구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

이 프로토콜의 전반적인 목표는 비드 기반 멀티플렉스 분석을 사용하여 Schirmer Strips에서 수집한 인간 눈물 샘플의 사이토카인 프로파일을 연구하는 것입니다. 이 방법은 다양한 안구 질환에서 사이토카인의 역할과 같은 안과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 더 적은 양의 샘플에서 여러 분석물을 연구하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Praveen Balne입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 피험자로부터 눈물을 채취한 후 눈물 흐름 스트립을 0.5cm 길이로 자르고 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 30마이크로리터의 분석 버퍼를 추가하고 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음 14, 1 분 동안 000 시간 g에 관을 원심 분리하십시오. 상등액을 다른 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 스트립을 버립니다. 그런 다음 샘플이 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓고 용출된 눈물 샘플을 즉시 사이토카인 프로파일링에 사용합니다.

비드 기반 멀티플렉스 분석을 수행하려면 모든 시약을 실온에 놓고 5-10초 동안 와류로 가열합니다. 분석 전에 용출된 눈물 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관한 경우 얼음에서 냉동 눈물 추출물을 해동하고 샘플을 1, 000회 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 인간 사이토카인 표준물질 QC-1, QC-2 및 시료 작업을 위한 수직 구성의 분석 워크시트를 준비합니다.

플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 1X 세척 버퍼를 추가하고 플레이트 씰러로 밀봉합니다. 그런 다음 실온에서 플레이트 셰이커에 플레이트를 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 플레이트를 뒤집어 1X 세척 버퍼를 디캔팅하고 흡수성 수건을 여러 번 두드려 웰에 남아 있는 세척 버퍼를 제거합니다.

그런 다음 작동하는 각 인간 사이토카인 표준물질 QC-1, QC-2, 분석 완충액이 있는 블랭크 및 샘플을 25마이크로리터씩 적절한 웰에 추가합니다. 각 웰에 25마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 웰에 25마이크로리터의 1X 항체 비드 칵테일 용액을 추가합니다.

항체 비드 용액은 빛에 민감하므로 플레이트를 밀봉하고 알루미늄 호일과 플레이트 덮개로 덮어 분석 중에 빛으로부터 보호하십시오. 섭씨 4도의 셰이커에서 접시를 밤새 배양합니다. 다음 날, 자동 마그네틱 플레이트 세척기의 플레이트 랙에 플레이트를 놓고 1분 동안 그대로 두어 우물 바닥에 마그네틱 비드를 고정합니다.

웰 내용물을 흡입하고 자동 마그네틱 플레이트 세척기를 사용하여 웰당 200마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 플레이트를 1분 동안 그대로 두었다가 이전과 같이 웰 내용물을 흡인하고 한 번 더 세척을 반복합니다. 각 웰에 25마이크로리터의 검출 항체 용액을 추가합니다.

접시를 밀봉하십시오. 알루미늄 호일과 플레이트 커버로 덮고 셰이커에 실온에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 25마이크로리터의 Streptavidin Phycoerythrin 용액을 넣고 플레이트를 밀봉하고 덮은 후 셰이커에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

배양 후 플레이트를 마그네틱 플레이트 와셔에 놓고 1분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 우물 내용물을 흡인하고 우물당 200마이크로리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 1분 동안 그대로 두었다가 다시 한 번 세척을 반복하기 전에 웰 내용물을 흡인하십시오.

각 웰에 150마이크로리터의 피복 유체를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 5분 동안 셰이커에 올려 항체 비드를 재현탁시킨 후 플레이트를 판독하고 사이토카인 농도를 분석합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 분석 플레이트를 읽으려면 batches 페이지를 열고 기존 프로토콜에서 새 batch 탭 생성을 클릭합니다.

일괄 처리 이름 상자에 일괄 처리 이름을 입력하고 선택적 설명 입력 상자에 일괄 처리에 대한 설명을 입력합니다. 이전에 생성된 프로토콜을 클릭하고 다음을 클릭합니다. 다음으로 열리는 탭은 표준 및 컨트롤 탭입니다.

분석 표준물질에 대한 세부 정보를 확인하고 다음을 선택합니다. plate layout 탭에서 배치에 대한 well 명령을 할당하고 Save(저장)를 클릭하여 배치 정보를 보류 중인 배치 목록에 저장합니다. bead-based multiplex assay plate reader에 플레이트를 로드하고 pending batch list에서 배치를 실행합니다.

RBX 변환 소프트웨어를 실행하고 지수 파일 선택에서 비드 기반 멀티플렉스 분석 소프트웨어에서 생성된 csv 파일을 선택합니다. 그런 다음 생성 버튼을 클릭합니다. rbx 파일이 선택한 출력 폴더에 저장됩니다.

이제 분석 소프트웨어를 실행하고 rbx 파일을 엽니다. 그런 다음 4PL-5PL 곡선 맞춤을 사용하여 표준 곡선을 최적화합니다. 표준 곡선을 최적화하려면 표준 곡선 탭에서 회귀 유형, 물류 5PL을 선택하고 변환 로그 X, 선형 Y에 액세스합니다. 그런 다음 농도 범위 선을 표시하고, 알 수 없는 샘플을 표시하고, 제어 샘플을 표시하고, 모든 분석물에 적용하고, 최적화 후 보고서를 표시하도록 다음 상자를 선택합니다.

자동 최적화를 위해 최적화 버튼을 클릭합니다. enter sample info(샘플 정보 입력) 탭에서 샘플 ID에 레이블을 지정합니다. 마지막으로, 보고서 테이블 탭에서 관찰된 농도를 얻고 보고서 테이블 내보내기를 클릭하여 추가 분석을 위해 스프레드시트 파일에 데이터를 생성합니다.

36세에서 52세 사이의 건강한 남성 4명의 눈 8개에서 눈물 샘플을 채취했습니다. bead-based multiplex assay를 사용하여 분석된 41개의 사이토카인 중 31개가 모든 tear 샘플에서 검출되었습니다. 예를 들어, IL-17A, MIP-1b 및 TNFa는 4명의 피험자의 7개 눈에서 검출되었고, IL-4는 4명의 피험자의 6개 눈에서 검출되었습니다.

또한, 3명의 피험자의 6개의 눈에서 인터페론 감마가 검출되었습니다. 인터루킨-1a는 3명의 피험자의 5개 눈에서 검출되었다. 에오탁신(Eotaxin)과 인터루킨-9(Interleukin-9)은 2명의 피험자의 3개의 눈에서 검출되었다.

인터루킨-3는 한쪽 눈에서 검출되었고 MIP-1a는 어느 샘플에서도 검출되지 않았다. 검출된 41개의 사이토카인의 평균 플러스 또는 마이너스 표준 편차 농도가 이 산점도에 설명되어 있습니다. 인터루킨-1ra는 모든 샘플에서 높게 발현되었습니다.

사이토카인 IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, 프랙토킨, 인터루킨-a, EGF, PDGF-BB, VEGF 및 G-CSF도 밀리리터당 나노그램 수준으로 높게 발현되었으며 나머지 사이토카인은 밀리리터당 피코그램 수준으로 발현되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 눈물 사이토카인의 가장 낮은 측정 농도는 TNF-a였으며, 평균 ±27.25 플러스 또는 마이너스 표준 편차는 밀리리터당 19.97 피코그램이었습니다. 모든 샘플에서 검출된 31개의 사이토카인에서 T 검사에서 오른쪽 눈과 왼쪽 눈의 농도 차이가 통계적으로 유의한 차이를 보인 것은 없었습니다.

일단 마스터하면 이 기술을 제대로 수행하면 1-1/2일 안에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 눈물 사이토카인 프로파일링을 위한 bead-based multiplex assay를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.