멀티 플렉스 항체 검사 방법을 사용하여 Luminex xMAP 분석에 캡처 엘리사의 전환

다음 실험의 전반적인 목표는 대체 항체 쌍을 평가하면서 TNF 알파 사이토카인에 대해 사전 최적화된 Eliza 분석을 Xap 플랫폼으로 변환하는 것입니다. 이는 ELIZA 키트의 포획 항체를 3개의 다른 후보 포획 항체와 함께 4개의 서로 다른 마이크로스피어 또는 비드 세트에 결합함으로써 달성됩니다. 이 4개의 세트를 사용하면 4개의 개별 검출 항체를 사용하여 4개의 후보 물질 모두를 동시에 테스트하여 최상의 항체 쌍을 결정할 수 있습니다.

다음으로 두 개의 가장 최적의 항체 쌍으로 두 개의 Xap 분석이 구성됩니다. 그런 다음 분석의 성능을 신호 강도, 동적 범위 및 감도와 관련하여 원래 EISA 분석의 성능과 비교합니다. 그 결과, 유사한 항체가 동일한 조건에서 매우 다르게 작용할 수 있으며, Luminex Xap 분석을 사용하여 여러 항체를 동시에 스크리닝할 수 있음을 보여주며, 이는 이 분석이 EISA와 비교할 때 감도와 동적 범위가 증가했음을 보여줍니다.

EIS A와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 xap 기반 면역분석을 통해 연구자가 여러 표적을 테스트하거나 이 경우와 같이 여러 항체를 동시에 테스트할 수 있다는 것입니다. 입증된 최고의 항체를 식별합니다. 시술은 Luminex Corporation의 부과학자인 Erica Lopez가 맡을 것입니다.

서면 프로토콜에 설명된 대로 4개의 포획 항체와 인간 TNF 알파에 특이적인 4개의 검출 항체를 선택하고 준비하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 또한, 포획 항체의 숙주 종에 대한 특이적 확인 항체를 하나 준비합니다. 항체 커플링 키트의 시약을 실온으로 가져옵니다.

커플링 반응을 위해 선택된 비드 영역 번호로 4개의 반응 튜브에 라벨을 붙입니다. mag plex 마이크로스피어의 4개 바이알의 내용물을 표지된 4개의 반응 튜브로 옮깁니다. 500마이크로리터의 활성화 완충액에서 각 비드 세트를 두 번 세척하고 항체 커플링 키트에 설명된 대로 sulf ONHS 및 EDC 용액으로 각 비드 세트를 활성화합니다.

사용 설명서 회전기에서 20분 배양 후 500마이크로리터의 활성화 버퍼로 현재 활성화된 비드로 이전 세척 단계를 총 3회 반복합니다. 각 세척에 대해 4개의 개별 500마이크로리터 용액을 준비합니다. 각각 7.5마이크로그램의 포획 항체 불활성화 완충액을 함유하고 있습니다.

이 4가지 포획 항체 용액을 각각의 반응 튜브에 추가합니다. 각 튜브를 즉시 소용돌이치고 회전체에서 2시간 동안 배양합니다. 항체 커플링 키트에 포함된 500마이크로리터의 세척 버퍼를 사용하여 이제 커플이 된 비드로 세척 단계를 총 3회 반복합니다.

최종 세척 단계 후, 각 반응 튜브에 500마이크로리터의 세척 완충액을 추가하여 밀리리터 와류당 500만 개의 항체 결합 비드의 최종 스톡 농도를 제공한 다음 반응 튜브를 초음파 처리하여 비드를 분산시킵니다. 세포 계수기 또는 혈구 분석기를 사용하여 결합 반응 후 회수된 beads의 수를 계산합니다. 커플링 반응으로부터의 회수율은 일반적으로 90% 이상이며, 분석 버퍼에서 마이크로리터당 100개의 비드의 최종 농도로 각 세트에 대해 커플링 비드 스톡의 테스트 용액을 준비하여 커플링 반응이 성공적이었는지 확인하고, FICO erything labeled antis species의 희석을 준비합니다.

분석 완충액에서 밀리리터당 4마이크로그램의 IgG 확인 항체는 각 테스트 용액 50마이크로리터를 둥근 바닥 96웰 플레이트의 4웰로 총 16웰로 분취합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 분석 버퍼를 8개의 웰에 추가하여 배경을 측정하고 50마이크로리터의 희석된 확인 항체를 나머지 8개의 웰에 추가합니다. 멀티 채널 파이펫터로 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 반응을 부드럽게 혼합합니다.

접시를 덮고 접시 셰이커에 실온에서 30분 동안 배양합니다. 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1-2분 동안 올려 놓아 용액에서 비드를 빼냅니다. 그런 다음 폐기물 용기 위의 분리기에 있는 동안 플레이트를 강제로 뒤집어 액체를 제거합니다.

100마이크로리터의 분석 버퍼를 추가하고 유사한 방식으로 플레이트에서 SANE을 제거하여 각 웰을 두 번 세척합니다. 마그네틱 플레이트 분리기를 사용하여 멀티 채널 파이펫터로 5회 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 100마이크로리터의 분석 버퍼에 비드를 다시 매달아 놓습니다. magix 기기와 같은 luminex xap 기기에서 분석합니다.

이 반응의 형광 신호의 강도는 비드 표면의 단백질 양에 정비례하며, 비드에 결합된 단백질의 상대적인 양을 신속하게 평가할 수 있습니다. xap 분석에서 가장 효과적인 항체 쌍을 결정하려면 0.96ml의 분석 버퍼에 각각 10마이크로리터를 추가하여 4개의 비드 세트 모두의 초기 혼합물을 준비합니다. 분석 버퍼에서 각 항체를 밀리리터당 1마이크로그램으로 희석하여 검출 항체 용액을 준비합니다.

또한 분석 버퍼입니다. R 및 D 시스템 TNF 알파 단백질 표준물질을 밀리리터당 2000피코그램으로 준비하고 Streptavidin R FICO 에린을 밀리리터당 8마이크로그램으로 희석합니다. 스크리닝 분석을 위해 50마이크로리터의 항체 결합 비드 혼합물을 CoStar 라운드 바닥 96웰 플레이트의 16웰 각각에 추가합니다.

그런 다음 16개의 웰 중 8개에 50마이크로리터의 분석 버퍼를 추가하여 배경을 측정합니다. 다음으로 TNF 알파 표준물질 50마이크로리터를 다른 8개의 웰에 피펫팅하여 반응을 측정합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 1시간 동안 배양하는 동안 분석 플레이트 셰이커에서 흔듭니다.

그런 다음 4개의 검출 항체 각각을 50마이크로리터의 4개의 웰에 추가하며, 그 중 2개는 백그라운드 웰이고 2개는 반응 웰입니다. 모든 웰에 50마이크로리터의 SAPE 시약을 첨가한 후 동일한 조건에서 30분 동안 배양합니다. 같은 조건에서 15분 동안 다시 배양합니다.

플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 놓습니다. 그런 다음 폐기물 용기 위의 분리기에 있는 동안 플레이트를 강제로 뒤집어 액체를 제거합니다. 100 마이크로 리터의 분석 버퍼를 16 개의 웰 각각에 피펫팅합니다.

그런 다음 자기 분리를 사용하여 비드에서 액체를 제거합니다. 다음으로, 16개의 웰 각각에 100마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다. 올바른 작동을 위해 사용 설명서를 참조하여 Luminex 매그 픽 기기로 플레이트를 읽으십시오.

원하는 신호 강도를 충족하는 항체 쌍을 선택합니다. 항체를 포착할 수 있는 최상의 항체를 선택한 후, 분석 버퍼를 사용하여 해당 항체 결합 비트 스톡을 10ml로 100마이크로리터로 희석합니다. 50마이크로리터의 희석된 비드를 2개의 CoStar 원형 바닥 96웰 플레이트 78웰에 추가합니다.

각 플레이트는 서로 다른 검출 항체의 성능을 평가하는 데 사용됩니다. 다음으로, 밀리리터당 8, 000피코그램에서 시작하여 밀리리터당 4피코그램으로 끝나는 12포인트 표준 곡선을 준비합니다. R 및 D 시스템과 함께.

TNF 알파 표준은 각 플레이트에 각 희석액의 50마이크로리터 복제물 6개를 추가하고, 플레이트당 총 78웰에 대해 각각 50마이크로리터의 분석 버퍼를 배경으로 하는 6개의 웰을 추가합니다. 빛으로부터 보호되는 실온에서 플레이트를 1시간 동안 배양하는 동안 분석 플레이트 셰이커에서 흔듭니다. 그런 다음 첫 번째 검출 항체 50마이크로리터를 첫 번째 플레이트의 78웰 모두에 추가합니다.

두 번째 플레이트의 두 번째 검출 항체에 대해 반복합니다. 같은 조건에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 SAPE 시약을 각 플레이트의 모든 웰에 추가합니다.

빛으로부터 보호된 두 개의 플레이트를 15분 동안 흔든 후 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 1분 동안 놓습니다. 폐기물 용기 위의 분리기에 있는 동안 플레이트를 강제로 뒤집어 액체를 제거합니다. 다음으로, 100 μl의 분석 버퍼를 플레이트 상의 78 웰 각각에 피펫으로 넣은 후 자성 비드로부터 액체를 제거하기 전에 한다.

플레이트에 있는 78개의 웰 각각에 있는 비드에 100마이크로리터의 분석 버퍼를 추가한 후 올바른 작동을 위해 사용 설명서를 참조하여 매그 픽 기기의 플레이트를 분석합니다. r 및 d 시스템에 포함된 지침에 따라 human TNF Alpha T NF SF one a DUO 세트 ELI A 키트. r 및 d 키트와 함께 제공되는 표준에 의해 생성된 응답을 측정합니다.

ELI a assay를 3회 더 반복하여 r 및 d 시스템 capture 및 detection 항체를 다른 공급업체의 항체로 대체합니다. 단순화를 위해 공급업체별로 항체를 쌍을 이루고, EISA 형식의 요구에 따라 세 가지 TNF 알파 단백질 표준물질 각각을 사용하여 각 쌍을 독립적으로 평가합니다. Luminex Xap 분석은 Mag PLX 마이크로스피어에 결합된 4세트의 TNF 알파 항체를 결합하여 4개의 포획 항체 모두를 혼합물로 평가하기 위해 멀티플렉스로 수행되었으며, 포획 항체는 4개의 비오틴화 검출 항체 각각과 함께 개별적으로 평가되어 하나의 검출 항체와 4개의 포획 항체 각각과의 상호 작용이 동시에 결정될 수 있었습니다.

그 결과, r 및 d 시스템 DUO 세트의 항체 쌍이 6, 183 중앙값 형광 강도 또는 MFI 단위에서 결과 반응으로 가장 잘 수행되었음을 나타냅니다. 또한 Millipore 및 ABAM의 검출 항체는 RD 시스템 포획 항체와 결합할 때 XAP 분석에서 합리적인 반응을 제공하는 것으로 관찰되었으며, Millipore, ACAM 및 Novus의 포획 항체는 XAP 분석에서 덜 바람직한 반응을 생성했습니다. r 및 d 시스템 DUO 세트 프로토콜은 EISA 형식의 4개 항체 쌍을 비교하는 데 사용되었습니다.

r 및 d 시스템 프로토콜은 오늘날 널리 사용되는 일반적인 EIA 프로토콜을 반영하고 xap 기술과 함께 사용되는 프로토콜과 유사하기 때문에 모든 항체 쌍과 함께 사용되었습니다. EISA 검사는 r과 d 시스템의 항체 쌍이 다시 최상의 결과를 제공하는 것을 보여주었습니다. Acam의 항체 쌍은 반응을 일으키지 않았으며, Millipore와 Novas의 항체 쌍은 항체 반응성의 변화를 평가하기 위해 중간 정도의 반응을 보였습니다.

이 표준물질을 통해 4개의 항체 쌍 모두를 3개의 서로 다른 공급업체에서 제공하는 3개의 서로 다른 재조합 TNF 알파 단백질 표준물질로 테스트했습니다. 이 데이터는 3개 공급업체의 재조합 TNF 알파 단백질 표준물질이 동일한 결과를 제공했음을 보여줍니다. r 및 d 시스템의 TNF 알파 단백질을 사용하여 ELSA 및 XAP 분석을 사용하여 표준 곡선을 생성했습니다.

ELI A 분석은 r 및 d 시스템 항체 쌍으로 수행된 반면, xap 분석은 r 및 d 시스템의 포획 항체와 r 및 d 시스템 또는 Millipore의 검출 항체를 활용했습니다. r와 d 체계에서 TNF 알파 단백질은 밀리리터 당 단지 8, 000에서 4 피코그램에 농도의 범위를 일으키기 위하여 묽게 되었다. r 및 d 시스템의 항체 쌍은 그림과 같이 20, 000 MFI 이상의 반응으로 Xap 분석에서 예상되는 결과를 생성했습니다.

R&D 시스템 검출 항체 대신 Millipore의 검출 항체를 Xap 분석과 함께 사용했을 때, 반응은 RD 시스템의 검출 항체로 얻은 반응의 약 30%였습니다. 이 차트의 녹색 선은 ELA의 표준 곡선을 나타내며, ELA의 권장 TNF 알파 범위는 밀리리터당 16-1000피코그램입니다. 분광 광도계의 한계로 인해 Eliza 분석의 범위를 늘릴 수 없었습니다.

또한, 두 방법의 동적 범위와 민감도는 로그 스케일로 표시할 때 더 잘 설명됩니다. EISA 반응의 기울기와 xap 분석의 반응 사이의 명확한 차이를 볼 수 있으며, 더 나아가 더 높은 농도와 더 낮은 농도 모두에서 EL iza로 TNF 알파를 검출하는 데 더 제한적인 능력을 나타냅니다. 두 가지 기능적 TNF alpha xap 분석에 대한 검출 한계 또는 LOD는 관찰된 반응 수준이 배경보다 큰 경우 가장 낮은 TNF 알파 농도를 식별하고 6회 반복에서 표준 편차 또는 SD의 3배를 더한 값을 식별하여 근사화했습니다.

여기서 r 및 d 시스템 쌍을 사용할 때 밀리리터당 3.91피코그램에서 가장 낮은 TNF 알파 농도가 66MFI의 반응을 생성했음을 관찰할 수 있으며, 이는 배경에 3개의 SD 회의를 더한 응답보다 큽니다. 이 기준. 밀리포어 검출 항체를 r 및 d 시스템 포획 항체와 함께 사용했을 때 검출 한계는 밀리리터당 7.81피코그램 미만이었습니다.

이 경우, 허용 가능한 반응에서 생성된 두 번째로 낮은 TNF 알파 농도는 17MFI의 허용 가능한 반응에서 가장 낮은 TNF 알파 농도의 반응에 표준 편차의 3배를 더한 반응보다 큽니다. 마찬가지로, r 및 d 시스템 듀오 세트 Eliza의 검출 한계는 밀리리터당 63에서 31 피코그램 사이로 추정되었습니다. 이 절차에 따라 xap 분석을 더욱 최적화하기 위해 테스트, 다양한 샘플 매트릭스 또는 리포터의 항체 농도와 같은 다른 단계를 수행할 수 있습니다.