Name: 멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 학습하세요 Luminex xMAP 플랫폼으로 ELISA 분석을 전환하는 멀티플렉스 항체 검사 방법을. TNF Alpha 사이토카인 검출을 위해 다중 항체 쌍을 동시 평가하여 민감도와 동적 범위를 향상시키는 효율적인 기술입니다.

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이 작품은 Luminex 공사에 의해 재정 지원되었다.

<ol><li>Fulton, J. R., McDade, R. L., Smith, P. L., Kienker, L. J., Kettman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+multiplexed+analysis+with+the+FlowMetrix+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system.</a> Clinical Chemistry. 43, 1749-1756 (1997).</li>
<li>Carson, R. T., Vignali, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantation+of+15+cytokines+using+a+multiplexed+flow+cytometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay.</a> J. Immunol. Methods. 227, 41-52 (1999).</li>
<li>Peck, D., Crawford, E. D., Ross, K. N., Stegmaier, K., Golub, T. R., Lamb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+gene+expression+signature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput gene expression signature analysis.</a> Genome Biol. 7, 61(2006).</li>
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<li>Liu, J., Kibiki, G., Maro, V., Maro, A., Kumburu, H., Swai, N., Taniuchi, M., Gratz, J., Toney, D., Kang, G., Houpt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+reverse+transcription+PCR+Luminex+assay+for+detection+and+quantitation+of+viral+agents+of+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis.</a> J. Clin. Virol. 50, 308-313 (2011).</li>
<li>de Jager, W., Prakken, B. J., Bijlsma, J., WJ Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+multiplex+immunoassay+performance+in+human+plasma+and+synovial+fluid+following+removal+of+interfering+heterophilic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 300, 124-135 (2005).</li>
<li>Codorean, E., Nichita, C., Albulescu, L., Raducan, E., Popescu, I. D., Lonita, A. C., Albulescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+xMAP+and+ELISA+cytokine+profiles%3B+development+and+validation+for+immunotoxicological+studies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Roum.+Arch.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Correlation of xMAP and ELISA cytokine profiles; development and validation for immunotoxicological studies in vitro.</a> Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 69, 3-19 (2010).</li>
<li>de Jager, W., te Velthuis, H., Prakken, B. J., Kuis, W., Rijkers, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+15+human+cytokines+in+a+single+sample+of+stimulated+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).</li>
<li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA%3A+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li>
<li>Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+validation+and+comparison+of+multiplex+cytokine+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15, 562-568 (2010).</li>
<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

이 작품은 Luminex 공사에서 제조 설비를 Luminex 공사에서 이루어졌다. R &amp; D 시스템 및 EMD Millipore는 Luminex Corporation의 전략적 파트너, 멀티 플렉스 xMAP 기반 assays을 개발하고 상용화 허가.

Luminex xMAP 플랫폼으로 엘리사 분석의 변환 streptavidin phycoerythrin (SA-PE)과 전형적인 엘리사 키트에 streptavidin 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (SA-HRP)를 대체하고, 성능을 최적화하는 것만 큼이나 간단합니다. 최대 땅속에서 xMAP 면역 분석법을 생성하고자하는 사람들을 위해, 이것은 또한 항체 쌍의 빠른, 멀티 플렉스 평가있게 간단한 프로토콜로 수행할 수 있습니다. xMAP 분석을위한 시약 쉽게 부부 지정 캡처 항체에 MagPlex 낮은 농도 microspheres에 xMAP 항체 커플링 키트를 사용하여 작성되었다. 낮은 농도 microspheres의 사용은 높은 농도 microspheres의 동일한 분석 성능을 제공하면서 분석 개발 비용을 줄여줍니다. 결합 MagPlex microspheres를 준비하는 데 필요한 시간의 양은 어느가 22보다 훨씬 빠른, 약 3 시간 - 24 시간 치료 뒤에는 코트 엘리사 플레이트의 우물을 의무코팅 위. xMAP 분석의 성능을 탐지 (&lt;4 PG / ML 대&gt; 31 PG / ML) 및 동적 범위 (&lt;4 PG / ML로&gt; 8000 PG / ML 대 16 한계의 측면에서도 엘리사에게 우수 PG / ML 1000 PG / ML). 플레이트 리더는 분석을위한 동적 범위의 상한선을 제한, 중 3이나 4 OD는 제한된 OD의 범위가 있습니다. 의심의 여지가없이, 모든 항체는 엘리사 형식으로 작동하며 엘리사에 잘 작동하지 않을 모든 항체는 xMAP 분석 형식으로 쉽게 이전할 수 있습니다. xMAP의 assays가 (동시에 실행 IE) 멀티 플렉스 수 있기 때문에 그러나, 그것은 분석을 위해 사용하는 가장 좋은 쌍을 식별하는 동시에 여러 캡처 및 탐지 항체 조합을 평가하는 것이 가능합니다. 이 과정은 상당한 시간과 한 번에 한 쌍의 평가로 제한됩니다 엘리사 개발 절차와 비교 시약을 저장합니다. 두 개 이상의 항체 쌍은 equivalently 수행되어야하고 분석의 다른 매개 변수 수쌍 (예, 가용성, 비용 등)의 적합성을 결정 간주됩니다. xMAP 분석과 향상된 분석 성능과 유연성뿐만 아니라, 상당한 비용 절감 효과도있다. xMAP 분석을 잘 하나에 사용되는 구슬에 필요한 수량이 약 7.5 NG이지만 항체의 권장 수량은 코트 한 우물 엘리사 플레이트가 400ng이다에 필요합니다. 따라서, 하나 엘리사에 필요한 항체의 양을 잘 xMAP 분석에 사용되는 경우, 50 개 이상의 테스트 결과를 제공합니다. 귀중한 샘플을 포함한 어플 리케이션의 경우, xMAP 또한 상당한 장점이 있습니다. xMAP 분석에 필요한 볼륨 그 중 절반 이하가 될 수 반면 엘리사 권장 시료의 부피는 100 μL입니다. 우수한 동적 범위와 감도와 분석을 생산하면서 요약에 Luminex xMAP 플랫폼으로 엘리사 분석의 변환은, 단순한 효율 및 비용 절감이다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 설명 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 인간 TNF-α/TNFSF1A DuoSet 엘리사 키트 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> DY210 </td><td> 단클론 및 비오틴 결합 polyclonal 항체 및 재조합 TNF-α 단백질 표준을 포함 </td></tr><tr><td> TNF-α에 대한 단클론 항체 </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> , 클론 CH8820를 항체를 캡처 </td></tr><tr><td> TNF-α에 대한 단클론 항체 </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> 비오틴 결합 감지 항체, 클론 AS1 </td></tr><tr><td> TNF 알파 단백질 </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> 재조합 TNF-α 단백질 표준 </td></tr><tr><td> TNF-α에 대한 단클론 항체 </td><td> Novus </td><td> NBP1-50115 </td><td> , 클론 4H31을 항체를 캡처 </td></tr><tr><td> TNF-α에 대한 단클론 항체 </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> 비오틴 결합 감지 항체, 클론 MAb11 </td></tr><tr><td> TNF 알파 단백질 </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> 재조합 TNF-α 단백질 표준 </td></tr><tr><td> TNF-α에 대한 단클론 항체 </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> 항체를 캡처, 3C7.2을 복제 </td></tr><tr><td> TNF-α에 대한 Polyclonal 항체 </td><td> EMD Millipore </td><td> 654,250 </td><td> 토끼 polyclonal 감지 항체 </td></tr><tr><td> Streptavidin-Phycoerythrin </td><td> 이끼 </td><td> SAPE-001 </td><td> Luminex xMAP 분석을위한 형광 기자 시약 </td></tr><tr><td> MAGPIX W / xPONENT 소프트웨어 </td><td> Luminex 공사 </td><td> 석사GPIX-XPONENT </td><td> Luminex의 악기 </td></tr><tr><td> xMAP 항체 커플링 (AB​​C) 키트 </td><td> Luminex 공사 </td><td> 40-50016 </td><td> EDC 시약, Sulfo-보건국 시약, 활성화 버퍼, 세차 버퍼, 1.5 ML 반응 튜브, 그리고 일회용 pipettes 포함 </td></tr><tr><td> MagPlex Microspheres, 낮은 농도 </td><td> Luminex 공사 </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> 낮은 농도 구슬 (@ 2.5 X 10 6 비드 / ML) </td></tr><tr><td> EZ-링크 Sulfo-NHS-LC-비오틴 </td><td> 써모 피셔 </td><td> PI-21335 </td><td> 수정되지 않은 항체 검출을위한 Biotinylation 키트 </td></tr><tr><td> Tecan 무한 F200 리더 </td><td> Tecan </td><td></td><td> 엘리사 플레이트 리더 </td></tr><tr><td> 인산염은 염분 버퍼 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P-3688 </td><td> 1퍼센트 PBS-BSA, 분석 완충액 </td></tr><tr><td> 한 파인트 소형 초음파 청소기, VAC 115 </td><td> 콜 - Parmer </td><td> WU-08849-00 </td><td> 55 kHz에서의 효과적인 운영 주파수를 제작 </td></tr><tr><td> 마그네틱 튜브 구분 기호 </td><td> Luminex 공사 </td><td> CN-0288-01 </td><td> 커플링 세탁 단계에서 단일 1.5mL 튜브 자성 분리를 위해 </td></tr><tr><td> 마그네틱 플레이트 구분 기호 </td><td> Luminex 공사 </td><td> CN-0269-01 </td><td> 검정 세척 단계에서 96 - 웰 플레이트 자성 분리를 위해 </td></tr></tbody></table>

멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 luminex xmap 분석에 캡처 엘리사의 전환

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

효소 결합 면역 분석 (엘리사)는 오랫동안 생명 과학 연구 및 임상 진단 모두에 대한 생물 학적 시료에 대한 관심 analytes의 검출하기위한 중요한 도구가되었습니다. 그러나 엘리사는 제한 사항이 있습니다. 그것은 일반적으로 96 - 웰 microplate에서 수행되며, 우물은 관심 항원을 포착하기 위해 시료의 비교적 큰 금액을 요구, 캡처 항체로 코팅됩니다. 우물의 넓은 표면적과 캡쳐 항체의 소수성 바인딩도 아닌 특정 바인딩과 증가 배경으로 이어질 수 있습니다. 또한 대부분의 ELISAs는 합리적인 감도를 달성하기 위해서는 신호의 효소 - 매개 증폭에 의존. 이러한 증폭은 항상 선형 아니며 수 있으므로 스큐 결과입니다. 지난 15 년 동안 새로운 기술은 비슷한 우와 함께하는가 엘리사의 혜택을 제공뿐만 아니라, 높은 처리량, 향상된 유연성, 감소 샘플 볼륨, 그리고 낮은 비용을 가능하게 떠오르고rkflow 1, 2. Luminex xMAP 기술 monoplex과 단백질과 핵산 응용 3-5 모두에 적용할 수있는 멀티 플렉스 assays를 모두 가능하게 microsphere (구슬) 배열 플랫폼입니다. 구슬은 엘리사에 비해 덜 캡처 항체와 작은 샘플 볼륨을 필요로하는, covalently 작은 표면적에 고정화 캡처 항체를 가지고 있고, 이외의 구체적인 구속력이 크게 줄어 듭니다. 같은 뇌척수, 활액 액체 등 6 등 제한 샘플 작업시 작은 샘플 볼륨이 중요하다. 분석을 다중화하는 것은 더 이상 하나의 샘플에서 여러 결과를함으로써, 샘플 볼륨 요구 사항을 줄여줍니다. Luminex에 의한 최근의 향상된 기능은 다음과 같습니다 : 새로운 MAGPIX 시스템, 작고, 저렴, 쉽게 - 사용하기 분석기, 낮은 농도 마그네틱 MagPlex Microspheres 고가의 필터 플레이트에 대한 필요성을 제거하고 더 나은 분석 개발에 적합 근무 농도에 와서낮은 처리량 어플 리케이션 및 xMAP 항체 커플링 (AB​​C) 키트, 프로토콜, 시약 및 관심 캡처 항체에 구슬을 커플링에 필요한 소모품을 포함합니다. (키트 내용의 자세한 목록은 자료 섹션을 참조하십시오.) 본 실험에서는 xMAP 플랫폼 TNF-알파 시토킨위한 사전 최적화된 엘리사 분석을 변환하고 두 가지 방법 7-11의 성능을 비교합니다. TNF-알파는 면역 장애 환자에서 염증 반응의 측정에 사용되는 biomarker입니다. 우리는 네 가지 microsphere 세트 또는 지역 네 가지 후보 캡처 항체를 결합하여 시작합니다. 함께 혼합하면 이들 4 세트는 최고의 항체 쌍, 저장 시약, 샘플 및 시간을 결정하는 4 개의 별도의 탐지 항체를 가진 네 명의 후보 중 동시 테스트하실 수 있습니다. 두 xMAP의 assays 그런 다음 두 가장 최적 항체 쌍과 건설과 그 성과가있다신호 강도, 동적 범위 및 감도에 관해서 원래 엘리사 분석의 비교.

엘리사 쉽게 Luminex xMAP 분석으로 변환될 수 있으며, 멀티플렉싱, 여러 항체의 장점을 통해 분석 비용을 줄이는 한편, 증가 감도 및 다이나믹 레인지 결과, 최적 항체 쌍을 식별하는 동시에 상영 할 수 있습니다.

멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

효소결합면역흡착분석법(ELISA)은 오랫동안 생명 과학 및 임상 진단 모두에서 생물학적 시료 내 관심 분석물을 검출하기 위한 주요 도구로 사용되어 왔습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 TNF Alpha 사이토카인에 대해 이미 최적화된 Eliza 분석법을 Xap 플랫폼으로 전환하면서 대안적인 항체 쌍을 평가하는 것입니다. 이는 ELIZA 키트의 포획 항체와 세 가지의 다른 후보 포획 항체를 서로 다른 네 가지의 마이크로스피어 또는 비드 세트에 혼합하여 결합함으로써 달성됩니다. 이 네 가지 세트를 통해 네 가지 후보 항체 모두를 네 가지의 서로 다른 검출 항체와 동시에 테스트하여 최적의 항체 쌍을 결정할 수 있습니다.이후 가장 최적화된 두 가지 항체 쌍을 사용하여 두 가지 Xap 분석법을 구축합니다. 그런 다음 신호 강도, 동적 범위 및 민감도 측면에서 이 분석법들의 성능을 기존 EISA 분석법과 비교합니다. 결과에 따르면, 유사한 항체라도 동일한 조건에서 매우 다르게 작용할 수 있으며, Luminex Xap 분석법을 통해 여러 항체를 동시에 스크리닝할 수 있음을 알 수 있었습니다. 또한, 이 분석법이 EISA와 비교했을 때 민감도와 동적 범위가 향상되었음을 확인하였습니다.EIS A와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 xap 기반 면역 분석법을 통해 연구자가 여러 표적을 테스트하거나, 본 사례와 같이 여러 항체를 동시에 테스트할 수 있다는 점입니다. 가장 우수한 항체를 확인하기 위한 절차는 Luminex Corporation의 부연구원인 Erica Lopez가 시연할 예정입니다.서면 프로토콜에 설명된 대로 인간 TNF alpha에 특이적인 4종의 캡처 항체와 4종의 검출 항체를 선택하고 준비하여 본 프로토콜을 시작하십시오. 또한, 캡처 항체의 숙주 종에 특이적인 확인 항체 1종을 준비하십시오. 항체 결합 키트에 포함된 시약들을 상온으로 맞추십시오.결합 반응에 선택된 비드 영역 번호로 반응 튜브 4개에 라벨을 붙입니다. mag plex 마이크로스피어 바이알 4개의 내용물을 라벨이 붙은 반응 튜브 4개로 옮깁니다. 각 비드 세트를 500 µL의 활성화 버퍼로 2회 세척하고, 항체 결합 키트에 설명된 대로 sulf ONHS 및 EDC 용액으로 각 비드 세트를 활성화합니다.사용자 매뉴얼: 로테이터에서 20분간 배양한 후, 활성화된 비드를 사용하여 이전의 세척 단계를 활성화 버퍼 500 µL로 총 3회 반복하십시오. 각 세척 시, 캡처 항체 7.5 µg이 포함된 500 µL 용액 4개를 각각 준비하십시오. 비활성화 버퍼를 사용합니다.이 네 가지 포획 항체 용액을 각각의 반응 튜브에 넣습니다. 각 튜브를 즉시 볼텍싱하고 로테이터에서 2시간 동안 배양합니다. 항체 결합 키트에 포함된 세척 완충액 500 µL를 사용하여, 항체가 결합된 비즈의 세척 단계를 총 3회 반복합니다.마지막 세척 단계 후, 각 반응 튜브에 세척 버퍼 500 µL를 첨가하여 최종 스톡 농도가 mL당 500만 개의 항체 결합 비드가 되도록 하고, 볼텍싱한 다음 반응 튜브를 초음파 처리하여 비드를 분산시킵니다. 세포 계수기 또는 혈구 계수기(hemo cytometer)를 사용하여 결합 반응 후 회수된 비드의 수를 측정합니다. 결합 반응의 회수율은 일반적으로 90% 이상입니다. 어세이 버퍼 내 최종 농도가 µL당 100개의 비드가 되도록 각 세트의 결합 비드 스톡 테스트 용액을 준비하고, FICO erything labeled antis species의 희석액을 준비하여 결합 반응이 성공적으로 이루어졌는지 확인합니다.어세이 버퍼에 4 µg/mL 농도로 희석한 IgG 확인 항체를 준비하고, 라운드 바텀 96-웰 플레이트의 웰 4개씩 총 16개의 웰에 각 테스트 용액 50 µL를 분주합니다. 그다음, 배경값을 측정하기 위해 8개의 웰에는 어세이 버퍼 50 µL를 넣고, 나머지 8개의 웰에는 희석한 확인 항체 50 µL를 첨가합니다. 멀티 채널 피펫으로 여러 번 피펫팅하여 반응물을 부드럽게 혼합합니다.플레이트를 덮고 플레이트 셰이커를 사용하여 상온에서 30분 동안 배양합니다. 플레이트를 자성 플레이트 분리기에 1~2분 동안 놓아 비드를 용액에서 분리합니다. 그런 다음, 분리기에 놓인 상태에서 플레이트를 폐기물 수거함 위로 강하게 뒤집어 액체를 제거합니다.각 웰에 100 µL의 assay buffer를 가하고 SANE를 플레이트에서 동일한 방식으로 제거하여 두 번 세척합니다. 자성 플레이트 분리기를 사용하여 멀티채널 피펫으로 5회 부드럽게 파이펫팅하여 비드를 100 µL의 assay buffer에 재현탁합니다. Magix 기기와 같은 Luminex xap 장비로 분석합니다.이 반응의 형광 신호 강도는 비드 표면에 결합된 단백질 양에 정비례하므로, 비드에 결합된 단백질의 상대적인 양을 신속하게 평가할 수 있습니다. xap 분석에서 가장 효과적인 항체 쌍을 결정하기 위해, 각 비드 세트 10 µL를 분석 버퍼 0.96 mL에 첨가하여 네 가지 비드 세트의 초기 혼합물을 준비합니다. 각 항체를 분석 버퍼로 1 µg/mL가 되도록 희석하여 검출 항체 용액을 준비합니다.마찬가지로 분석 버퍼입니다. R&amp;D Systems TNF alpha 단백질 표준물을 2000 pg/mL로 준비하고, Streptavidin R FICO eryn을 8 µg/mL로 희석합니다. 스크리닝 분석을 위해 CoStar 라운드 바텀 96-웰 플레이트의 16개 웰에 항체가 결합된 비드 혼합물을 각각 50 µL씩 첨가합니다.그런 다음, 배경값을 측정하기 위해 16개의 웰 중 8개 웰에 50 µL의 분석 버퍼를 첨가합니다. 다음으로, 반응을 측정하기 위해 나머지 8개 웰에 50 µL의 TNF alpha 표준물을 피펫팅합니다. 분석 플레이트 쉐이커로 흔들어주며 빛이 차단된 상온에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 4개의 웰에 4가지 검출 항체를 각각 50 µL씩 추가하며, 이때 2개는 배경 웰로, 나머지 2개는 반응 웰로 사용합니다. 모든 웰에 SAPE 시약을 50 µL씩 추가한 후 동일한 조건에서 30분 동안 배양합니다. 동일한 조건에서 다시 15분 동안 배양합니다.플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 둡니다. 그런 다음 분리기에 놓인 상태에서 플레이트를 폐기물 수거함 위로 강하게 뒤집어 액체를 제거합니다. 16개 웰 각각에 assay buffer 100 µL를 피펫팅합니다.그 후 자석 분리를 통해 비드에서 액체를 제거합니다. 다음으로, 16개 각 웰에 assay buffer 100 µL를 추가합니다. 사용자 매뉴얼의 적절한 조작법을 참조하여 Luminex mag picks 기기로 플레이트를 읽습니다.원하는 신호 강도를 충족하는 항체 쌍을 선택하십시오. 최적의 포획 항체를 선택한 후, 해당 항체가 결합된 비드 스톡 100 µL를 분석 버퍼를 사용하여 10 mL로 희석하십시오. 희석된 비드 50 µL를 두 개의 CoStar 라운드 바텀 96웰 플레이트의 78개 웰에 각각 첨가하십시오.각 플레이트는 서로 다른 검출 항체의 성능을 평가하는 데 사용됩니다. 다음으로, 8,000 pg/mL에서 시작하여 4 pg/mL에서 끝나는 12점 표준 곡선을 준비합니다. R&amp;D Systems 제품을 사용하여 수행합니다.TNF Alpha 표준 용액의 각 희석액을 50 µL씩 6회 반복하여 각 플레이트에 분주하고, 배경값을 측정하기 위해 assay buffer 50 µL를 6개 웰에 분주하여 플레이트당 총 78개 웰을 준비합니다. 플레이트를 assay plate shaker로 흔들어주며 빛이 차단된 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 첫 번째 플레이트의 78개 모든 웰에 첫 번째 검출 항체 50 µL를 첨가합니다.두 번째 플레이트에서 두 번째 검출 항체에 대해 동일한 과정을 반복합니다. 동일한 조건에서 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 각 플레이트의 모든 웰에 SAPE 시약 50 µL를 첨가합니다.두 플레이트를 차광 상태에서 15분 동안 흔든 후, 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 둡니다. 분리기에 놓인 상태에서 플레이트를 폐기물 용기 위로 강하게 뒤집어 액체를 제거합니다. 그 다음, 마그네틱 비드에서 액체를 제거하기 전에 플레이트의 78개 웰 각각에 100 µL의 분석 버퍼를 피펫팅합니다.플레이트의 78개 웰에 각각 100 µL의 분석 버퍼를 비드에 추가한 후, 적절한 작동을 위해 사용자 매뉴얼을 참조하여 MagPicks 장비로 플레이트를 분석하십시오. R&amp;D Systems의 human TNF Alpha TNF SF1 a DUO set ELISA 키트에 포함된 지침을 따르십시오. R&amp;D 키트와 함께 제공된 표준 물질에 의해 생성된 반응을 측정하십시오.r and d systems의 포획 및 검출 항체를 다른 벤더의 항체로 대체하여 ELISA 분석을 세 번 더 반복합니다. 단순화를 위해 항체를 벤더별로 짝지어 구성하고, EISA 형식의 요구사항에 따라 세 가지 TNF Alpha 단백질 표준물질 각각을 사용하여 각 쌍을 독립적으로 평가합니다. Luminex Xap 분석은 multiplex 방식으로 수행하여, Mag PLX 미세구체에 결합된 TNF alpha 항체 4가지 세트를 조합함으로써 4가지 포획 항체 모두를 혼합물 형태로 평가하였습니다. 포획 항체들은 4가지 비오틴화 검출 항체 각각과 개별적으로 평가되었으며, 이를 통해 하나의 검출 항체가 4가지 포획 항체 각각과 상호작용하는지를 동시에 결정할 수 있었습니다.분석 결과, R&amp;D Systems DUO 세트의 항체 쌍이 6,183 median fluorescence intensity 또는 MFI 단위의 응답을 나타내어 가장 우수한 성능을 보였습니다. 또한 Millipore와 ABAM의 검출 항체를 RD Systems 포획 항체와 조합했을 때 XAP 분석에서 적절한 응답을 보인 반면, Millipore, ACAM 및 Novus의 포획 항체는 XAP 분석에서 덜 바람직한 응답을 생성하는 것이 관찰되었습니다. 네 가지 항체 쌍을 EISA 형식으로 비교하기 위해 R&amp;D Systems DUO 세트 프로토콜이 사용되었습니다.오늘날 널리 사용되는 전형적인 EIA 프로토콜을 반영하며 XAP 기술에 사용되는 프로토콜과 유사하기 때문에, 모든 항체 쌍에 R&amp;D Systems 프로토콜을 사용하였습니다. EISA 테스트 결과, R&amp;D Systems의 항체 쌍이 다시 한번 가장 좋은 결과를 나타냈습니다. 항체 반응성의 변동성을 평가하기 위해 사용한 Acama의 항체 쌍은 반응이 나타나지 않았으며, Millipore와 Novas의 항체 쌍은 보통 수준의 반응을 보였습니다.표준물질의 경우, 세 곳의 서로 다른 공급업체로부터 제공받은 세 가지의 서로 다른 재조합 TNF alpha 단백질 표준물질을 사용하여 네 쌍의 항체를 모두 테스트하였습니다. 데이터 분석 결과, 세 공급업체의 재조합 TNF alpha 단백질 표준물질이 동등한 결과를 나타냈습니다. R&amp;D Systems의 TNF alpha 단백질은 ELSA 및 XAP 분석의 표준 곡선을 작성하는 데 사용되었습니다.ELI A 분석은 R&amp;D Systems 항체 쌍을 사용하여 수행한 반면, Xap 분석에서는 R&amp;D Systems의 포획 항체와 R&amp;D Systems 또는 Millipore의 검출 항체를 사용하였습니다. R&amp;D Systems의 TNF alpha 단백질을 희석하여 8,000에서 4 pg/mL까지의 농도 범위를 생성하였습니다. R&amp;D Systems의 항체 쌍은 Xap 분석에서 표시된 바와 같이 20,000 MFI 이상의 반응을 보여 예상된 결과를 나타냈습니다.r and d systems 검출 항체 대신 Millipore의 검출 항체를 Xap 분석에 사용했을 때, 반응 값은 RD systems 검출 항체로 얻은 반응 값의 약 30% 수준이었습니다. 이 차트의 녹색 선은 ELISA 표준 곡선을 나타내며, 제조사 권장 TNF alpha 범위는 16 내지 1000 pg/mL였습니다. 분광광도계의 한계로 인해 ELISA 분석의 범위를 넓히는 것은 불가능했습니다.또한, 두 방법의 다이나믹 레인지와 민감도는 로그 스케일로 도식화했을 때 더 잘 나타납니다. EISA 반응의 기울기와 xap 분석의 반응 사이의 명확한 차이를 확인할 수 있으며, 이는 고농도와 저농도 모두에서 ELISA의 TNF alpha 검출 능력이 더 제한적임을 추가로 보여줍니다. 두 가지 기능적 TNF alpha xap 분석의 검출 한계 또는 LOD는, 6회 반복 실험에서 얻은 배경값의 표준편차(SD)의 3배를 더한 값보다 높은 반응 수준이 관찰된 가장 낮은 TNF alpha 농도를 확인하여 근사치로 구하였습니다.여기에서 R&amp;D Systems 쌍을 사용했을 때, 가장 낮은 TNF alpha 농도인 3.91 pg/mL에서 66 MFI의 반응이 나타났으며, 이는 배경값에 3 SD를 더한 기준치보다 높음을 관찰할 수 있습니다. Millipore 검출 항체를 R&amp;D Systems 포획 항체와 함께 사용했을 때, 검출 한계는 7.81 pg/mL 미만이었습니다.이 경우, 두 번째로 낮은 TNF alpha 농도는 17 MFI의 허용 가능한 반응을 생성했으며, 이는 가장 낮은 TNF alpha 농도의 반응에 해당 표준 편차의 3배를 더한 값보다 컸습니다. 이와 유사하게, r and d systems duo set Eliza의 검출 한계는 63에서 31 picograms per milliliter 사이로 추정되었습니다. 이 절차에 따라, xap assay를 더욱 최적화하기 위해 다양한 샘플 매트릭스나 리포터 내 항체 농도를 테스트하는 것과 같은 다른 단계들을 수행할 수 있습니다.

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Research

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