reference reagent를 사용하여 단클론 항체 안전성 예측을 위한 cytokine 방출 분석의 견고성 확인

신약의 안전성 검사는 매우 중요하며, 이 프로토콜은 검증된 표준을 사용하여 CRS 플랫폼의 재현성, 견고성 및 잠재적 한계를 평가하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 11개의 서로 다른 실험실에서 이러한 시약으로 검증되었으며 유사한 반응 패턴이 관찰된 국제 협력 연구에서 검증되어 조화 및 재현성에 대한 노력을 개선했습니다. 이 기술의 응용은 새로운 치료용 항체의 CRS 위험 테스트를 개선하는 방향으로 확장되며, 잠재적인 부작용의 임상 관리를 준비하는 데도 도움이 될 것입니다.

이 작업은 재현성과 조화를 개선하기 위한 것이며 시각적 시연은 재현 가능성을 높입니다. 먼저 기준 시약 앰플의 내용물을 1ml의 멸균 증류수에 재구성하고 5-10분 동안 재수화합니다. 그런 다음 각 항체 용액을 멸균 캡이 있는 튜브로 옮기기 전에 적절하게 혼합합니다.

다음으로, 재구성된 각 항체를 희석하고 멸균 PBS에서 밀리리터당 10마이크로그램으로 항체를 테스트합니다. 멸균되고 TC 처리되지 않은 U-바닥 폴리프로필렌 96웰 마이크로타이터 플레이트를 가져다가 원하는 희석 항체 용액 100마이크로리터를 플레이트의 지정된 웰에 추가합니다. 그런 다음 고체상 분석을 수행하기 전에 섭씨 4도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

최소 30ml의 말초 전혈을 헤파린 처리된 튜브에 모은 후 혈액 샘플과 헤파린나트륨이 적절하게 혼합되도록 여러 번 뒤집습니다. 나중에 수성 단계 전혈 분석에서 사용하기 위해 15ml의 전혈 샘플을 별도의 튜브에 따로 보관하십시오. PBS 또는 혈청이 없는 RPMI 1640 배지를 동일한 부피로 첨가하여 나머지 15ml의 전혈을 희석합니다.

희석된 혈액을 50ml 튜브에 15ml의 밀도 구배 매체 위에 부드럽게 겹겹이 쌓습니다. 브레이크가 없는 스윙 아웃 로터를 사용하여 튜브를 원심분리하고 500G에서 가속을 줄이고 실온에서 20분 동안 혈액을 다른 구성 요소로 분리합니다. 원심분리 후, 밀도 구배는 혈장의 최상층으로 분리되고, 그 다음에는 PBMC를 포함하는 얇은 층의 담황색 코트와 적혈구 및 호중구 및 호산구를 포함한 다형성 핵 과립구를 포함하는 하단 층이 분리됩니다.

상부 플라즈마 층을 조심스럽게 제거한 다음 다음 층을 제거하여 PBMC를 수확합니다. 세척을 위해 수확한 버피 코트를 10ml의 PBS 또는 무혈청 RPMI 1640 배지에 재현탁합니다. 튜브를 500G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.

상층액을 버리고 다시 세탁을 반복하십시오. 그런 다음 생성된 펠릿을 2mL의 완전한 RPMI 배지에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 PBMC 농도를 완전한 RPMI에서 밀리리터당 100만 세포로 조정합니다.

수성상 전혈 사이토카인 방출 분석의 경우, 이전에 따로 보관해 둔 전혈 샘플을 채취하여 190마이크로리터의 샘플을 96웰 U-바닥 폴리스티렌 플레이트의 웰에 추가하고, PBS에서 밀리리터당 100마이크로그램으로 사전 희석된 열처리 항체 및 참조 시약, 190마이크로리터의 전혈을 포함하는 지정된 웰에 원하는 희석된 항체 10마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 48시간 동안 배양합니다. 고체상 PBMC 사이토카인 방출 분석을 위해 이전에 준비된 코팅된 플레이트를 얻습니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 코팅된 플레이트에서 항체 용액을 버립니다. 시약 저장용기에 PBS를 채운 후 200마이크로리터의 PBS로 플레이트를 세 번 세척하여 결합되지 않은 단클론 항체를 제거합니다. 이전에 준비된 PBMC 현탁액 200마이크로리터를 각 웰에 추가합니다.

플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터에서 48시간 동안 배양합니다. 대조군 및 테스트 단클론 항체로 48시간 배양 후 400G에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 cell-conditioned medium(세포 조건화된 배지) 또는 혈장을 수집한다.

수집된 상등액 또는 혈장을 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. PBMC 고체상 분석 결과는 양성 대조군 항체가 일치하는 동형 대조군과 비교할 때 상당히 높은 수준의 사이토카인을 유도하는 것을 보여주었습니다. 또한 항-CD28 초작용제는 일치하는 동형보다 인터루킨-2 또는 IL-2 방출의 현저히 높은 배의 변화를 유도하는 반면, 항-CD3 및 항-CD52는 여전히 IL-2 발현을 유도하지만 더 낮은 배의 변화를 초래하는 것으로 관찰되었습니다.

전혈 수성상 분석에서 검출 가능한 사이토카인의 수준은 고체상 분석보다 상대적으로 낮았지만 항-CD52에 의한 자극에 대한 민감도가 더 높은 것이 특징이었습니다.