Name: 에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster의 살아있는 유충에서 mesoscopic 형광 단층촬영을 이용한 3D 장기 재구성 방법을. 다중 투영 조명과 광자 수송 모델을 활용하여 기존 형광 현미경의 한계를 극복하고 발달 중인 장기의 형태 발생을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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C. Vinegoni 건강 (NIH) 부여 1 RO1 - EB006432 국립 연구소의 지원을 인정한다.

본 실험에 사용된 Drosophila melanogaster의 주식은 다음과 같습니다 <ul style="list-style-type:none;"><li> elav - Gal4 (FBti0002575) </li><li> AP - Gal4md544 (FBal0051787) </li><li> UAS - srcEGFP (FBti0013990) </li><li> w1118 (FBal0018186) </li></ul> 모든 실험은 UAS - Gal4 시스템은 관심의 조직 (즉 침샘이나 날개 디스크)에 overexpress GFP로 사용되었습니다. 보다 구체적으로, 적절한 Gal4와 유전자 변형 여성 파리는 UAS - EGFP 형질 전환 메이트로 교차했다. 십자가는 humidified 인큐베이터에서 25 ° C에서 reared했다. pupae가 튜브를 (약 5-6일 십자가의 개시 후) 채우기 시작할 때, 그들은 흰색 prepupal 단계 (번데기 형성 후 0-1 시간)에서 GFP 형광을 위해 선택하고 tomography 이미징에 대한 수집했다. <ol><li> 25 적절한 교차하고 후방을 설정 ° C </li><li> 5~6일 십자가의 개시 후 이미지에 대한 형광 자손을 선택합니다. 유리병의 측면에서 흰색 prepupae의 부드러운 제거 젖은 페인트를 사용하십시오. </li><li> 물 또는 PBS의 드롭 prepupae을 넣어 음식 입자 및 pupal 사건을 커버하고 표본이 autofluorescent 만드는 접착제를 제거하기 위해 페트리 접시에 위치. 페인트 브러쉬로 부드럽게 닦아주십시오. pupae의 고령화가 필요한 경우 장소는 젖은 종이 타월 (습기 챔버) 또는 비행 음식 깨끗한 유리병의 측면에서 배양 접시에있는 흰색 prepupae을 선택했습니다. 이것은 동물의 적절한 개발을 허용하기 위해 충분한 습도가 있는지 확인합니다. </li></ol> Drosophila 장착 <ol><li> 글루 모세관 유리관 (800 미크론 직경)에 pupal 케이스의 하단 부분 파리의 후부 / 앞쪽에 축은 튜브에 평행 방향입니다 같은. </li><li> 회전 무대에서 수직으로 모세관을 수정. </li><li> 이미징 CCD의 픽셀 컬럼에 평행으로 회전 축에 대한 순서로 회전 무대의 틸팅 축을 조정합니다. </li></ol> 결정 전달 모델 <ol><li> 모세관 유리에 번데기를 수정하고 이전에 설명된대로 마운트 </li><li> 형광 염료 (Cy5.5)와 실리카 모세관 (100 미크론, OD)를 작성 </li><li> 후부 / 앞쪽에 축에 대하여 45도에서 번데기 내부의 모세관 튜브를 삽입 </li><li> 낮은 수치 조리개 렌즈 여기 레이저 빔을 번데기를 조명. 의 수직 축을 따라 번데기를 회전 360도 이상의 형광 transillumination 이미지를 수집합니다. </li><li> 적절한 앞​​으로 모델과 실험 데이터를 맞추기 </li></ol> 이미징 침샘 <ol><li> 로 언급한 침샘에서 번데기 표현 GFP 마운트 </li><li> 여기 빔과 함께 조명하고 transillumination 년에 세로 축을 따라 번데기를 회전 360도 이상의 GFP의 형광 신호를 수집합니다. </li><li> 앞으로 모델을 이용하여 획득한 데이터를 재구성 </li></ol> 시간 경과 이미징 <ol><li> 날개 imaginal 디스크에 흰색 prepupa 표현 GFP 마운트 </li><li> 번데기의 탈수를 피하기 위해 이미징 환경을 습기와 실온에서 보관. </li><li> 지속적인 조명을 피하기 위해 셔터를 배치 </li><li> 여기 빔과 함께 조명하고 transillumination 년에 세로 축을 따라 번데기를 회전 360도 이상의 GFP의 형광 신호를 수집합니다. </li><li> 앞으로 모델을 이용하여 획득한 데이터를 재구성. </li></ol> 조직학 <ol><li> 1X PBS의 침샘의 CNS / 눈 디스크를 해부하다. </li><li> 4 % 포름 알데히드, 실온에서 20 분 대한 1X PEM (100mM 파이프, 1mM EGTA, 1mM MgCl 2) 조직을 수정. </li><li> dapi (벡터)로 Vectashield에 고정하고 마운트를 제거 </li><li> 형광 현미경으로 이미지. </li></ol> 시간 경과 조직학 <ol><li> 흰색 prepupae를 수집하고 습기가 실내에서 그들을 무대. </li><li> 다른 발달 단계에서 pupae 수집 </li><li> 비열한 고정하기 전에 좋은 바늘 (곤충 핀 000, FST)를 두 번 pupal 케이스 (번데기 형성 후 0 시간). </li><li> 부드러운 교반과 함께 실온에서 6-8 시간 8 %의 포름 알데히드, 1X PEM에서 pupae을 수정. </li><li> 고정의 제거 및 1X PBS로 rinsing이 두 가지에 날카로운 칼날과 고정 번데기를 잘라 후 A / P의 축에 직각; </li><li> 잠수함 이미징을위한 coverglass 슬라이드에 dapi (벡터)와 마운트와 Vectashield의 ​​두 조각 (랩 - 테크). </li><li> 형광 공촛점 현미경으로 이미지를 획득. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1510/1510fig1thumb.jpg" alt="그림 1" border="0" /> 그림 1. 주시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1510/1510fig1.jpg">여기를 클릭하십시오</a> 알을 볼그림 1의 arger 버전.

<ol><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+and+listening+to+light%3A+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

pupal 가지 경우에 - 생체내의 reconstructions 및 D.의 GFP - 표현 침샘 해당 조직학 (블루, dapi의 얼룩, 녹색, GFP 형광)로 melanogaster prepupa (스케일 바, 500 미크론)은 (A) 그림 1에 표시됩니다. D.의 시간 경과 시리즈 이미지 melanogaster 날개 imaginal 디스크는 Fig.1 (B)에 표시됩니다. 이미지는 네 가지 시간 포인트 (0,3.0, 3.5, 및 6.5 시간)에서 한 라이브 표본에서 얻은 수 있습니다. 번데기의 등 부분의 전망에 대해서는 0도에서 첫 번째 열 한 투영에 표시됩니다. 두 번째 열에있는 reconstructions은 붉은 선으로 표시된 부분에 해당한다. 마지막으로, 조직학와 비교 세 번째 열을 표시됩니다. 분명히, histological 준비는 단층 reconstructions과 잘 상관 관계. Drosophila의 pupal 케이스와 GFP - 표현...

에 대한 mesoscopic 형광 tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 drosophila</em

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

개발 기관 형성뿐만 아니라 질병의 progession 및 치료를 떠올리면 자주 많이 광학 그대로 살아있는 생물의 분자 및 기능적 변화를 심문할 수있는 능력에 의존합니다. 대부분의 기존 광학 이미징 방법은 현대적인 광학 현미경의 침투 한계 (0.5 - 1mm)과 광학 macroscopy의 확산 부과 한계 사이의 거짓말 차원에서 영상에 대한 불충 분한 아르 (&gt; 1cm) [1]. 따라서, 많은 중요한 모델 생물은, 예를 들어 곤충, 동물 배아 또는 작은 동물 사지는, - 생체내 광학 이미징을 위해 액세스할 남아있다. 나노미터 해상도 광학 영상 방법의 개발에 대한 관심이 증가하고 있지만, 이미징 침투 깊이를 향상 많은 성공적인 노력이되지 않았습니다. 현미경 제한 이외에 - 생체내 이미징을 수행하는 능력은 조직에있는 광자 산란과 관련된 어려움을 만난 사실이다. 예를 들어, 이미지를 전체 배아 최근 활동 [2,3] 비산에서 선택을 취소 시편의 특수 화학 처리, 오직 사후 영상을 위해 적합하게 절차를 필요로합니다. 이 방법은 그러나 일반적으로 특히 발달 생물학 및 약물 발견의 두 광자 또는 공촛점 현미경에 의해 허용하는 것보다 큰 이미지 표본에 대한 필요성을 증거. 우리는 Mesoscopic 형광 Tomography라는 새로운 광학 이미징 기술을 개발 [4], 1mm - 5mm의 크기에 비침습에서 - 생체내 이미징에 적합한하는. 침투 깊이에 대한 메소드 교환 해상도지만,이 전례없는 단층 이미징 성능을 제공하며, 그것은의 형광 - 진화 이미지 수있는 능력을 imparting하여 발달 생물 관찰에 새로운 차원의 (그리고 생물 학적 연구의 가능성이 다른 영역)로 시간을 추가 개발되었습니다 시간이 지남에 따라 응답을 태그. 따라서 그것은 유전자 변이 또는 외부 자극에 대한 형태학의 또는 기능 종속성의 연구를 가속 수 있으며, 중요한 것은 같은 개발 유기체의 길이 시간 저속 시각화함으로써 개발 또는 조직 기능의 전체 사진을 캡처할 수 있습니다. 기술은 수정된 실험실 현미경 및 멀티 프로젝션은 조명 360도 계획에서 데이터를 수집을 활용합니다. 그것은 mesoscopic 범위에 적합한 현실 반전 체계를 구축하기 위해 기하학적 광학 원칙과 결합 광자 수송 방정식의 Fokker - 플랭크 솔루션에 페르미의 단순화를 적용합니다. 이것은 크기가 몇 mm에 샘플이 아닌 투명한 입체 구조에 - 생체내 전체 - 바디 시각화를 수 있습니다. 우리는 영상 입체적으로 기술의 인 - 생체내 성능을 보여준 - 생체내에서 연속으로 여섯 시간 동안 실시간으로 불투명 Drosophila pupae에있는 날개의 morphogenesis에 따라 Drosophila 조직 개발을 구조.

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를 입증<em&gt; Drosophila melanogaster.</em

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

발달 중인 장기의 형성뿐만 아니라 질병의 진행 및 치료를 시각화하는 것은 흔히 광학적으로 조사하는 능력에 크게 의존하며...

Drosophila melanogaster 내에서 발달 중인 기관의 재구성을 수행하기 위해, 번데기 내부에서의 빛 전파를 가장 잘 설명하는 순방향 모델을 결정해야 합니다. 먼저 흰색 전번데기를 선택하고, 번데기의 전후축이 모세관과 평행하게 놓이도록 모세관 끝에 접착합니다. 소형 모세관에 형광 염료를 채운 후 이를 번데기 케이스에 삽입합니다.축 조절을 신중하게 수행한 후, 번데기를 360도 회전시킵니다. 다양한 각도에서 이미지를 획득합니다. 획득한 형광 투과 조명 데이터는 기관 발달을 이미징하는 데 사용할 순방향 모델을 결정하는 데 사용됩니다.안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 매사추세츠 종합병원 보조 생물학 센터의 Claudia입니다. 저는 하버드 의과대학 Paramount Lab의 Ula Petou입니다. 그리고 저는 뮌헨 공과대학교 및 Heliman Center Munich의 생물 및 의료 영상 연구소의 Daniel Rozanski입니다. 오늘은 Oph Melano Casta의 전신 3차원 재구성 절차를 보여드리겠습니다.저희 연구실에서는 동공 상태 동안 기관의 발달을 in vivo로 시각화하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작해 보겠습니다. 시작하기 전에, 광학 투사 단층 촬영(optical projection tomography)의 일부 기술적 측면이 여기보다 더 자세히 설명된, 이 영상 이전에 시청해야 할 동반 영상이 없음을 참고하시기 바랍니다.또한, 다른 영상에서는 더 큰 동물의 준비된 조직 또는 장기 영상을 촬영하는 방법을 설명합니다. 이 영상에서 다루는 모든 실험에는 초파리 트랜스젠이 사용됩니다. 이들은 침샘에서 발현되는 EL A gal four, 성체 날개와 흉부의 유충 전구 조직에서 발현되는 apteris gal four, 그리고 형광 단백질을 생성하는 트랜스젠입니다.U-A-S-G-F-P 및 white 1118의 gal four 반응에 따라, UAS 트랜스진을 보유한 비형광 대조군 수컷을 GAL four 트랜스진을 보유한 처녀 암컷과 교배하여 조직 특이적 GFP 발현을 유도합니다. GFP 교배는 8~10마리의 처녀 암컷과 수컷을 베이커 효모가 소량 첨가된 표준 초파리 배지에 넣어 설정합니다. 배양 병은 습도가 조절되는 인큐베이터 내에서 25 °C, 12시간 명암 주기 조건으로 보관합니다.교배를 시작하고 이틀 후, 부모 개체들을 새 바이알로 옮기며, 5~6일 후에 PUI가 PrepU가 있는 바

mesoscopic-fluorescence-tomography-for-vivo-imaging-developing

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

출처: Hellerman, M. B.,  et al.  Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015){{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

토마토 / GFP-FLP / FRT 방법은 초파리 생활에 모자이크 광 수용체 세포를 시각화하는 것을 포함한다. 그것은 일 또는 몇 주 동안 망막에있는 각각의 광 수용체 세포의 운명을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 망막 변성 및 신경 퇴행성 질환 또는 광 수용체 세포 개발 연구에 이상적입니다.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

이 논문은 직접 번데기를 통해 이미지 세포 행동에 빠른 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그대로 번데기 경우를 떠남으로서,이 방법은 직접 공부하기 어려운 초파리 개발의 단계에서 관찰하고 역동적 인 세포 프로세스의 측정을 할 수 있습니다.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

마이크로컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 개발 단계에서 온전한 드로소필라 멜라노가스터를 시각화할 수 있는 프로토콜이 제시된다.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

학습하세요 Drosophila melanogaster의 살아있는 유충에서 mesoscopic 형광 단층촬영을 이용한 3D 장기 재구성 방법을. 다중 투영 조명과 광자 수송 모델을 활용하여 기존 형광 현미경의 한계를 극복하고 발달 중인 장기의 형태 발생을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila

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