Name: 개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 초고감도 디지털 ELISA를 이용한 인간 인터페론-α 검출법을 통해 자가면역질환 및 감염에서 면역 반응을 연구하는 방법을 배우세요. 이 기술은 바이오마커 발굴에 활용됩니다.

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DD와 안산 지원은 ANR에서 인정 (프로젝트 IFNX, 아니. CE17001002)와 단일 클론 항 체를 제공 하기 위한 ImmunoQure AG. 우리 감사 브리 짓 베이더 Meunier, 나탈리 아 Bellon, 크리스틴 Bodemer, 알렉스 Belot, 이자벨 Melki, 그리고 피에르 Quartier 임상 샘플 제공. 유럽 연구 위원회를 인정 하는 안산 (GA 309449: 안산 교제), 베어링 참고 ANR-10-IAHU-01 "미래 위한 투자" 프로그램 국가 연구 기관 (프랑스)에 의해 관리 되는 국가 보조금.

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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+surface+expression+of+Fc%CE%B3+receptor+RI+%28+CD64+%29%2C+a+biomarker+reflecting+type-I+interferon+levels+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).</li>
<li>Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vesicular+Stomatitis+Virus+Replicon-Based+Bioassay+for+the+Rapid+and+Sensitive+Determination+of+Multi-Species+Type+I+Interferon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon.</a> PLoS One. 6, e25858(2011).</li>
<li>Rissin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assay+detects+serum+proteins+at+subfemtomolar+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations.</a> Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).</li>
<li>Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+array+%28Simoa%29+assay+with+optimal+antibody+pairs+for+cytokine+detection+in+human+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22R.+Soc.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples.</a> R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).</li>
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<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+enzyme-linked+immunosorbent+assays+Theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations.</a> J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).</li>
<li>Yeung, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+highly+sensitive+immunoassay+technologies+for+quantitative+measurements+of+sub-pg+%2F+mL+levels+of+cytokines+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum.</a> J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+measurements+of+tumor+necrosis+factor+%CE%B1+and+interleukin-6+in+the+plasma+of+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease.</a> J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).</li>
<li>Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Changes+of+Post-Translationally+Modified+Forms+of+CXCL10+and+Soluble+DPP4+in+HCV+Subjects+Receiving+Interferon-Free+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy.</a> PLoS One. 10, e0133236(2015).</li>
<li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DPP4+activity+in+humans+establishes+its+in+vivo+role+in+CXCL10+post-translational+modification%3A+prospective+placebo-controlled+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies.</a> EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).</li>
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<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ultrasensitive+measurement+of+amyloid-+%CE%B2+1+-+42+peptide+in+human+plasma+with+utility+for+studies+of+Alzheimer%27s+disease+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers.+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics.</a> Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).</li>
<li>Passaes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+HIV-1+p24+Assay+Detects+Single+Infected+Cells+and+Differences+in+Reservoir+Induction+by+Latency+Reversal+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents.</a> J. Virol. 91, e02296(2017).</li>
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<li>Rivnak, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully-automated%2C+six-plex+single+molecule+immunoassay+for+measuring+cytokines+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood.</a> J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Plasma+Proteome.+History%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+proteomics%22%5BJournal%5D)">The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리 개발 및 인간의 샘플 ( 표 1에 요약 된 단계)에서 IFN-α 단백질의 직접 정량화에 대 한 높은 재현성, 磁 단일 분자 배열 디지털 ELISA의 유효성 검사를 설명 합니다. 분석 결과의 개발에서 가장 중요 한 단계 중 하나는 항 체 쌍16, 속도 론 및 성공적인 분석 결과 핵심 되는 epitope 바인딩 특성의 선택입니다. 대상으로 동일한 epitope 또는 그 입체 장애를 일으킬 짝된 단일 클론 항 체의 사용을 피하기 위해 중요 하다. Polyclonal 항 체는 이러한 한계를 극복 하기 위해 탐지 항 체로 사용 될 수 있습니다. 어떤 주어진된 단계에서 원하는 감도 달성 되지 않은, 경우 추가 최적화 가능성 고려 되어야 한다. 이 대체 항 체 쌍, 매개 단백질 종류에에서 변화를 사용 하 여 포함 될 수 있습니다 (예: BSA < 카 제인), pH (6.0-8.5), 이온 강도, 버퍼링 용량 (예: NaCl 및 인산 염 농도), 캐리어 구슬, 또는 계면의 존재. 다양 한 매개 변수 절약 최적화 된 단일 분자 배열 분석 결과 개발할 때. 그러나, 전반적으로, 높은 신호: 배경 비율 및 최소한의 Lod를 주는 조건이 선호 하는 것 ( 그림 1, 그림 2및 그림 3참조).
특이성에 관한 IFN-α 분석 결과 다른 IFNs에 대 한 교차 반응 없음 테스트 (β, γ, λ1, λ2, ω) 보였다 (그림 4a)와 모든 13 IFN-α 하위 (그림 4b) 탐지 가능 했다. 그러나, 분석 결과 IFN-α2 하위 형식, (그림 4b 및 보충 표 4)에 대 한 낮은 선호도 보였다. 흥미롭게도, IFN-α2 (a, b의 c)의 다른 클래스에 대 한 서로 다른 감도 또한 관찰 되었다, 고유 제조 절차 또는 다른 아미노산 시퀀스를 수 있는 IFN-α2 하위 했다 다른 상업적으로 공급 업체입니다. 이 유일한 예외와 함께 모든 IFN-α 종 매우 비슷한 응답 했다. 분석 결과의 특이성은 안티-IFN-α (그림 6 및 보충 표 6) 신호를 폐지 한 복제와 샘플의 전처리에 의해 입증 되었습니다.
이 기술의 주요 장점 중 하나입니다 관심의 모든 분석 대상된16수 잠재적으로. 또한, 다른 생물 표본 테스트할 수 있습니다, 혈 청, 플라스마, 중추 신 경계, 세포 lysates, 문화 supernatants31 심지어 숨을32등. 일반적으로, 플라즈마의 1:3 희석 잠재적인 단일 분자 배열 분석기의 막힘을 피하기 위해 수행 됩니다. 그러나, 관심의 분석 관련 생물학 견본에서 매우 낮은 농도에서 존재 될 수 있고 샘플의 높은 농도 (분석 감도)에 따라 필요한33수 있습니다. 좋은 감도34유지 하면서 멀티플렉싱 가능성이 있지만, 그것은 더 많은 도전 과정 6 단백질 같은 실험에서 아직 수35개발 보다 큰 측정 분석 실험.
감지 하 여 cytokines와 같은 낮은 농도에 다른 생물학 관련 단백질 계량 능력 응용 프로그램33,36의 완전히 새로운 범위를 연다. 그것은 잘 알려진 수많은 단백질 인 지금까지 최고의 ELISAs37의 검출 한계 이하로 매우 낮은 농도 에서도 그들의 효과 발휘. 다른 immunoassay 기술을 기존의 ELISA19이점을 제공, 제시 여기 단일 분자 배열 디지털 ELISA는 낮은 농도에서 cytokines의 磁 탐지에 대 한 재현 가능 하 고 강력한 플랫폼 인간의 샘플입니다. 따라서,이 기술은 바이오 마커 발견과 다양 한 질병의 향상 된 환자 관리에 대 한 엄청난 잠재력을 제공합니다.

유형 I IFNs는 항 바이러스 면역 응답을 꾸미고 있는 중앙 역할 cytokines의 가족. 그들은 처음 발견 되었다이 삭과 Lindenmann 60 여 년 전1,2 , 그것은 지금 polypeptides의이 다른 유형의 가족 14 다른 서브 클래스 (13 IFN-α 하위 및 1 IFN-β) 구성 알려져. 유형과 유형 I IFNs는 바이러스 성 감염의 허가에 필수적인 하지만 또한 다양 한 인간의 질병 상태, 자가 면역 질환 반성 루 푸 스 (SLE), 청소년 dermatomyositis (JDM)를 포함 하 여의 병 리에 연루 되어 내가 interferonopathies 구성 유형에서 IFN 유도 신호 나 병 리3,,45,,67에 결과.
공부 유형 I IFN 단백질 수준의 생물 학적 샘플에 도전 하고있다 그것의 초기 식별 이후는 "방해 물질"1,2. 현재, 샌드위치 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) IFN-α 단백질의 검출에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 이다. 불구 하 고 특정, 간단 하 고 빠른, 종류와 같은 중요 한 한계를 제시 나 IFN ELISAs 감도 제한. 또한, 모든 IFN-α의 측정 자신의 감지 능력 및 감도 여러 분석 실험의 사용을 해야합니다. 상업적인 ELISAs IFN-α의 다른 하위를 검색 하는 동안, 그들의 감도 제한 됩니다 (1.95 pg/mL, 12.5 pg/mL, 및 12.5 pg/mL, 각각)는 종종 생물학 견본에서 IFN-α 단백질을 검출 하기 충분 하지 않습니다. 이 제한을 극복 하기 위해 분석 척도 개발 되었습니다 몇 가지 생물 학적 프록시 유형 I IFN 유도 유전자 발현 또는 기능 활동8,,910,11, 를 측정 하 여 12 , 13 , 14. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 분석 IFN-α 단백질의 직접 측정을 제공 하지 않습니다.
본이 연구에서는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 기술은 단일 IFN-α 단백질 분자의 검출에 대 한 분석 결과 개발에 사용 되었다. 그러나 디지털 ELISA 기존의 ELISA로 동일한 기본적인 화학, 반응 50000 개별 46 femtoliter 크기의 웰 스15,16으로 구성 된 배열에서 일어난다. 단일 단백질 분자는 항 체-코팅 된 상자성 구슬에 의해 점령 하 고는 biotinylated 탐지 항 체, 효소 공액, streptavidin-β-galactosidase (SBG)의 바인딩 다음으로 표시. 그 후, 구슬 fluorogenic 효소 기질, resorufin-β-D-galactopyranoside (까지), 단일 분자 배열에 함께 일시 중단 됩니다. 볼륨을 줄여 반응 2 십억 번17, 형광 신호의 높은 현지 농도 달성 하 고 단일 분자 수로 각 분자는 이제 안정적으로 될 수 있는 신호를 생성 가능 하 고, 될 측정18. 본질적으로 단일 분자 배열은 단일 immunocomplexes를 계산 하 고 구슬 (AEB) 당 효소의 평균 수를 결정 할 수 있다. 단백질 농도 immunocomplexed 구슬과 구슬에의 총 수 사이의 비율 사이 직접적인 상관으로 단백질 분자의 정량화/디지털화 허용 신호를 감지 하는 microwells를 계산 femtoliter 크기의 약 실입니다.
양 외. 9 다른 기술 및 4 개의 cytokine immunoassays19다른 플랫폼 걸쳐 분석 결과 정밀도, 감도, 그리고 데이터 상관 관계를 비교 하는 것을 목적으로 사용 하는 광범위 한 크로스-플랫폼 평가 연구를 수행 합니다. 연구의 주요 조사 결과 중 하나는 단일 분자 배열 및 단일 분자 immunoassay 계산 하위-pg/mL 농도 범위 내 인간의 혈 청에서 cytokines의 검출에 대 한 높은 감도 제시 했다. 단일 분자 배열 디지털 ELISA cytokine 분석 실험 Crohn의 질병20, IFN-α interferonopathy 및 자동-면역 환자 7, 일리노이-6와 TNF-α의 역할을 연구 하기 사용 되 고 다른 post-translationally C-X-C의 형태 수정 만성 간염 및 건강 한 기증자 sitagliptin21,22수신 모티브 chemokine 10 (CXCL10) 당뇨병 성 망막 증23; 환자에 rhodopsin의 측정을 포함 하는 다른 응용 프로그램 neurofilament의 혈 청/플라즈마 측정을 통해 뇌 병 리의 연구에 빛 다 발성 경화 증 및 알 츠 하이 머 병의 맥락에서24 및 아 밀 로이드 β 1-42 펩 티 드25, 각각. HIV 바이러스 성 저수지26의 특성 등 향상 된 병원 체 감지 하 고 또한 DNA27 마이크로 RNAs28의 검출에 대 한 단일 분자 배열 분석 실험도 사용할 수 있습니다. 특정 항 체 쌍을 사용할 수 경우 관심의 어떤 분석에 대 한 분석 결과 개발 될 수 있는 단일 분자 배열 기술의 주요 이점은이 다용도입니다. 또한, 사제 시험 장비는 상업적으로 사용할 수 있는 프로토콜 아래의 수정 된 형태로 상세한 새로운 분석의 개발을 허용.
여기, 단 하나 분자 배열 분석 결과 대 한 개발 및 유효성 검사 단계에 대 한 자세한 설명은 IFN-α 단백질 검출에 대 한 향상 된 감도에 그 결과 제공 됩니다. 단일 분자 배열 분석 실험에 대 한 항 체는 매우 구체적인, (와 함께 종 특이성 경우 관련) 관련 단백질 교차 반응성을 피하 해야 합니다. 이상적으로, KD 10-9 M 보다 작은 항 체는 선택 되어야 한다; 높은 선호도 높은 신호 생산 강한 바인딩을 확인합니다. 항 체-항 원 바인딩의 활동 또한 중요 하 고, 빠른 K에에 있으며 느린 K에서 항 원-항 체 복잡 한 어셈블리를 부탁 합니다. 항 체 쌍을 1-100 pg/ml, 탐지 (LOD)의 고전 ELISA에 좋은 성능을 시작 매우 민감한 단일 분자 배열 분석 결과 얻기의 가능성이 높아집니다. 장 및 동료 분석 감도18를 예측 하는 방정식의 세트를 제안 하 고 모든 단일 단계에서 발생 하는 바이오 상호 작용의 상세한 운동 연구 수행. 그들은 그 단일 분자 배열 디지털 ELISA 항 체 친 화력의 광범위 한 범위 내에서 효과적인 것 처럼 보였다 (KD ~ 10−11 -10−9 M), 뿐만 아니라 그 신호 발생은 더 많은 같은 항 체의에 속도에 의존.
높은 선호도 활용 하려면 우리 면역 polyendocrinopathy 증후군을 가진 환자에서 항 체 분리의 이용을 했다 항 체 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED)29를 입력 합니다. 이유로 아직 이해 되지 않는다, 아이 불충분 한 개인의 대다수는 모든 IFN-α 하위29에 대 한 높은 갈망 항 체의 코어 세트를 개발 하 고 우리는 상호 보완적인 바인딩 선호도의 두 안티-IFN-α 항 체 클론을 선택 다른 IFN-α 하위 유형에 대 한, IC50 값에 의해 추산 되. 단일 분자 배열 기술로 이러한 독특한 높은 친 화력 항 체의 조합 attomolar (fg/mL) 농도에서 IFN-α의 직접 정량화를 사용할 수 있습니다. 이러한 磁 IFN-α 단백질 검출 자연, 규칙 및 다른 질병에서 IFN 유도 응답의 생물 학적 영향의 더 나은 이해에 기여할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-IFN-&alpha; 항체 A (8H1 clone)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>상업적으로 이용 가능하지 않음</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; 항체 B (12H5 clone)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>상업적으로 이용 가능하지 않음</td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; 항체 EBI-1 클론</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha; 항체 BMS216BK 클론</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>ELISA 키트가 아니라 벌크 abs</td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN &alpha; I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; 2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN 및 알파; 2a</td><td>PeproTech</td><td>더 이상 사용할 수</td><td></td>없는</tr><tr><td>IFN &alpha; 2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &알파; 1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &알파; 4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &알파; 4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &알파; B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &알파; D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &알파; J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &알파; K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha; WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN &람다; 1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN 및 람다; 2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN 및 오메가;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN 및 베타;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN 및 감마;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>안티-IFN-&알파; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD 형질주입 시약</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter assay</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 대체</td>품 <td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계 NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>더 이상 사용할 수</td><td></td>없음</tr><tr><td>Amicon micocentrifuge 튜브 - 0.5mL 필터</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Bead Conjugation Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>별도로 주문할 수 없습니다</td></tr>. <tr><td>Non-Encoded 상자성 비드</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>비드 워시 버퍼</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>별도 주문 불가</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>비드 블로킹 버퍼</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>별도 주문 불가</td></tr><tr><td>비드 희석제 버퍼</td><td>Quanterix</td><td>101362</td><td></td></tr><tr><td>검출기 및 시료 희석제</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 반응 버퍼</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>별도 주문 불가</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브용 원심분리기(Heraens Fresco 21 원심분리기)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>표준 실험실 와류 믹서 (MS2 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>MS2</td><td></td></tr><tr><td>피펫 (10, 20, 200 및 1000 &mu; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>팁 (10, 20, 200 및 1000 &mu; l)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 마이크로 원심분리기</td> 튜브를 수용하는 <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic separator (Life Technologies DynaMag-2)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule array (Simoa) 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBG, 비드 및 검출기 바코드 라벨</td><td>Quanterix</td><td>101652</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 시약 병</td><td>Quanterix</td><td>102411</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 시료 96웰 플레이트</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 디스크</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Simoa 2.0 전도성 팁</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 큐벳</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Simoa SBG 시약</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Simoa RGP 시약</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 시스템 버퍼 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 시스템 버퍼 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>씰링 오일</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simoa HD-1 분석기</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule array (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single molecule counting Erenna 면역분석 시스템</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

이 프로토콜의 주요 목표는 개발 및 유효성 검사는 인터페론 (IFN)의 설명-α 단일 분자 배열 디지털 Enzyme-Linked ImmunoSorbent 분석 결과 (ELISA) 분석 결과. 이 시스템 수 있습니다 인간의 IFN-α 단백질의 정량화를 전례 없이 높은 감도, 그리고 아무 분 IFN의 다른 종족에 대 한.
프로토콜의 첫 번째 주요 단계 다음에 캡처 항 체의 활용 상자성 구슬과 biotinylation 탐지 항 체의 항 체 쌍의 선택입니다. 이 단계에 따라 최적의 감도 얻을 때까지 분석 결과 구성, 검출기 항 체 농도, 버퍼 구성 등의 다른 매개 변수를 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 특이성, 재현성 메서드의 결과에 신뢰를 보장 하기 위해 평가 됩니다. 여기, 우리는 0.69 fg/mL 높은 선호도 자가 면역 polyendocrinopathy를 일으키는 면역 레 귤 레이 터 (아이) 단백질 biallelic 돌연변이 가진 환자에서 격리를 사용 하 여의 검출도 IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과 개발 증후군 종류 1/면역 polyendocrinopathy-칸디 다 증-ectodermal 영양 (APS1/APECED). 중요 한 것은, 이러한 항 체는 모든 13 IFN-α의 감지를 사용할 수 있습니다.
이 새로운 방법론 수 있습니다 검출 및 정량화 IFN-α 단백질의 attomolar 농도에서 인간의 생물 학적 샘플에서 처음으로. 이러한 도구는 매우 인간의 건강 및 질병 상태,이 사이토카인의 수준을 모니터링 하는 데 유용 있을 것입니다 대부분 특히 감염, 자가 면역, 그리고 autoinflammation.

요약 하자면, 0.69 fg/mL, 2 단계 구성을 사용 하 여 캡처 구슬의 검출 한계는 팬-IFN-α 단일 분자 배열 분석 결과와 코팅 0.3 mg/mL의 안티-IFN-α는 항 체 및 안티-IFN-α B 탐지 항 체 biotinylated의 비타민 b 복합체: 항 체 비에 30 개발 되었다. Biotinylated 탐지 항 체 및 SBG 사용 농도 했다 0.3 µ g/mL 및 150 오후, 각각. 이 매우 구체적인 분석 결과 모든 13 IFN-α 하위 감지 수 이며 IFNs의 다른 유형으로 교차 반응 하지 않습니다. 따라서, 그것은 식별 하 고 IFN-α의 각 개별 종 계량 가능, 모두 검출 될 수 있다 고 함께 13 다른 서브 클래스를 구성 하는 IFN-α에 대 한 총 농도 값을 주는 측정.
이 새로 개발된 된 분석 결과의 잠재적인 진단 가치 탐험, 플라즈마와 건강 한 개인에서 혈 청 IFN-α 단백질 측정 하 고 SLE와 JDM 고통 받아 환자에서 샘플과 비교 했다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 건강 한 통제에 비교 하 여 두 질환 동료에 IFN-α 단백질의 높은 수준은 발견 했다. 점선은 어떻게이 이렇게 것 이다 감지 하지 IFN-α 단백질이이 고기가이 cytokine의 알려진된 연결에도 불구 하 고 이러한 환자 그룹을 보여주는 기존의 상용 ELISA의 LOD를 나타냅니다. 또한, IFN-α는 분석 결과, 분석 결과의 매우 민감한 성격을 확인 1-10 fg/mL 사이 감지 레벨의 넓은 동적 범위를 보여주는 5 로그의 크기를 통해 측정할 수 수 있습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> 그림 7: 플라즈마와 동료 환자에서 혈 청 IFN-α 단백질의 정량화. 이 그림은 Rodero 외에서 수정 되었습니다. 2017. 건강 한 컨트롤에서 플라즈마 (n = 20)와 SLE 고통 받는 환자 (n = 72) 및 JDM (n = 43) 팬 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과 함께 테스트 했다. 분석 비교 사용 하 여 단방향 ANOVA 테스트 (Kruskal-월리스)와 던의 여러 그룹 간의 테스트를 수행 했습니다. 중간값은 그려져 있습니다. 점선 참조 인간의 안티-IFN-α ELISA의 LOD를 나타냅니다 (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>고려 사항</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. 항 체 쌍 선택</td>
			<td>대상 다른 epitopes</td>
			<td rowspan="3">표 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>높은 선호도</td>
		</tr>
<tr>
<td>K에에 빠른 / 느린 K에서
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. 항 체 쌍 방향</td>
			<td rowspan="3">검출의 최저 제한 조건을 선택합니다</td>
			<td rowspan="3">그림 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. 항 체 농도 캡처</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. biotin: 검출기 항 체 비율</td>
		</tr>
<tr>
<td>5입니다. 2 대 3 단계 구성</td>
			<td>높은 신호: 배경 비율 조건 선택</td>
			<td>그림 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. 검출기 항 체 농도</td>
			<td rowspan="2">검출의 최저 제한 조건을 선택합니다</td>
			<td rowspan="2">그림 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. SBG 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>8입니다. 특이성</td>
			<td>분을 평가</td>
			<td rowspan="2">그림 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9입니다. 감도</td>
			<td>(있는 경우)의 인식 평가</td>
		</tr>
<tr>
<td>10입니다. 재현성</td>
			<td>분석 결과 변화를 평가</td>
			<td>그림 5</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 개발 및 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화를 위한 단계의 요약. 이 표에서 개발 및 재현성 평가까지 항 체 쌍의 초기 선택에서 단일 분자 배열 분석 결과의 최적화에 필요한 여러 단계를 요약 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항 원</td>
			<td>8 H 1 (A)</td>
			<td>12 H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28.3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35.35</td>
			<td>325.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93.29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64.7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0.9</td>
			<td>0.63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0.83</td>
			<td>691</td>
			<td>10.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0.71</td>
			<td>43.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14.52</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59.18</td>
			<td>28.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0.77</td>
			<td>890.9</td>
			<td>23.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 팬-알파 항 체 선택. IC50 (ng/mL) 인터페론 자극 응답 요소 (ISRE)를 사용 하 여 결정-Luciferase 중화 분석 결과. 테이블의 모든 IFN-α 하위에 대 한 단일 분자 배열 분석 결과에 사용 되는 mAbs IC50 값을 보여 줍니다. 10000 HEK 293 MSR 셀 흰색 반 지역 96 잘 접시에 시드 되었고 50 ng 혼합 ISRE-반딧불 luciferase 기자와 Renilla luciferase 구문을 사용 하 여 transfection 시 약 제조업체의 지침에 따라 리버스 페. Luciferase 표현 구문 내부 정규화 컨트롤로 제공 됩니다. 셀은 불필요 한 아미노산은 0.1 m m, 1mm 나트륨 pyruvate, 37 ° C에서 0.5% 태아 둔감 한 혈 청, 5% CO2 습도 분위기에서 보충 감소 혈 청 매체에 하룻밤 incubated 했다. 하룻밤 배양 한 후 세포 재조합 인간 IFN-α 또는 안티-IFN-α mAbs 또는 제어 1 h 37 ° c.에 대 한 preincubated 했다 IgG 없이 혼합물을 포함 하는 매체와 24 h에 대 한 자극 했다 자극의 24 h 후 듀얼 luciferase 기자 분석 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행 했다. «-» 결정 되지. Sifalimumab는 완전히 인간 면역 글로불린 g 1 κ 단일 클론 항 체에 바인딩하고; IFN-α의 대부분을 중화 하는 Rontalizumab은 IFN-α에 대 한 인간 답게 단일 클론 항 체 이다. 메이어 연구진이 2016 및 Rodero 그 외 여러분 에서 적응 2017입니다.
보충 표 1: 다양 한 항 체 방향, 구슬 및 biotinylation 비율에 항 체 농도 캡처. 서로 다른 두 가능한 구성을 테스트, 탐지 항 체 (A), 그리고로 캡처 항 체 및 안티-IFN-α B 안티-IFN-α A를 사용 하 여 반대 (B). IFNα-2 c 항으로 사용 되었다. 다른 캡처 항 체 농도 뿐만 아니라 비타민 b 복합체: 항 체 (B:A) 비율 구성 모두에 대 한 테스트도 했다. 채도 (토). LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 2: 2 vs 3 단계 구성의 테스트. 2, 3-단계 구성으로 항 원 c IFNα-2를 사용 하 여 평가 됐다. AEB 값 뿐만 아니라 신호/배경 식량 (S/B) 표시 됩니다 두 조건에 대 한. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 3: 검출기와 SBG 농도 최적화. SBG의 3 개의 다른 농도 함께 biotinylated 검출기 항 체 (0.1, 0.3, 0.6 µ g/mL)의 3 개의 다른 농도 (50, 150, 및 250 오후) 평가 했다. AEB 값 9 테스트 조건에 대 한 표시 됩니다. LOD 계산; 사용 된 주황색: 브라질 우주국 값 이 농도 꾸준히 남아 AEB 값으로 빈 간주 됐다. LOD 의미 빈 + 3SD.로 계산 되었다 <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 4: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 감도 및 특이성. 구슬 값 당 평균 효소 IFN β, IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-ω, 그리고 IFN-γ 재조합 단백질은 시험 때 (A)의 IFN-α (B) 16 하위 함께 표시 됩니다. «-» 결정 되지. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 5: 최적화 된 IFNα 단일 분자 배열 분석 결과의 재현성. 모든 3 개의 독립적인 실행에 대 한 평균값 AEB 10.000 fg/mL의 농도를 표시 됩니다. «-» 결정 되지. 채도 (토). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 6: 단백질 경쟁 분석 결과. 구슬 값 당 평균 효소 테스트 하는 모든 조건에 대 한 표시 됩니다. 측정은 중복에서 수행 했다. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

이 방법은 자가 면역 및 감염을 포함한 다양한 질병 환경에서 인터페론 유도 반응의 특성, 조절 및 생물학적 영향에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 그 자체의 대통령 같은 감도입니다. 이 기술은 전례 없는 감도로 사이토카인을 정량화할 수 있기 때문에 많은 질병에서 환자 관리를 개선하기 위한 바이오마커 발견에 큰 잠재력을 가지고 있습니다.이 접근법의 주요 단계는 자가면역 폴리인자크린 시스템 1형 환자와 관련된 활동을 중화하는 것이었습니다. 먼저 2억 8천만 개의 상자성 비드를 마이크로퓨지 튜브에 넣고 부피를 기록하십시오. 그런 다음 펄스를 돌려 구슬을 돌리고 튜브를 자기 분리기에 1분 동안 올려 놓습니다.희석제 용액을 제거하고 폐기하여 비드를 분리합니다. 다음으로 BWB로 구슬을 두 번, BCB로 두 번 씻습니다. 세척할 때마다 200마이크로리터를 넣고 5초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.그런 다음 자기 분리기를 사용하여 용액에서 비드를 분리합니다. 분리 1분 후 희석제를 버리십시오. 다음으로, 비드 부피당 190마이크로리터의 BCB를 추가합니다.그런 다음 튜브를 짧게 소용돌이치고 튜브를 펄스 스핀하고 세척된 구슬을 얼음 위에 놓습니다. 비드를 활성화하려면 1ml의 차가운 BCB와 10mg의 EDC를 결합하고 용액이 균질해질 때까지 소용돌이칩니다. EDC를 사용할 때는 고유한 불안정성과 평형 솔루션으로 인해 빠르고 안전하게 작업하십시오.그런 다음 비드 부피당 10마이크로리터의 차갑고 희석된 EDC를 비드 현탁액에 추가하고 비드를 짧게 와류로 만듭니다. 그런 다음 구슬을 실온에서 30분 동안 셰이커에 넣습니다. 비드에 항체를 접합하기 위해 첫 번째 와류와 펄스가 활성화된 비드를 회전시킵니다.그런 다음 비드를 자기 분리기에 1분 동안 넣고 BCB 상층액을 버립니다. 그런 다음 자석에서 튜브를 제거하고 200마이크로리터의 BCB로 비드를 두 번 세척합니다. 그런 다음 와류, 펄스 스핀 및 비드를 자기적으로 분리하여 버퍼를 제거합니다.그런 다음 200마이크로리터의 차갑고 완충액으로 교환된 항체를 활성화된 비드에 빠르게 추가합니다. 해결책으로 구슬을 와동을 치기 후에, 1, 000 분당 회전수에 2 시간 동안 실내 온도 셰이커에 중단을 두십시오. 먼저 항체가 코팅된 비드 현탁액에 펄스 스핀을 가한 다음 마그네틱 컬럼을 사용하여 버퍼를 제거합니다.다음으로, 완충액에 있는 단백질의 농도를 확인합니다. 저용량 분광 광도계를 사용하십시오. 이 시점에서 항체는 비드에 결합되며 0보다 큰 값은 비드가 항체로 포화되었음을 의미합니다.이제 이전의 모든 세척에서와 같이 200마이크로리터의 BWB로 비드를 세척합니다. 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 단백질 농도를 확인합니다. 비드에서 방출되는 단백질의 정량화를 통해 항체 결합을 측정할 수 있습니다.그런 다음 200마이크로리터의 BWB로 비드를 다시 씻습니다. 다음으로, 200마이크로리터의 비드 블로킹 버퍼를 추가하고 튜브를 5초 동안 볼텍스한 다음 30분 동안 실온 셰이커로 옮깁니다. 30분이 지나면 구슬이 막힙니다.그런 다음 200마이크로리터의 BWB를 사용하여 한 번 세척한 다음 세척할 때마다 200마이크로리터의 비드 희석제 버퍼로 두 번 세척합니다. 그런 다음 코팅되고 막힌 비드를 섭씨 4도의 200마이크로리터의 비드 희석제 버퍼에 보관합니다. 비디오의 이 섹션에서는 가정용 양조 구성에서 단일 분자 어레이 분석기 소프트웨어를 사용하여 분석 조건을 조정하는 방법에 대한 전략을 제안합니다.먼저 두 항체 조합에서 capture antibody conjugated beads와 biotinylation detection antibody의 다양한 조합을 테스트합니다. 다음으로, 검출 및 포획 항체를 위해 두 가지 다른 비오틴화 비율로 세 가지 다른 포획 항체 농도의 조합을 테스트하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 그런 다음 가장 낮은 수준의 감지를 제공하는 조합을 선택하고 추가 단계에 사용합니다.이 경우 항체에 대한 비오틴의 30:1 비율이 최상의 검출 한계를 제공합니다. 다음으로, 2단계 구성과 3단계 구성을 비교합니다. 3단계 구성에는 세 가지 다른 배양 단계가 있습니다.하나는 포획 항체, 다른 하나는 검출 항체, 그리고 마지막, 세 번째는 SBG 효소 라벨링을 위한 것입니다. 2단계 구성은 포획과 검출 인큐베이션을 결합합니다. 제조업체의 지침에 따라 분석기에 사전 구성된 2단계 및 3단계 구성에서 선택한 캡처 및 검출기 항체 농도와 배량을 사용하여 단일 분자 어레이 분석기를 실행합니다.그런 다음 가장 높은 감도를 허용하는 구성을 선택하고 향후 단계를 위해 유지합니다. 이 경우 2단계 구성은 모든 테스트 포인트에서 약간 더 높은 감도를 제공합니다. 다음으로, 검출기 항체와 SBG의 농도를 최적화합니다.세 가지 농도의 SBG로 세 가지 농도의 검출기 항체를 테스트합니다. 가장 높은 감도를 제공하는 농도를 선택하고 향후 단계를 위해 유지하십시오. 이 경우, 밀리리터당 0.3마이크로그램의 항체와 150피카 몰 SBG는 우연한 중간 진폭의 낮은 백그라운드 레벨에서 최적의 검출 수준을 갖습니다.추가 최적화 단계는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 여기에는 분석 특이성 및 재현성을 최적화하기 위한 절차와 단백질 경쟁을 위한 분석이 있습니다. 인터페론-알파의 13개 하위 분류를 검출하도록 최적화된 분석을 사용하여 SLE 환자, JDM 환자 및 건강한 대조군에서 혈장 및 혈청을 분석했습니다.높은 수준의 인터페론-알파 단백질이 두 질병 코호트 모두에서 검출되었습니다. 점선은 이러한 질병에서 사이토카인의 알려진 역할에도 불구하고 이러한 환자 그룹에서 인터페론-알파 단백질을 검출하지 못하는 기존의 상업적으로 이용 가능한 Eliza의 검출 수준을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 선택한 분석을 위한 단일 분자 어레이 어세이를 개발하고 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 세포가 항체를 선택하는 동안 다음과 같다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 이후 이 분석법은 다양한 자가면역 질환 및 감염에서 인터페론-알파의 역할을 더 잘 특성화할 수 있게 해주었습니다. 이 분석은 또한 새로운 치료법에 대한 반응을 모니터링하고 특정 자가면역 질환을 일으키는 세포 행위자를 식별하는 데 도움이 되었습니다.

development-validation-an-ultrasensitive-single-molecule-array

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

그런가에 대한 정량, 높은 처리량, 실시간 및 레이블이없는 biomolecular 감지 (DNA, 단백질...

Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

인유두종바이러스와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체의 T세포 에피토프를 규명하는 것은 혈중 T세포 수가 제한적이기 때문에 매우 어렵습니다. 본 영상에서는 매우 적은 수의 세포로부터 희귀 T세포를 분리하고 특성을 분석하는 방법을 설명합니다.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

Luminex Corporation의 xMAP의 microsphere 기술을 사용, 우리는 다양한 실험실 동물 종의 serosurveillance에 대한 다중 Fluorometric 면역 분석법 (MFIA)를 개발했습니다. MFIA는 항원, 조직 제어 또는 면역 글로불린이 covalently 색으로 구분되는 폴리스티렌 마이크로에 연결되어 정지 microarray입니다. MFIA 테스트 방법뿐만 아니라 다양한 문제 해결 항목은 해결됩니다.

멀티 플렉스 Fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결

이 비디오는 쥐의 비장에서 IFN-γ(in situ interferon-gamma) 분비를 시각화하는 이미징 방법을 보여줍니다. 세균 감염 및 T 세포 및 자연 살해 세포 내부에 IFN-γ 축적 유도 후 비장은 마우스에서 채취됩니다. 조직 절편을 얻으면 세포 내부의 IFN-γ을 시각화하기 위해 면역염색을 수행합니다.

쥐 림프구 기관에서 인터페론-감마 분비 식별을 위한 분석

이 프로토콜은 유형 I 및 III IFN 발현 시그니처 분석을 위한 고처리량 qRT-PCR 분석을 설명합니다. 이 분석은 이러한 유전자의 매우 유사한 전사체 간의 단일 염기쌍 차이를 구별합니다. 배치 조립 및 로봇 피펫팅을 통해 분석은 일관되고 재현성이 있습니다.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

이 보고서는 자동 슬라이드 염색기에서 다중 면역형광(mIF) 분석을 위한 자동 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 표준 고처리량 조직 자동염색기 및 전체 슬라이드 형광 이미저에서 공간 단백질체학의 높은 재현성을 보여주며, 이는 중개 연구에서 많은 수의 조직 슬라이드에 걸친 맞춤형 mIF 분석에 이상적입니다.

중개 연구를 위한 High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assay

학습하세요 초고감도 디지털 ELISA를 이용한 인간 인터페론-α 검출법을 통해 자가면역질환 및 감염에서 면역 반응을 연구하는 방법을 배우세요. 이 기술은 바이오마커 발굴에 활용됩니다.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

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