여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역분석법

바닥에 필터가 있는 멀티웰 플레이트를 가져 가십시오.

다른 사이토카인을 포함하는 테스트 샘플을 추가합니다.

크기와 내부 형광 강도에 따라 구별되는 다양한 마이크로스피어 세트를 추가합니다.

각 세트는 특정 사이토카인을 표적으로 하는 항체에 접합됩니다.

교반하면서 어둠 속에서 플레이트를 배양합니다.

항체는 표적 사이토카인에 결합하여 마이크로스피어에 고정합니다.

진공을 적용하여 결합되지 않은 사이토카인을 제거합니다. 마이크로스피어 결합 사이토카인은 막의 더 작은 기공 크기로 인해 유지됩니다.

마이크로스피어 결합 사이토카인에 결합하는 비오틴 접합 검출 항체 칵테일을 추가합니다.

형광 리포터 접합 스트렙타비딘을 첨가하고 교반하면서 어두운 곳에서 배양합니다. 스트렙타비딘은 비오틴에 결합하여 마이크로스피어 복합체에 리포터를 고정시킵니다.

결합되지 않은 분자를 제거하고 마이크로스피어를 재현탁합니다.

유세포 분석을 사용하여 마이크로스피어의 크기와 내부 형광을 결정하여 결합된 사이토카인을 식별합니다.

특정 사이토카인의 양을 결정하려면 리포터의 형광 강도를 측정하십시오.

분석을 수행하려면 사용하기 전에 모든 시약을 실온으로 데우십시오.

이 데모에서는 폴리프로필렌 필터 플레이트가 사용됩니다. 비드가 손실되지 않도록 세척 단계를 포함한 전체 분석 절차 동안 플레이트를 똑바로 세우는 것이 절대적으로 중요합니다.

각 웰에 100마이크로리터의 1x 세척 완충액을 첨가하여 여과지를 미리 적시고 플레이트를 실온에서 1분 동안 그대로 둡니다. 진공 매니폴드를 사용하여 완충액 부피를 제거합니다. 깨끗한 종이 타월 더미에 플레이트를 눌러 플레이트 바닥에서 과도한 세척 완충액을 닦아냅니다. 그런 다음 거꾸로 된 플레이트 커버 위에 플레이트를 놓습니다.

세포 배양 상청액 샘플의 경우 모든 웰에 25마이크로리터의 분석 완충액을 추가합니다. 표준 웰에 각 표준물질 25마이크로리터를 추가합니다. 마지막으로 각 샘플 25마이크로리터를 샘플 웰에 추가합니다. 혼합된 구슬을 30초 동안 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 혼합된 구슬 25마이크로리터를 각 웰에 넣고 구슬이 가라앉지 않도록 구슬 병을 간차적으로 흔듭니다.

플레이트 실러로 플레이트를 밀봉합니다. 밀봉되면 거꾸로 된 플레이트 커버를 포함한 플레이트 전체를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 고정한 후 실온에서 약 500RPM으로 2시간 동안 흔듭니다. 반전시키지 않고 플레이트를 진공 매니폴드에 놓고 이전과 같이 진공을 적용합니다. 그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 1x 세척 완충액을 추가합니다.

진공 여과로 분석 플레이트 웰의 내용물을 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복하기 전에 흡수 패드나 종이 타월로 플레이트 바닥에서 과도한 세척 완충액을 닦아냅니다. 다음으로, 각 웰에 25마이크로리터의 검출 항체를 추가합니다. 새 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉한 후 거꾸로 된 플레이트 커버를 포함한 플레이트 전체를 알루미늄 호일로 감쌉니다.

플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 실온에서 약 500RPM으로 1시간 동안 흔듭니다. 진공 청소기로 청소하지 않고 25마이크로리터의 스트렙타비딘 피코에리트린 시약을 각 웰에 직접 추가합니다. 이전과 같이 접시를 밀봉하고 포장합니다. 그러면. 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 실온에서 약 500RPM으로 30분 동안 흔듭니다.

진공 여과 단계를 두 번 반복한 후 각 웰에 200마이크로리터의 1x 세척 완충액을 추가합니다. 플레이트 셰이커에 비드를 1분 동안 재현탁합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 유세포 분석기에서 샘플을 읽기 위해 필터 플레이트에서 FACS 튜브로 샘플을 옮깁니다.