Name: 의 번데기 케이스를 통해서 영상 초파리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T15:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 번데기의 구조적 무결성을 유지하며 공명 스캐닝 공초점 현미경으로 세포 분열과 형태 발생을 실시간 관찰하는 방법. 이 기술은 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 지적 지원, 물자 지원, 종목 아키라 치바을 인정하고 싶습니다. 덧글에 대한 줄리아 달만에 감사합니다.

1. 일 플라이 <ol><li> 실내 온도 10에서 표준 옥수수 가루 한천-당밀 효모 매체에 파리를 유지한다. </li><li> 십자가를 들어, 우화의 6 시간 내 처녀를 분리. 원하는 유전자형의 남성을 횡단 한 후, 변경 사항은 모든 3-4일 새로운 유리 병에 파리. </li></ol> 주 : 이들 실험의 경우, 인 Gal4 라인 A9는 날개에서 도입 유전자의 발현을 구동하는 데 사용 하였다. 플라이 주식 블루밍턴 주식 센터에서 얻을 수 있습니다. 이 실험에 사용 된 주식은 A9-인 Gal4 (BL 번호 8761), His2Av-GFP (BL 번호 5941), SCO는 / CYO HsCre (BL 번호 1092), UAS - ChRFP - 욕조 (BL 번호 25773), 11 lollibow 있습니다. 2. 선택 및 번데기의 장착 <ol><li> 무대 번데기 하나 흰색 prepupae (WPP)로 수집하고 적절한 연령에 도달 할 때까지 25 ° C에서 그들을 유지하거나 형태 학적 기준 (12)을 사용하여. </li><li> 세포 분열, 최근 머리 외전을받은 선택 번데기를 관찰하십시오.이 시점에서 때까지 그냥 우화 (에서&gt; 96 시간) 전에, 번데기는 움직이지 장기간 경과 관찰을 허용하고 있습니다. </li><li> 먼저 물을 붓에 그들을 괴롭히는 부드럽게 한 후 접착제를 느슨하게 할 수 있도록 잠시 대기, 물에 적신 붓으로 터치하여 유리 병에서 번데기를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 침샘 접착제와 음식 입자를 제거하기 위해 물에 붓으로 그들을 괴롭히는 선택한 번데기를 씻어. </li><li> 커버 슬립 바닥 (번호 1 ½ 커버 슬립)와 25mm 페트리 접시에 깨끗한 번데기를 전송합니다. </li><li> 그 조직이 coverslip에 가장 가까운 수 있도록 지원 등의 점토 또는 치과 왁스 하나의 얇은 스트립을 사용하여, 번데기를 탑재합니다. 참고 : 여기에 설명 된 연구에서, 번데기 날개, 다리, 복부 histoblasts 또는 지느러미 notum이 관찰되었다. 실제로, 번데기 케이스의 표면의 20 μM 내의 조직 관찰 가능하다. </li><li> 동양 번데기주의 깊게 있도록 Tissu은또한 E는 유리 커버 슬립의 표면에 평행하다. </li><li> 번데기가 장착되면, 번데기 및 커버 슬립 사이의 공간에 티 오디 글리콜 (TDG)의 얇은 층을 전송하기 위해 붓을 사용합니다. </li></ol> 참고 : TDG는, 표면 산란을 감소 오일의 굴절률과 일치하고, 산소가 조직 (13)을 투과 할 수있다. 그들은 세포 행동의 빠른 중단의 원인이 산소의 조직을 박탈하는 경향 오일의 사용은 권장되지 않습니다. 3. 영상 참고 : 영상의 경우, 공 초점 현미경 confocality가 번데기 케이스의 강렬한 조명에 의한 어둡게 배경의 대부분을 제거 필수 될 가능성이 높습니다. <ol><li> 번데기 개발과 생존에 대한 조명의 영향을 최소화하기 위해 공 초점에 대한 설정을 조정합니다. 그렇게하려면, 여진 강도 및 컬렉션의 감도 간의 균형. 영상 위스콘신의 일반적인 구성라이카 SP5는 공진 스캐너 (8,000 Hz에서), 2 %로 설정 레이저 파워 (20 % 전력의 10 % 투과율), 120 μm의 작은 구멍 세트, 라인이 8로 설정 평균을 사용하는 일을. 설정 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 미세 규모가 초점 심도를 제한하지만 성공적으로,이 방법에 사용 된 40X 및 63X 기름 침지 렌즈 (0.1 mm 작동 거리와) 같은 다양한 해결하려면. 4. 분석 프레임을 분석하기 위해, Z-스택이나 영화보기, 측정, 및 프리젠 테이션 (14) 파일을 수정하기위한 효과적인 도구가 피지에 데이터 파일을 가져옵니다. 예를 들어 유사 분열을 완료하는 시간은 telophase 할 의향로부터 셀을 보면서 단계별로 프레임 샘플링 간격 및 다차원 이미지 브라우저를 사용하여 측정 하였다. x-, Y-및 Z-치수 측정 도구를 사용하여 측정 할 수있다. 소프트웨어와 그 사용에 대한 자세한 지침은참조 : http://fiji.sc/Fiji을.

<ol><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+Fzy%2FCdc20+and+Fzr%2FCdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).</li>
<li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li>
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<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

분할 세포의 기능, His2AvGFP 발현 세포의 공 촛점 분석을 통해 초파리의 살아있는 번데기 날개의 유사 분열을 관찰하기위한 간단한 준비에 필요한 개발을 시각화, 측정, 정량화한다. 이 방법은 번데기 날개의 세포주기가 유사 분열을 입력 상피 세포의 꼭대기의 표면에 그 핵의 움직임에 pseudostratified 상피 세포의주기를 셀에 강한 유사성을 맺는 것을 문서화하는 데 사용되었다. telophase에 따라, 핵은 다시 상피 층에 놓습니다. 따라서,이 단층, 분명히 unstratified 상피 세포, 쇼의 세포는 핵 마이그레이션을 interkinetic 제한. 공개 주식과 초파리 11에서 17 종류의 라이브 영상을 brainbow 위해 만들어진 라인의 영상은,이 기술은 다른 생물학적 현상의 연구에 일반화 할 수 있음을 보여 주었다. 여기에 설명 된 기술은 보라의 생산에 사용되었다분에서 10 시간까지 배 이상 OS. 어느...

<html> 식초 파리, 초파리 melanogaster의는. 초파리 연구를 표현, 최저 돌연변이 등의 유전자 조작의 세련된 형태를 허용 유전자 실험의 풍부한 역사를 가지고 생물학의 여러 측면을 연구하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다. 형광 단백질 라벨의 도래와 함께,이 레퍼토리는 살아있는 동물의 세포와 단백질의 연구를 포함하도록 확장했다. 플라이 배아는 생체 내 1-3 깊은, 고해상도 영상을 허용 작은 광학적으로 알 수있는 바와 같이 이러한 연구를위한 훌륭한 시스템이다. 플라이 개발의 다른 단계 진통제 4, 해부 및 단기 문화 5,6, 또는 영상 7,8의 표피에있는 윈도우의 생성을 필요로하는, 덜 다루기 쉬운적일 수있다. 이러한 조작은 보통 장기 동물 발달을 손상 또는 짧은 기간에 촬상을 제한 방식으로 동물에 영향을 미친다. 대부분의 배아 줄기 세포주기가 절단되기 때문에 세포주기 규제 유사 유전자의 새로운 변이를 연구하는 엔트 &quot;&gt;, 그것은. 세포주기의 타이밍과 충실도를 연구하는 적절한 준비를 찾을 수 필수적이었다 (SM 또는 S-G2-M) 및 연구에서 돌연변이는 이후 단계까지, 그것은 번데기 조직에서 세포주기를 관찰하는 것이 중요하다고 결함을 표시하지 않습니다. 번데기에있는 상피 세포가 전형적인 G1-S-G2-M 세포주기와이 단계의 번데기가이 근육의 움직임 9 할 수 없다. 조작에 대한 초기 시작 지점 번데기 경우의 명백한 불투명도에도 불구하고 Histone2AV-GFP를 표현 그대로 전체 번데기를. 포함이 그대로 준비가 생체 내 이미징에서 장기적으로 우수한 것으로 판명.이 기술은 간단합니다 학부 연구원이 정기적으로 초파리에서 세포 및 발달 생물학의 측면을 연구하는 데 사용할 아직 해상도가 마이크로 미터 스케일 기능의 차별을 할 수 있도록 충분히 괜찮 충분히. 이 방법에서는, 시간, 분, 또는 초 이상의 이벤트의 관측은 단순히 시계열 파라미터를 조정함으로써 가능하다. 파란색, 녹색, 노란색, 오렌지색과 적색 형광 단백질, 또는 이들의 조합을 사용하여 비디오,되었습니다. 중요한 경우, 치료조차 장기간 이미징 동물의 개발이나 생존에 영향이 없으며 레이저의 강도를 최소화하도록 수행된다.

<table><tbody><tr><td>플라이 스터프 플라이 패드</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>마취</td></tr><tr><td>CO2 가스</td><td>Airgas South</td><td>CD50</td><td>플라이 마취</td></tr><tr><td>레귤레이터</td><td>Airgas South</td><td></td><td>CO2 레귤레이터</td></tr><tr><td>플라이 바이알</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-113RLBF</td><td>플라이 문화</td></tr><tr><td>Drosophila 라인:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 바닥 접시 #1 1/2</td><td>WillCo Wells BV</td><td></td><td>현미경 검사용</td></tr><tr><td>Thiodiethylene Glycol</td><td>Fluka</td><td>88559</td><td>마운턴트</td></tr><tr><td>모델링 점토</td><td>예술 용품점</td><td></td><td>Paintbrushes 미술 용품점에</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 번데기를 배치하는 지원 <td>파리를 조작하기 위해</td></tr><tr><td>Fine Forceps, Inox #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>이미지</td><td>/영화 분석을 위한 모든</td><td></td> 8Gb RAM</tr><tr><td>피지 소프트웨어</td><td></td><td>무료 웨어 http://fiji.sc/Fiji</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td>빠른 스캐닝 컨포칼은</td></tr><tr><td>20X 건조 및 40X 또는 63X 오일 이멀젼 렌즈</td><td></td>로 충분해야 합니다. <td></td> 이미징 <td>조직, 세포 및 세포 내 기능을 위해</td></tr><tr><td>이멀젼 오일(무형광등)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>무엇이든</td><td></td><td>파리를 위해 조작</td></tr></tbody></table>

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

세포 및 발달 생물학 모델로 초파리의 오랜 사용 도구의 배열을 굴복했다. 함께, 이러한 기술은 방법 론적 다양한 각도에서 세포 및 발달 생물학의 분석을 사용할 수있다. 라이브 영상은 세포 분열 또는 세포 운동성 동적 셀 프로세스를 관찰하기위한 새로운 방법이다. 그것은 실시간 이미징을 사용하여 반응계 내에서 유사 분열을 관찰하는 것이 필수적이되었다에 uncharacterized 추정 세포주기 단백질에 돌연변이를 갖는 격리. 초파리에있는 대부분의 라이브 영상 연구 때문에 그들의 작은 크기와 광학 선명도의 조작과 관찰에 액세스 할 수있는 배아 단계에 초점을 맞추고있다. 이 간극 단계 중 하나 또는 모두를 결여에 그러나, 이들 단계에서 세포주기가 드물다. 대조적으로, 초파리의 번데기 날개의 세포는 전형적인 세포주기를 가지고 번데기 전개 약 20 시간에 걸쳐 급격한 유사 분열주기를 겪는다. 내가 용이dentify 및 현장에서 유사 분열을 잡을 수있는 적절한 단계의 번데기를 분리. 설치 그대로 번데기 실험은 세포와 동물 생존에 미치는 영향을 최소화하면서 몇 시간 동안 실행할 수 있도록 이미징 동안 취급 용이성 및 내구성의 최상의 조합을 제공했다. 이 방법은 작은, 또는보다 작은 염색체를 비행 기능을 관찰 할 수 있습니다. 현미경 설정 및 설치의 세부 사항 조정, 준비의 확장을 막 인접 셀의 역학과 같은 튜 불린과 같은 형광 표지 단백질을 시각화 할 수있었습니다. 이 방법은 모든 시험 형광 단백질을 작동 시간 규모의 다양한 통해 서브 마이크론 규모의 기능을 캡처 할 수 있습니다. 기존의 공 초점 현미경으로 번데기의 외부 20 μm의 제한하지만, 생체 내에서 번데기 조직에서 단백질과 세포 역학을 관찰하는이 방법은 이러한 조직에서 세포 및 발달 생물학의 연구에서 일반적으로 유용 할 수 있습니다.

이러한 현상 초파리 눈 또는 현상 척추 중추 신경계의 심실 층으로서 pseudostratified 상피 세포는, 핵 운동을 겪는, 세포주기에 맞춰, interkinetic 핵 옮기는 칭했다. 핵은 기저 표면 또는 근처에와 핵이 혀끝의 표면 (15, 16)에 도달하면 세포가 유사 분열을 입력 할 때 DNA 복제가 발생합니다. 번데기 날개 세포는 머리 외전 후 첫 몇 시간 동안 빠른 속도로 나누어 단층 상피 세포를 형성한다. 데이터는 섹션 1 분 간격으로 매 2 μm의 복용 초기 번데기 윙에서 xyzt 모드에서 수집되었다. 그 결과 3D 영화의 유사 분열 만 혀끝의 표면 (그림 1A)에서 관찰되었다. 더 기저 위치에서 찍은 부분은 유사 분열의 흔적 (그림 1B)를 보여 주었다 그러나 새로 분할 핵이 혀끝의 표면에서 반환 된 핵 움직임이 발생했습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.내 페...

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

본 영상에서는 번데기의 구조적 무결성을 손상시키지 않고 Drosophila Melanogaster 번데기를 이미징할 수 있는 새로운 기술을 시연하겠습니다. 번데기 껍질을 온전하게 유지함으로써, 이미징이 번데기의 발달과 생존력에 미치는 영향을 최소화합니다. 이미징에는 8,000 hertz 공초점 공명 스캐닝 현미경을 사용합니다.중요한 점은, 이 현미경의 매우 빠른 스캔 속도와 높은 민감도 덕분에 광퇴색이 크게 감소하여 장시간 관찰이 가능하다는 것입니다. 이 방법을 통해 우리는 세포의 행동, fop, podia, 형태 형성, 식세포 작용 및 세포 분열을 포함한 다양한 세포 생물학적 과정을 시각화할 수 있었습니다. 이 기술을 사용하면 유기체에 손상을 주지 않고 장기간 동안 in situ 상태에서 일어나는 사건들을 관찰할 수 있습니다.이러한 방법들을 통해 얻은 관찰 결과는 초파리 발달의 비교적 접근하기 어려운 단계인 적절한 단계(Cheese people)에서 다양한 생물학적 현상을 이해하는 데 사용될 수 있습니다. 우리는 바이알 내에 있는 상태에서 발달 단계의 주요 지표를 찾아 이를 조사하며, 세포 분열을 연구하기 위해 머리를 돌렸으나 아직 등쪽 복부에 녹색 패킷과 태변이 나타나지 않은 pupae를 찾습니다. 젖은 붓으로 pupal case를 터치하여 물을 전달함으로써 타액 접착제를 녹여 개체를 분리합니다. 그 후 pupae를 조심스럽게 밀어내어 분리한 다음, 붓으로 집어 물이 담긴 페트리 접시에 옮깁니다.음식물이나 이물질을 제거하기 위해 개체들을 물로 깨끗이 세척합니다. 그 다음, 적절한 발달 단계인지 확인하기 위해 개체들을 등 쪽이 위로 향하게 일렬로 세웁니다. 이때 개체들을 조심스럽게 다루십시오.파이프에 작은 구멍만 생겨도 쉽게 죽을 수 있습니다. 선택된 개체를 유리 바닥 페트리 접시에 조심스럽게 옮기고, 관심 부위가 커버슬립에 가장 가깝고 표면과 최대한 평행하도록 방향을 잡습니다. 번데기 날개를 관찰하기 위해, 모델링 점토나 치과용 왁스와 같은 얇은 지지대에 번데기를 기대어 고정하며, 방향 설정 후 움직이지 않도록 합니다.그런 다음, 관심 있는 특징이 잘 보이고 적절하게 방향이 잡혀 있는지 확인하기 위해 디쉬를 살펴봅니다. 일반적으로, 형광 단백질이 발현되지 않았거나 원하는 단계에 있지 않을 가능성에 대비하여 한 번에 여러 개의 pipa를 마운팅합니다. pipa가 모두 마운팅되고 방향이 적절하게 잡히면, 오일의

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를...

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

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손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

출처: Hellerman, M. B.,  et al.  Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015){{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

여기에서는 다양한 발달 단계에서 초파리를 준비하고 맞춤형 광학 간섭 현미경(OCM) 시스템을 사용하여 초파리 심장 박동의 종단 광학 이미징을 수행하기 위한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 심장의 형태학적 및 역학적 변화는 OCM 이미지에서 심장의 구조적 및 기능적 매개변수를 분석하여 정량적으로 특성화할 수 있습니다.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

여기, 우리 라이브 이미징 일반 및 근육-힘 줄 morphogenesis 개발 프로세스의 특히 생활에서 수행 하는 쉬운--사용 하 고 다양 한 방법 제시 초파리 번데기.

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

이 프로토콜은 과일 파리가 변형을 겪으면서 Drosophila 복부 상피에서 세포 배향 및 조직 성장의 역학을 이미징 및 분석하기 위해 설계되었습니다. 여기에서 기술된 방법론은 Drosophila 또는 그밖 모형 유기체에 있는 다른 발달 단계, 조직 및 subcellular 구조물의 연구 결과에 적용될 수 있습니다.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

여기에서 우리는 생리학적 조건에서 세포 및 세포 내 역학을 관찰하기 위해 Drosophila melanogaster 세 번째 instar 유충에서 살아있는 외식편 뇌를 준비, 해부, 장착 및 이미지화하는 워크플로에 대해 논의합니다.

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

여기에서는 번데기를 완전히 제거하는 번데기 단계에서 초파리 다리의 장기 라이브 이미징을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다.

번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

초파리는 근발생의 기본 메커니즘을 이해하는 강력한 모델입니다. 흉부 반절편 절편을 해부 및 준비하기 위한 이 프로토콜은 번데기 및 성인 단계 모두에서 간접 비행 근육의 현미경 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세포 형태, 단백질 국소화, 근육 구조 및 근형성의 기타 여러 측면의 공초점 이미징을 가능하게 합니다.

현미경 접근을 위한 Drosophila melanogaster 간접 비행 근육의 해부

배우세요 Drosophila melanogaster 번데기의 구조적 무결성을 유지하며 공명 스캐닝 공초점 현미경으로 세포 분열과 형태 발생을 실시간 관찰하는 방법. 이 기술은 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상

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