에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila

Drosophila melanogaster 내에서 발달 중인 기관의 재구성을 수행하기 위해서는 번데기 자체 내에서 빛의 전파를 가장 잘 설명하는 순방향 모델을 결정해야 합니다. 절차는 흰색 pre pupa를 선택하고 모세관 끝에 붙여서 poppa의 전방 후방 축이 튜브와 평행을 이루도록 하는 것으로 시작됩니다. 작은 모세관 튜브에 형광 염료를 채워 동공 케이스에 삽입합니다.

조심스럽게 축을 조정한 후 번데기를 360도 회전시킵니다. 이미지는 다양한 각도에서 획득됩니다. 획득한 형광 트랜스 조명 데이터는 장기 발달을 이미지화하는 데 사용될 전방 모델을 결정하는 데 사용됩니다.

안녕하세요, 제 이름은 클라우디아이고 하버드 의과대학 매사추세츠 종합병원의 보조 생물학 센터에서 근무하고 있습니다. 저는 하버드 의과대학 파라마운트 연구소의 울라 페토우(Ula Petou)이고, 뮌헨 공과 대학과 뮌헨 헬리만 센터(Heliman Center)의 생물 및 의료 영상 연구소(Institute for Biological and Medical Imaging)의 다니엘 로잔스키(Daniel Rozanski)입니다. 오늘은 Oph Melano Casta에서 전신을 3차원으로 재구성하는 절차를 보여드리겠습니다.

우리는 동공 상태에서 장기의 발달에 대한 생체 내 시각화를 위해 실험실에서 이 절차를 사용합니다. 시작하기 전에 시작하겠습니다. 이 비디오 이전에 시청해야 하는 동반 비디오는 없으며, 광학 프로젝션 단층 촬영의 일부 기술적 측면이 여기보다 더 자세히 설명되어 있습니다.

또한 다른 비디오는 더 큰 동물의 준비된 조직이나 장기의 이미징을 설명합니다. 이 비디오에서 다루는 모든 실험에는 forge drosophila transgenes가 사용됩니다. 그들은 타액선에서 발현되는 EL A gal four, 성인 날개의 유충 전구체 조직에서 발현되는 apteris gal four, 형광 단백질을 만드는 전이 유전자 인 흉부입니다.

U-A-S-G-F-P라고 불리는 4 갈과 백색 1118에 대한 응답으로, UAS 전이 유전자를 가진 형광 대조군이 아닌 수컷은 GAL 4 전이 유전자를 가진 처녀 암컷에게 교배되어 조직을 달성합니다. GFP 십자가의 특정한 표정은 빵의 효모의 뿌림을 가진 표준 비행거리 매체에 8명에서 10명의 처녀 여성 그리고 수컷에서 설치된다. 표면적으로 바이알은 섭씨 25도의 가습 인큐베이터에서 12시간 동안 밝고 어두운 주기로 보관됩니다.

십자가 시작 2일 후, 부모는 새로운 바이알로 옮겨지고 5-6일 후에는 PUI가 흰색 PrepU 바이알을 채우기 시작합니다. 저는 형광 해부 내시경에서 GFP 발현을 위해 선택됩니다. 흰색 pre pui를 선택하면 약 1 시간 동안 흰색으로 유지되기 때문에 동물의 적절한 준비를보장합니다.

동공 형성 후에는 색소가 변하거나 갈색을 띱니다. Pui를 표현하는 GFP는 젖은 페인트 브러시를 사용하여 바이알에서 부드럽게 수집하고 페트리 접시에 물방울이나 PBS에 넣고, 구매는 자가 형광 물질을 깨끗이 닦아야 합니다. 이제 페인트 브러시를 사용하여 단층 촬영 이미징을 할 준비가 되었습니다.

올바른 발달 단계에 도달하기 위해 계속 노화해야 하는 PrepU는 젖은 종이 타월과 함께 페트리 접시에 담가거나 깨끗한 음식 바이알에 담글 수 있습니다. 이렇게 하면 이미징을 위한 충분한 습도와 적절한 발달이 보장됩니다. PrepU는 800미크론 직경의 유리 모세관 내부에 부착해야 합니다.

동공의 뒤쪽 끝을 슈퍼 접착제로 칠하고, 파리의 앞쪽 뒤쪽 접근이 튜브와 평행이 되도록 접착된 pre pupa의 표면을 튜브 안으로 향하게 합니다. 동물의 앞쪽 부분은 모세 혈관 위로 돌출되어 있습니다. 이제 모세관 튜브가 현미경의 회전 스테이지에 고정되었습니다.

수직 위치에서 튜브의 회전 축이 이미징 CCD의 픽셀 열과 평행이 되도록 회전 스테이지의 틸팅 축을 조정합니다. 파리의 위치를 조정한 상태에서 이미징을 진행합니다. 이 예에서, 형광 타액선을 가진 동물은 EAG 4와 U-A-S-G-F-P 스톡의 교차점에서 생성 될 수 있습니다.

우리는 장착된 프리 퓨타로 시작하여 여기 빔으로 프리 퓨타를 비추고 GFP 형광 신호를 수집합니다. 트랜스 조명에서 PrepU를 수직 축을 따라 360도 회전하고 트랜스 조명 이미지를 획득합니다. 각 이미지는 10도 회전에 해당합니다.

총 획득 시간은 형광의 양과 여기 빔의 강도에 따라 달라집니다. 일반적인 시간은 1분 정도입니다. 이 예에서는 날개 가상 디스크에서 GFP를 발현하는 DSO 번데기가 이미지화됩니다.

이 번데기는 Aus GAL 4와 U-A-S-G-F-P 스톡의 교배된 바이알에서 수집할 수 있습니다. 프리 번데기는 앞에서 설명한 대로 장착됩니다. 그러나 이 실험의 이미징 시간은 약 8시간이므로 동물의 탈수 및 죽음을 방지하기 위해 환경을 습하고 실온으로 유지하는 것이 중요합니다.여기빔 위에 셔터를 배치하여 관심 조직에서 꽃무늬 4점의 담금질을 방지하고 동물이 이전과 같이 레이저 빔에 의해 연소되지 않도록 합니다. 여기 빔으로 조명을 비추고 트랜스 조명으로 GFP 형광 신호를 수집합니다.

프리 번데기는 수직 축을 따라 완전히 회전합니다. 데이터를 수집하는 동안 회전은 1분밖에 걸리지 않으며 다른 시간 간격으로 반복됩니다. 개발 중에 날개의 타임 랩스 시리즈를 생성하기 위해 시간당 100개의 이미지 비율로 최소 6시간 동안 데이터를 수집할 수 있습니다.

이 셔터로 총 광 노출을 제어하여 손상이나 광 표백을 방지하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 PrepU 단계와 동공 머리 혐오 사이에서 획득한 이미지를 보여줍니다. 3차원 이미지를 재구성할 때 고려해야 할 강한 전방 산란이 있으며, 이는 확산으로 근사화할 수 없습니다.

따라서 빛 전파의 전방 산란 모델을 재구성하기 위해서는 단순화를 위해 흡수를 소홀히 해야 합니다. 산란의 양은 실험적으로 테스트됩니다. 이를 위해 표준화된 형광을 가진 이물질을 비형광 백색 1118 프리 번데기에 삽입한 다음 스캔하여 100미크론 실리카 모세관에 PS 5.5 형광 염료를 채우는 것으로 시작하는 순방향 모델 데이터를 생성합니다.

모세관 작용을 사용하여 모세관 튜브를 전방 축에 대해 45도 각도로 번데기 안으로 밀어 넣고 PrepU를 모세관 튜브에 장착한 다음 앞서 설명한 대로 회전 스테이지에 적절하게 배치합니다. 이제 낮은 개구수 렌즈로 여기 레이저 빔으로 pre pupa를 비추고 pre pupa의 형광 트랜스 조명 이미지를 수집합니다. 앞서 설명한 바와 같이 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 데이터를 명시적 이론적 순방향 모델에 맞춥니다.재구성 프로세스를 용이하게 하기 위해 전방 산란 영역을 설명하고 실험 데이터를 적합하기 때문에 수송 방정식에 대한 확고한 e 근사치가 선택됩니다.

올바른 순방향 모델을 결정하면 타액선을 재구성하고 타임랩스 단층 촬영 재구성을 얻을 수 있습니다. 여유 공간 단층 촬영을 사용할 계획인 경우 인덱스 일치를 위한 구성 알고리즘도 설정할 수 있습니다. 먼저, 발달 초기에 타액선의 3D 재구성을 보여줍니다.

비교를 위해 타액선의 조직학적 염색은 재건이 조직학과 잘 연관되어 있음을 보여줍니다. 날개 상상 원반의 발달에 대한 이 타임랩스 영상은 하나의 살아있는 표본에서 획득되었습니다. 비교를 위해 동시에 날개 디스크의 조직학적 염색은 재건이 조직학과 상관관계가 있음을 보여줍니다.

우리는 방금 oph 내에서 in vivo 및 시간이 지남에 따라 3차원 구조를 이미지화하는 시스템을 구축하는 방법을 보여드렸습니다. 이를 통해 Drosophila의 형태 형성을 따르고 6 시간 동안 연속적으로 날개의 발달을 추적 할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 초파리 내에서 광 전파를 위한 올바른 순방향 모델을 선택하는 것이 중요합니다.

이 방법은 조직학적 기술과 함께 사용하여 안과 동공 단계에서 장기 발달에 빛을 비출 수 있으며 유사한 크기의 다른 유기체에 대한 연구를 위해 수정할 수 있습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.