개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

이 방법은 자가 면역 및 감염을 포함한 다양한 질병 환경에서 인터페론 유도 반응의 특성, 조절 및 생물학적 영향에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 그 자체의 대통령 같은 감도입니다. 이 기술은 전례 없는 감도로 사이토카인을 정량화할 수 있기 때문에 많은 질병에서 환자 관리를 개선하기 위한 바이오마커 발견에 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

이 접근법의 주요 단계는 자가면역 폴리인자크린 시스템 1형 환자와 관련된 활동을 중화하는 것이었습니다. 먼저 2억 8천만 개의 상자성 비드를 마이크로퓨지 튜브에 넣고 부피를 기록하십시오. 그런 다음 펄스를 돌려 구슬을 돌리고 튜브를 자기 분리기에 1분 동안 올려 놓습니다.

희석제 용액을 제거하고 폐기하여 비드를 분리합니다. 다음으로 BWB로 구슬을 두 번, BCB로 두 번 씻습니다. 세척할 때마다 200마이크로리터를 넣고 5초 동안 튜브를 소용돌이칩니다.

그런 다음 자기 분리기를 사용하여 용액에서 비드를 분리합니다. 분리 1분 후 희석제를 버리십시오. 다음으로, 비드 부피당 190마이크로리터의 BCB를 추가합니다.

그런 다음 튜브를 짧게 소용돌이치고 튜브를 펄스 스핀하고 세척된 구슬을 얼음 위에 놓습니다. 비드를 활성화하려면 1ml의 차가운 BCB와 10mg의 EDC를 결합하고 용액이 균질해질 때까지 소용돌이칩니다. EDC를 사용할 때는 고유한 불안정성과 평형 솔루션으로 인해 빠르고 안전하게 작업하십시오.

그런 다음 비드 부피당 10마이크로리터의 차갑고 희석된 EDC를 비드 현탁액에 추가하고 비드를 짧게 와류로 만듭니다. 그런 다음 구슬을 실온에서 30분 동안 셰이커에 넣습니다. 비드에 항체를 접합하기 위해 첫 번째 와류와 펄스가 활성화된 비드를 회전시킵니다.

그런 다음 비드를 자기 분리기에 1분 동안 넣고 BCB 상층액을 버립니다. 그런 다음 자석에서 튜브를 제거하고 200마이크로리터의 BCB로 비드를 두 번 세척합니다. 그런 다음 와류, 펄스 스핀 및 비드를 자기적으로 분리하여 버퍼를 제거합니다.

그런 다음 200마이크로리터의 차갑고 완충액으로 교환된 항체를 활성화된 비드에 빠르게 추가합니다. 해결책으로 구슬을 와동을 치기 후에, 1, 000 분당 회전수에 2 시간 동안 실내 온도 셰이커에 중단을 두십시오. 먼저 항체가 코팅된 비드 현탁액에 펄스 스핀을 가한 다음 마그네틱 컬럼을 사용하여 버퍼를 제거합니다.

다음으로, 완충액에 있는 단백질의 농도를 확인합니다. 저용량 분광 광도계를 사용하십시오. 이 시점에서 항체는 비드에 결합되며 0보다 큰 값은 비드가 항체로 포화되었음을 의미합니다.

이제 이전의 모든 세척에서와 같이 200마이크로리터의 BWB로 비드를 세척합니다. 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 단백질 농도를 확인합니다. 비드에서 방출되는 단백질의 정량화를 통해 항체 결합을 측정할 수 있습니다.

그런 다음 200마이크로리터의 BWB로 비드를 다시 씻습니다. 다음으로, 200마이크로리터의 비드 블로킹 버퍼를 추가하고 튜브를 5초 동안 볼텍스한 다음 30분 동안 실온 셰이커로 옮깁니다. 30분이 지나면 구슬이 막힙니다.

그런 다음 200마이크로리터의 BWB를 사용하여 한 번 세척한 다음 세척할 때마다 200마이크로리터의 비드 희석제 버퍼로 두 번 세척합니다. 그런 다음 코팅되고 막힌 비드를 섭씨 4도의 200마이크로리터의 비드 희석제 버퍼에 보관합니다. 비디오의 이 섹션에서는 가정용 양조 구성에서 단일 분자 어레이 분석기 소프트웨어를 사용하여 분석 조건을 조정하는 방법에 대한 전략을 제안합니다.

먼저 두 항체 조합에서 capture antibody conjugated beads와 biotinylation detection antibody의 다양한 조합을 테스트합니다. 다음으로, 검출 및 포획 항체를 위해 두 가지 다른 비오틴화 비율로 세 가지 다른 포획 항체 농도의 조합을 테스트하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 그런 다음 가장 낮은 수준의 감지를 제공하는 조합을 선택하고 추가 단계에 사용합니다.

이 경우 항체에 대한 비오틴의 30:1 비율이 최상의 검출 한계를 제공합니다. 다음으로, 2단계 구성과 3단계 구성을 비교합니다. 3단계 구성에는 세 가지 다른 배양 단계가 있습니다.

하나는 포획 항체, 다른 하나는 검출 항체, 그리고 마지막, 세 번째는 SBG 효소 라벨링을 위한 것입니다. 2단계 구성은 포획과 검출 인큐베이션을 결합합니다. 제조업체의 지침에 따라 분석기에 사전 구성된 2단계 및 3단계 구성에서 선택한 캡처 및 검출기 항체 농도와 배량을 사용하여 단일 분자 어레이 분석기를 실행합니다.

그런 다음 가장 높은 감도를 허용하는 구성을 선택하고 향후 단계를 위해 유지합니다. 이 경우 2단계 구성은 모든 테스트 포인트에서 약간 더 높은 감도를 제공합니다. 다음으로, 검출기 항체와 SBG의 농도를 최적화합니다.

세 가지 농도의 SBG로 세 가지 농도의 검출기 항체를 테스트합니다. 가장 높은 감도를 제공하는 농도를 선택하고 향후 단계를 위해 유지하십시오. 이 경우, 밀리리터당 0.3마이크로그램의 항체와 150피카 몰 SBG는 우연한 중간 진폭의 낮은 백그라운드 레벨에서 최적의 검출 수준을 갖습니다.

추가 최적화 단계는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 여기에는 분석 특이성 및 재현성을 최적화하기 위한 절차와 단백질 경쟁을 위한 분석이 있습니다. 인터페론-알파의 13개 하위 분류를 검출하도록 최적화된 분석을 사용하여 SLE 환자, JDM 환자 및 건강한 대조군에서 혈장 및 혈청을 분석했습니다.

높은 수준의 인터페론-알파 단백질이 두 질병 코호트 모두에서 검출되었습니다. 점선은 이러한 질병에서 사이토카인의 알려진 역할에도 불구하고 이러한 환자 그룹에서 인터페론-알파 단백질을 검출하지 못하는 기존의 상업적으로 이용 가능한 Eliza의 검출 수준을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 선택한 분석을 위한 단일 분자 어레이 어세이를 개발하고 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포가 항체를 선택하는 동안 다음과 같다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 이후 이 분석법은 다양한 자가면역 질환 및 감염에서 인터페론-알파의 역할을 더 잘 특성화할 수 있게 해주었습니다. 이 분석은 또한 새로운 치료법에 대한 반응을 모니터링하고 특정 자가면역 질환을 일으키는 세포 행위자를 식별하는 데 도움이 되었습니다.