 목적을 수행합니다.번데기를 적절하게 장착하고 배치하면 렌즈가 사용됩니다. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 이동합니다. 우리는 공명 스캐너가 장착된 SP five와 같은 거꾸로 된 것을 사용합니다.

접시는 현미경에 장착되고 현미경 광학 장치를 사용하여 puput을 찾습니다. 번데기를 찾으면 이 경우 관심 기능인 날개가 보이도록 초점을 조정합니다. 우리는 날개의 중앙을 가로지르는 큰 기관 요소의 존재로 날개를 식별합니다.

관심 영역이 식별되고 현미경에 초점이 맞춰지면 20 x dry 대물렌즈로 이동합니다. 초점을 재확인한 후 현미경을 컨포칼 모드로 전환합니다. 우리는 빛 노출을 최소화하기 위해 공초점의 매개변수를 조정합니다.

광도는 10% 투과 이하로 유지됩니다. 밝기를 최대화하기 위해 azuma four가 있는 20x 렌즈의 핀홀을 130미크론으로 열고 게인을 900볼트로 설정합니다. 이러한 설정을 사용하면 유사 분열 간격의 길이나 동물의 건강에 영향을주지 않고 몇 시간 동안 이미지를 만들 수 있습니다.

다음으로, Z 절편의 수와 이미지 캡처 빈도를 관찰하려는 생물학적 현상의 특성(예: 1분 이미징 간격이 세포 분열의 모든 중요한 특징을 충분히 캡처)과 일치하도록 설정합니다. 그러나 3초 간격은 phylo podia의 역학을 관찰하는 데 중요합니다. 원하는 특징을 찾을 때까지 상피를 통해 위아래로 초점을 맞춥니다.

필요한 경우 현미경 및 XYZT 모드를 사용하여 시간에 따라 Z 스택을 수집합니다. 영화의 지속 시간도 중요한 매개변수입니다. 우리는 10 시간 길이의 비디오를 만들었습니다.

여러 형광 분자를 동시에 이미징할 때 총 이미징 시간을 단축하려고 합니다. 원칙적으로 각 형광 태그는 활성 산소 종의 생산을 증가시킵니다. 실제로, 우리는 1시간 이내에 삼중 라벨링된 라인을 이미징하는 것과 관련된 치사율을 관찰하지 못했습니다.

대상 조직 또는 과정이 약 5미크론보다 작으면 침지 렌즈를 사용해야 할 수 있습니다. 이 렌즈는 레이저를 더 미세한 지점으로 초점을 맞추어 빛의 강도를 증가시키고 그에 따라 이미징 매개 변수를 조정해야하며 영화는 컨 포칼 현미경에서 고속도로 이미지 분석 프로그램 인 피지를 실행하는 컴퓨터로 전송됩니다. 피지를 사용하면 컨포칼에 의해 생성된 다차원 이미지에서 기능을 열고, 측정하고, 조작할 수 있습니다.

이 이미징 방법을 통해 세포주기에 대한 핵의 위치를 연구할 수 있었습니다. 동공(pupil wing)에서 우리는 상피의 상단에서 가장 관찰 가능한 맨 아래의 핵까지 1분 간격으로 Z 스택을 수집했습니다. 이 영화에서 우리는 왼쪽에 표시된 정점 공초점 부분에서만 발생하는 분열을 관찰했으며, 오른쪽에 표시된 더 많은 기저 부분은 표재층에서 새로 분열된 핵의 복귀를 보여주지만 유사분열의 다른 특징은 포함하지 않습니다.

이러한 데이터는 빠르게 분열하는 동공 날개 상피가 유충 날개 디스크 및 다른 MedOne과 유사하다는 것을 보여줍니다. 그 핵의 상피는 유사분열 동안 상피의 정점 표면으로 이동합니다. 이러한 공통점에도 불구하고, 동공 날개 상피는 대부분의 핵이 최상층에 매우 가까운 상대적으로 성층화되지 않았습니다.

동공 발달의 초기 단계에서 초파리를 이미징하는 이전의 방법은 주로 동공 케이스를 제거하거나 관통하려는 시도로 인해 방해를 받았습니다. 우리는 여기에서 유기체의 생존 능력에 영향을 주지 않고 발달 중에 성체 세포를 시각화할 수 있는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 우리의 방법은 동공 사례를 완전히 그대로 유지한다는 점에서 다른 방법과 질적으로 다릅니다.

컨포칼 현미경 검사와 공진 스캐닝을 결합하면 동공 케이스에서 20미크론 이내의 발달 조직을 시각화할 수 있습니다. 깊이 분해의 주요 한계는 렌즈의 작동 거리와 케이스에서 조직 내 산란입니다. 그러나 우리의 방법을 사용하면 정점에서 기저부까지 상피 세포의 특징을 해결할 수 있습니다.

우리는 이 기술을 사용하여 유사분열, 계통, 족부, 형태형성 및 식세포작용을 관찰했습니다. 이 외에도 하나의 샘플에서 최대 3개의 고유한 형광 태그를 연구했습니다. 우리는 여기에 설명된 접근 방식이 가장 바깥쪽 상피층에 대한 연구까지 동공 발달의 초기 기간을 열었다고 믿습니다.

geal 유전학의 힘과 결합하면 이러한 접근성은 성인 발달에 대한 우리의 이해를 더욱 향상시킬 수 있습니다.