Cytokine Profiling Immunoassay Cytometric 구슬-기반 플랫폼을 사용 하 여 자극된 마우스 Splenocytes의 다중화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 멀티플렉스 비드 기반 면역분석법과 유세포분석기를 사용하여 자극된 마우스 비장세포에서 수집한 조직 배양 상등액에서 여러 사이토카인 표적을 동시에 정량화하는 것입니다. 이 방법은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다., 예를 들어 특정 질병 상태의 맥락에서 면역 반응을 조율하는 고유한 사이토카인 프로필은 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 기존 ELISA 형식보다 훨씬 적은 시료를 사용하여 여러 환형을 동시에 정량화하는 동시에 비특이적 결합을 줄일 수 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 사람은 제품 개발 팀의 연구원인 Nicholas Johnsen입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 생물학적 시료 전처리로 이 절차를 시작합니다. 미리 혼합된 항체 고정 비드를 준비하려면 미리 혼합된 비드 병을 실온의 초음파 처리기 수조에서 1분 동안 초음파 처리합니다.

그런 다음 사용하기 전에 30초 동안 소용돌이치십시오. 초음파 세척기를 사용할 수 없는 경우 소용돌이 시간을 1분으로 늘리십시오. 표준 제처리의 경우 250마이크로리터의 분석 버퍼를 추가하여 동결건조된 Mouse Th Cytokine Standard 칵테일을 재구성합니다.

잠시 볼텍싱하여 혼합하고 바이알을 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다. 표준 칵테일을 C7이라고 표시된 폴리프로필렌 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이것은 최고 표준으로 사용됩니다. 6개의 폴리프로필렌 미세 원심분리기 튜브에 C1에서 C6까지 레이블을 지정합니다. 이러한 각 튜브에 75마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 최고 표준인 C7의 25마이크로리터를 C6 튜브로 옮기고 볼텍싱으로 잘 혼합합니다. 이것이 C6 표준이 될 것입니다. 각 튜브에 대해 새로운 피펫 팁을 사용하여 다음으로 가장 낮은 표준물질 튜브에 있는 75 마이크로리터의 분석 버퍼에 이전 표준물질 25 마이크로리터를 추가함으로써 연속 1-4 희석을 계속 수행합니다.

와류로 추가할 때마다 따르십시오. 분석 버퍼를 밀리리터당 0 피코그램 표준으로 사용합니다. 분석을 수행하려면 사용하기 전에 모든 시약을 실온으로 데우십시오.

이 데모에서는 폴리프로필렌 필터 플레이트가 사용됩니다. 비드 손실을 방지하기 위해 세척 단계를 포함한 전체 분석 절차 동안 플레이트를 똑바로 세우는 것이 절대적으로 중요합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 1X 세척 버퍼를 추가하여 여과지를 미리 적시고 플레이트를 실온에서 1분 동안 그대로 둡니다.

진공 매니폴드를 사용하여 버퍼 부피를 제거합니다. 깨끗한 종이 타월 더미에 접시를 눌러 접시 바닥에서 여분의 세탁 버퍼를 닦아냅니다. 그런 다음 거꾸로 된 플레이트 덮개 위에 플레이트를 놓습니다.

세포 배양 상등액 샘플의 경우 모든 웰에 25마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다. 각 표준물질의 25마이크로리터를 표준 웰에 추가합니다. 마지막으로 각 샘플 25마이크로리터를 샘플 웰에 추가합니다.

30초 동안 혼합된 구슬을 소용돌이치십시오. 그런 다음 25마이크로리터의 혼합 비드를 각 웰에 넣고 비드 침전을 방지하기 위해 비드 병을 간헐적으로 흔듭니다. 플레이트 씰러로 플레이트를 밀봉하십시오.

밀봉되면 거꾸로 된 플레이트 커버를 포함한 전체 플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 접시 셰이커에 접시를 놓고 고정한 다음 실온에서 약 500RPM으로 2시간 동안 흔듭니다. 뒤집지 않고 진공 매니폴드에 플레이트를 놓고 이전과 같이 진공을 적용합니다.

그런 다음 각 웰에 200마이크로리터의 1X 세척 버퍼를 추가합니다. 진공 여과로 분석 플레이트 웰의 내용물을 제거합니다. 이 단계를 한 번 더 반복하기 전에 접시 바닥의 여분의 세탁 버퍼를 흡수 패드나 종이 타월로 닦아내십시오.

다음으로, 각 웰에 25마이크로리터의 검출 항체를 추가합니다. 새 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉한 후 거꾸로 된 플레이트 커버를 포함한 전체 플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 접시 셰이커에 접시를 놓고 실온에서 1시간 동안 약 500RPM으로 흔듭니다.

진공 청소기로 청소하지 않고 25마이크로리터의 스트렙타비딘 피코에리트린 시약을 각 웰에 직접 첨가합니다. 이전과 같이 접시를 밀봉하고 포장합니다. 그런 다음 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 실온에서 약 500분 동안 약 30RPM으로 흔듭니다.

진공 여과 단계를 두 번 반복한 후 각 웰에 200마이크로리터의 1X 세척 버퍼를 추가합니다. 플레이트 셰이커에 비드를 1분 동안 다시 매달아 놓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 필터 플레이트에서 FACS 튜브로 샘플을 옮겨 유세포 분석기에서 샘플을 판독합니다.

기기와 함께 제공된 제조업체의 지침에 따라 유세포 분석기 및 수집 소프트웨어를 시작합니다. X축에 전방 산점도가 있고 Y축에 측면 산점도가 있는 점도표를 만듭니다. 전방 산란 및 측면 산란을 선형 모드로 설정합니다.

키트에 포함된 원시 비드 바이알을 30초 동안 소용돌이하여 비드를 다시 매달립니다. 400마이크로리터의 원료 비드를 새 FACS 튜브로 옮깁니다. 유세포분석기 유속을 낮음으로 설정합니다.

원시 비드를 실행하고, 순방향 산란 및 측면 산란에 대한 게인과 전압을 신중하게 조정하여 이러한 비드의 두 크기 모집단이 눈에 띄게 분리되고 쉽게 게이트할 수 있도록 합니다. 원치 않는 이벤트를 제외하도록 전방 산란 임계값을 조정합니다. 전방 산점도 대 측면 산점도 플롯에서 모든 비드 모집단을 포함하는 게이트를 그립니다.

전방 산점도 대 측면 산점도 플롯의 게이트 비드 모집단을 두 번째 점도표에 표시하고, X축은 PE를, Y축은 APC를 사용합니다. 모든 비드 모집단에 대한 APC 신호가 10에서 5, 000 사이의 중앙값 형광 강도(MFI)를 갖도록 APC 형광 채널의 PMT 전압을 조정합니다. 다음으로, PE 설정 비드의 바이알을 30초 동안 볼링하여 비드를 다시 현탁시킵니다.

다시 현탁된 PE 비드 400마이크로리터를 새 FACS 튜브로 옮깁니다. 유세포분석기의 raw beads tube를 PE beads tube로 교체합니다. PE 비드의 MFI가 PE 비드 바이알에 나열된 로트별 범위 사이에 놓이도록 PE 형광 채널 설정에 대한 광전자 증배관 전압을 조정합니다.

데이터 수집을 수행하려면 수집할 bead events의 수를 양극액당 약 300개로 설정합니다. 분석하기 전에 각 샘플을 5초 동안 소용돌이칩니다. 그런 다음 샘플을 읽습니다.

샘플을 판독할 때 먼저 유세포 분석기를 설정 모드로 설정하고 비드 집단이 안정화될 때까지 기다렸다가 수집 모드로 전환하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 수행하기 전에 총 이벤트가 아닌 제어된 이벤트만 내보냅니다. 표적 양극액에 대한 대표적인 표준 곡선은 마우스 T helper cytokine panel을 사용하여 생성되었습니다.

적절하게 실행된 분석은 여기에 표시된 것처럼 넓은 동적 범위의 곡선을 보여줍니다. 표준 곡선은 분석을 수행할 때마다 실행해야 합니다. 마우스 비장세포를 48시간 동안 다양한 조건에서 배양했습니다.

배양 상등액을 수집한 후 마우스 T 헬퍼 사이토카인 패널을 사용하여 13개 표적의 농도를 정량화했습니다. 자극 조건에 대한 반응으로 차등적인 사이토카인 발현 프로파일이 명확하게 보입니다. 이 기술의 실험실 벤치워크는 일단 숙달되면 적절하게 수행되면 5시간 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

데이터 수집 및 다운스트림 분석 시간은 샘플 수에 따라 달라집니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 프로토콜을 사용하는 방법, 세포 분석, 비드 기반 면역 분석을 사용하여 생물학적 샘플의 양극액 농도를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기에는 시약 준비, 배양 단계 및 데이터 수집을 위한 유세포 분석기 설정이 포함됩니다.