Name: 구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 배우세요 구슬 기반 다중 분석법을 이용한 인간 눈물 사이토카인 프로파일링 방법을 안과 질환 연구에 활용하는 기법입니다. 이 방법은 소량 샘플로 다중 분석이 가능하여 눈 건강 연구에 유용합니다.

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연구 작업 탄 딱 셍 병원 맞춤형 씨앗 자금 프로그램 2015;에서 센터 그랜트에 의해 지원 되었다 싱가포르 눈 연구 연구소 파일럿 그랜트와 탄 딱 셍 병원 피치 기금 부여합니다.

이 연구에 사용 되는 프로토콜 탄 딱 셍 병원, 싱가포르의 기관 검토 위원회에 의해 승인 했다.
 1. Cytokine 분석 눈물 <ol><li>눈물의 컬렉션: <ol><li>주제는 검사의 자에 편안 하 게 앉아 고 머리 받침에 대 한 자신의 머리를 물어.</li>
		<li>주제 조회, 신중 하 게 (Whatman 여과 지 no. 41의 만든) Schirmer 스트립을 열고 및 스트립의 둥근된 끝에 눈의 열 등 한 fornix 놓고 5 분 동안 눈을 지시를 요구 하십시오. 수집 하는 동안 눈물 눈 표면 접촉을 최소화 하기 위해 주의 걸릴. 30</li> <li>스트립을 제거 하 여 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 자신의 눈을 열어 주제 요청. 즉시 전송 튜브 실험실 또는 상점에서-80 o C cytokine 프로 파일링 테스트까지.</li>
	</ol></li> <li>눈물 흐름 스트립에서 눈물 샘플의 차입: <ol><li>눈물 흐름 스트립 (표준화 테스트할 눈물의 양)을 0.5 c m의 길이로 잘라 멸 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에.</li>
		<li>추가 30 µ l의 버퍼를 시험 하 고 1 분에 대 한 14000 x g에서 튜브 centrifuging 뒤 5 분 동안 실 온에서 품 어</li>
		<li>다른 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 스트립을 폐기. 얼음에 튜브를 포함 하는 샘플을 놓고 cytokine 프로 파일링 eluted 눈물 샘플을 즉시 사용.</li>
	</ol></li> <li>시 약의 준비: 참고: 41 analytes 구슬 기반 다중 분석 결과 의해 각 샘플에서 테스트 하는 인터 루 킨 (IL)-1α, IL 1β, IL Rα, 일리노이-2, 일리노이-3, 일리노이-4, IL-5, 일리노이-6, 일리노이-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13 일-15, IL-17A, 인터페론-알파 (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-감마-유도할 수 있는 단백질 10 (IP-10, CXCL10), 대 식 세포에서 파생 된 chemokine (MDC), 대 식 세포의 염증 성 단백질 (MIP)-1α 및 MIP-1β, monocyte 혈 단백질 (MCP)-1, TNF-β, 성장 규제 oncogene (촉진제), 종양 성장 인자 알파 (TGF-α), 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), 표 피 성장 인자 (EGF), 섬유, MCP-3, 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 성장 인자 (FGF)-2, 혈소판 파생 된 성장 인자 (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, granulocyte 콜로 니 자극 인자 (G-CSF), granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF), eotaxin, fractalkine, 녹는 CD40 ligand (sCD40L), Fms 처럼 티로신 키 니 아 제 3 ligand (Flt-3 L) 및 활성화 시 규제, 정상적인 T 세포 표현 및 분 비 단백질 (RANTES).
	<ol><li>실내 온도 (20-25 o C)을와 동 항 체 비드 솔루션 (50 X) 튜브 1 분에 대 한 튜브를가지고</li>
		<li>분석 결과에 필요한 우물의 수를 계산 하 고 전체 항 체 비드 칵테일 솔루션 (잘 당 25 µ L) 및 분석 결과에 필요한 각 항 체 비드 솔루션 (50 X)의 수량 계산.</li>
		<li>비드 희석제의 남은 금액을 추가 하 여 원하는 최종 볼륨을 각 항 체 비드 솔루션 및 채우기의 계산된 금액을 추가 하 여 칵테일 솔루션을 준비 합니다. 칵테일에 각 항 체의 최종 농도가 1 X 인지 확인 합니다. 항상 준비 하는 적어도 20 %pipetting 오류가 발생할 경우 칵테일 솔루션의 추가 볼륨. 
		참고: 예를 들어, 96-잘 분석 결과 3000 µ L 항 체 비드 칵테일 솔루션의 준비. 각 항 체 비드 솔루션의 필요한 금액 = 3000/재고 농도의 각 항 체 비드 솔루션; 3000/50 = 각 항 체 비드 솔루션 <ol><li>41 항 체 비드 솔루션의 추가 60 µ L의 60 µ L (60 X 41 = 2460 µ L) 칵테일으로 병 하 고 최종의 3000 µ L을 항 체 비드 혼합물에 구슬 희석제 솔루션의 540 µ L를 추가 작업 솔루션 (X 1).</li>
			<li>를 사용 하기 전에 제대로 구슬 칵테일 솔루션 혼합. 분석 결과 최대 30 일 동안 2-8 o C에서 나머지 볼륨을 저장 후.</li>
		</ol></li> <li>250 µ L 이온된 물 QC 1 및 QC 2 주식에 추가 하 여 품질 컨트롤 (QC)를 준비.</li>
		<li>혼합 제대로 반전 병 여러 번와 소용돌이 10 미 전송에 대 한 솔루션을 제대로 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브를 표시 하 고 최대 30 일 동안 사용 될 수 있는-20 ° C에서 나머지 솔루션 저장.</li>
		<li>준비 10 X 30 ml 270 mL 이온된 수를 추가 하 여 워시 버퍼 버퍼 솔루션을 세척 하 고 잘 혼합 (희석, 전에 실내 온도에 10 X 버퍼를가지고 혼합 하 여 모든 소금 침전을 용 해). 최대 30 일 동안 사용 될 수 있는 2-8 ° C에 사용 하지 않는 워시 버퍼 (1 X) 저장.</li>
		<li>재고 유리병에 250 µ L 이온된 수를 추가 하 여 인간의 cytokine 표준 주식 (모든 analytes의 10000 pg/mL)을 준비 합니다. 여러 번와 소용돌이 10 유리병을 반전 하 여 잘 혼합 미 수 10 분 동안 서 서 하 고 제대로 표시 된 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 재고 솔루션을 전송. 분석 결과, 후-20 ° c, 최대 30 일 동안 사용할 수 있는 나머지 솔루션 저장.</li>
		<li>작업 인간의 cytokine 표준 5 직렬 희석 하 여 준비 (50 µ L-&#62; 200 µ L) 2000 년을 분석 결과 버퍼 400, 80, 16, 및 3.2 pg/mL.</li>
		<li>표준 준비 후 60 분 이내 작업 표준을 사용 하 고 분석 결과 버퍼를 사용 하 여 빈/배경으로 (-pg/mL).</li>
	</ol></li> <li>다중 분석 결과 기반으로 구슬에 의해 프로 파일링 Cytokine: <ol><li>결정 96 잘 접시에 그들을 추가 하기 전에 5-10 초 동안 실내 온도 소용돌이에 모든 시 약을가지고. O C 분석 결과, 이전 얼음에 얼어붙은 눈물 추출 물 해 동 및 5 분에 대 한 1000 X g에서 원심 eluted 눈물 샘플-80에 저장 된 경우</li>
		<li>인간의 cytokine 표준 작업에 대 한 수직 구성 분석 결과 작업 시트 준비 [0 (비어 있음), 3.2, 16, 80, 400, 2000, 그리고 10000 pg/mL], QC2와 샘플 QC1.</li>
		<li>워시 버퍼 각 X 1의 추가 200 µ L 접시의 잘, 플레이트 마감재와 인감 및 실내 온도 (20-25 o C) 10 분 대에 판 통에 그것을 유지합니다</li>
		<li>접시를 반전 하 여 1 X 워시 버퍼를 가만히 따르다을 누릅니다 그것 흡수 성 수건에 여러 번 우물에서 어떤 잔여 양의 워시 버퍼를 제거 하.</li>
		<li>추가 25 µ L의 각 작업 인간의 cytokine 표준, QC1, QC2, 빈 (분석 결과 버퍼)와 적절 한 우물에 샘플.</li>
		<li>각 우물에 분석 결과 버퍼의 추가 25 µ L.</li>
		<li>1 X의 추가 25 µ L 항 체 비드 칵테일 솔루션 각 우물에. 빛에 민감한 항 체 비드 솔루션으로, 플레이트 플레이트 마감재와 밀봉 하 고 분석 결과 동안 빛에서 그것을 보호 하기 위해 알루미늄 호 일 커버.</li>
		<li>4 o C 하룻밤에 통에서 접시를 품 어.</li>
		<li>자동 자석 접시 세탁기의 접시 선반에 접시를 놓습니다. 우물의 바닥에 자석 구슬을 정착 잘 내용을 발음을 1 분 동안 앉아 보자. 잘 당 워시 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 그것을 1 분 동안 앉아 다음 잘 내용을 발음. 다시 한번 세척을 반복 (접시 세척 키트 제조 업체에 따라 &#39; s 지침).</li>
		<li>각 탐지 항 체 솔루션의 추가 25 µ L 잘, 접시를 봉인, 알루미늄 호 일, 그것을 커버 하 고 통에 60 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>추가 Streptavidi의 25 µ L각 음에 n Phycoerythrin 솔루션 인감 접시, 알루미늄 호 일, 커버와 통에 30 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>자석 접시 세탁기에 접시를 놓습니다. 그것은 1 분 동안 앉아 다음 잘 내용을 발음 하자. 잘 당 워시 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 그것은 1 분 동안 앉아 다음 잘 내용을 발음 하자. 다시 한번 세척 반복.</li>
		<li>Resuspend 항 체 비즈를 실 온에서 5 분 통에 접시를 각각 잘 칼 집 액체의 추가 150 µ L.</li>
		<li>접시는 비드를 사용 하 여 즉시 다중 분석 결과 플레이트 리더를 기반으로 읽었고 5 매개 변수 커브 피팅 알고리즘을 사용 하 여 사이토카인 농도 분석. 눈물 cytokine 프로 파일링의 흐름 회로도 그림 1에 표시 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>분석 결과 플레이트 (악기 설정) 및 데이터 분석: <ol><li>구슬에 스위치 기반 다중 분석 결과 리더와 사전 따뜻한 30 분에 대 한 레이저</li>
		<li>구슬 기반 다중 분석 소프트웨어를 시작합니다. 아래는 &#39; 자동 유지 보수 &#39; 탭을 선택은 &#39; 교정 확인 &#39; 옵션. 지정 된 우물에 각 시 약의 소용돌이 각 시 약 유리병 교정 및 검증 구슬의 30 s. 장소 5에 대 한 삭제 합니다. 이온을 제거 된 물, 70% 에탄올에 채워 지정된 저수지.</li>
		<li>만들기 새 프로토콜 <ol><li>열는 &#39; 프로토콜 &#39; 페이지 그리고는 &#39; 프로토콜 &#39; 클릭 &#34; 만들 새로운 ProtocolŔ는 &#39; 설정 &#39; 탭 열립니다.</li>
			<li>에 &#39; 이름 &#39; 상자는 프로토콜의 이름을 입력 합니다.</li>
			<li>의 오른쪽 상자에 설명을 입력 합니다 &#39; 이름 &#39; 상자.</li>
			<li>에 &#39; 버전 &#39; 상자는 프로토콜의 버전을 입력 합니다.</li>
			<li>에 &#39; 제조 업체 &#39; 상자는 프로토콜에 대 한 제조 업체 정보를 입력 합니다.</li>
			<li>정의 설정에는 &#39; 수집 설정 &#39; 섹션을 다음과 같습니다. 설정 &#39; 볼륨 &#39;: 100 µ L, &#39; 제한 시간 &#39;: 60 s; &#39; DD 게이팅 &#39;: 8000 15000; &#39; 기자 이득 &#39;: 표준 PMT; &#39; 유형 구슬 &#39;: 마그네틱 비드.</li>
			<li>정의 설정에는 &#39; 분석 설정 &#39; 섹션, 선택 &#39; 정량 &#39; 분석 유형으로. 설정 &#39; 표준의 번호 &#39;: 6; &#39; 컨트롤의 번호 &#39;: 0; 진드기는 &#39; 복제의 의미 &#39; 상자; 
			진드기는 &#39; 결과 분석 하는 샘플을 수집 하는 동안 &#39; 상자.</li>
			<li>클릭 &#34; NextŔ는 &#39; Analytes &#39; 열립니다 탭, 번호 분석 표에 원하는 analytes (ID 비드)에 클릭.</li>
			<li>클릭 하 고 해당 분석 이름을 입력은 &#39; 이름 &#39; 분석 표의 오른쪽 열 (analytes &#39; 이름 및 해당 구슬 지역 세부 정보는 표 1에서 언급 했다).</li>
			<li>클릭에서 원하는 단위 (예: pg/mL)를 입력 하 고는 &#39; 단위 &#39;의 왼쪽에 상자는 &#39; 적용 모든 &#39; 버튼. 다음을 클릭 합니다 &#34; 모든 적용 &#34;.</li>
			<li>클릭 하 고 유형 원하는 구슬 (즉, 50)에서 각 분석에 대 한 카운트는 &#39; Count &#39; 상자. 클릭 &#34; 모든 &#34;.</li>
			<li>클릭 &#34; NextŔ 플레이트 레이아웃 탭이 열립니다. 표준 및 선택에 대 한 웰 스 강조 &#34; 2 &#34; 아래 수를 복제 하 고 클릭할는 &#34; S &#34; 표준 단추. 이 단계를 반복 하는 배경에 대 한 &#34; B &#34; 및 샘플 &#34; U &#34; 우물.</li>
			<li>클릭 &#34; 저장 &#34;.</li>
		</ol></li> <li>새로운 표준/제어 많은 만들 <ol><li>오픈는 &#39; 프로토콜 &#39; 페이지, 그리고는 &#39; 표준 &#38; 컨트롤 &#39; 클릭 &#34; 새로운 표준/제어 많은 만들 &#34;.</li>
			<li>열기는 &#39; 프로토콜 선택 &#39; 상자. 1.5.3 단계에서 만든 프로토콜을 선택 하십시오.</li>
			<li>기준의 정보에 따라 키: 성병/Ctrl 키트 번호, 성병/Ctrl 키트 이름, 만료, 및 제조 업체.</li>
			<li>키 각 분석 (즉, 10000 pg/mL)에 대 한 높은 기준 값에. 5 희석에서 키를 클릭 &#34; 적용 모든 &#34; 기준의 나머지 부분에 대 한 예상된 농도 자동으로 생성 하.</li>
			<li>클릭 &#34; 저장 &#34;.</li>
		</ol></li> <li>만들기 기존 프로토콜에서 새로운 일괄 처리 <ol><li>오픈는 &#39; 배치 &#39; 페이지와 클릭 합니다 &#34; 기존 프로토콜에서 새로운 탭을 만드는 &#34;.</li>
			<li>에 배치 이름을 입력은 &#39; 일괄 처리 이름 &#39; 상자에 일괄 처리에 대 한 설명을 입력 하 고는 &#39; 입력 옵션 설명 &#39; 상자.</li>
			<li>이전 (1.5.3 단계)에서 생성 하는 프로토콜을 클릭 합니다.</li>
			<li>클릭 &#34; NextŔ는 다음 탭이 있는 &#39; 성병 &#38; Ctrls &#39; 탭 분석 결과 표준 및 선택의 세부 사항을 볼 &#34; 다음 &#34;.</li>
			<li>에 &#39; 접시 레이아웃 &#39; 탭,이 일괄 처리에 대 한 잘 명령을 할당을 클릭 &#34; 저장 &#34; 배치 정보를 저장 하는 &#39; 보류 중인 일괄 처리 &#39; 목록.</li>
			<li>구슬 기반 다중 분석 결과 플레이트 리더에 접시를 로드, 5 분 동안 그것을 동요 하 고 보류 중인 일괄 처리 목록에서 일괄 처리를 실행. 인수 데이터.csv 파일 형식으로 저장 됩니다.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>데이터 분석 <ol><li>rbx 변환 소프트웨어를 사용 하 여.rbx 파일 (결과 데이터 파일) 형식으로 구슬 기반 다중 분석 소프트웨어에서 생성 된.csv 파일을 변환. 변환 소프트웨어를 실행, 선택 xPONENT 파일에서.csv 파일을 선택 하 고 클릭 합니다 &#34; 생성 &#34; 단추; .rbx 파일을 선택 된 출력 폴더에 저장 됩니다.</li>
		<li>분석 소프트웨어를 시작 하 고.rbx 파일을 엽니다.</li>
		<li>는 4PL/5PL 곡선 적합을 사용 하 여 표준 곡선을 최적화 합니다.
		<ol><li>선택에서 다음은 &#39; 표준 곡선 &#39; 탭: &#39; 회귀 유형 &#39;: &#39; 물류-5PLƆ &#39; 축 변환 &#39;: &#39; Log(x)-선형 (y) Ɔ 진드기는 &#39; 광 범위 라인 표시 &#39; 상자, 체크는 &#39; 표시 알 수 없는 샘플 &#39; 상자; 진드기는 &#39; 표시 컨트롤 샘플 &#39; 상자; 진드기는 &#39; 모든 analytes에 걸쳐 적용 &#39; 상자; 진드기는 &#39; 최적화 후 보고서 표시 &#39; 상자.</li>
			<li>클릭는 &#34; 최적화 &#34; 자동 최적화 버튼.</li>
		</ol></li> <li>아래 샘플 id 라벨 &#39; 입력 샘플 정보 &#39; 탭</li>
		<li>얻을에서 관찰 된 농도 &#39; 보고서 테이블 &#39; 탭을 클릭 &#34; 보고서 테이블 내보내기 &#34; 추가 분석에 대 한 스프레드시트 파일에서 데이터를 생성 하.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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저자는 공개 없다. 아니 금융 관심 또는 상충입니다.

Cytokines는 작은 세포 분 비 단백질 면역 반응을 조절 하는 강력한 면역 변조기. 32 눈물 샘플 눈과 프로필 질병 pathogenesis의 메커니즘을 이해, 눈 건강의 상태를 확인 하는 데 도움이 cytokine에 대 한 연구의 다양 한 병 적인 조건에 관련 된 다양 한 cytokines의 식 프로필 질병의 심각도, 진단 및 진행입니다. 2 , 5 더 낮은 단백질 농도 및 작은 샘플 볼륨 눈물 cytokine 단면도의 분석에 대 한 같은 ELISA 분석 실험의 사용을 제한 하는 전통적인 방법의 주요 과제는. 33 비드 기반 다중 분석 ELISA에 비해 뚜렷한 장점이 있는 immunoassays는. 비드 기반 다중 분석 여러 analytes의 분석에 대 한 작은 샘플 볼륨을 요구 하 고 매우 민감한, 생물 학적 체액에서 단백질의 pi...

눈물 눈물 동맥 액세서리 땀 샘에 의해 생산 하 고 눈의 외부 표면 코트. 눈물 영화 외부 지질 층 및 수용 성 단백질을 포함 하는 내부 수성 층의 구성, mucins과 막 바인딩된 mucins. 눈물 미생물 침입 방지, 영양분을 공급 하 고 눈 표면에 윤 활을 제공 합니다. 눈물은 공기와 각 막에 산소 수송을 위한 조직 간의 인터페이스 역할을 합니다. 1 눈물 영화 단백질, 탄수화물, 지질, 전해질의 구성 되어 있습니다. 눈 및 조직의 질병 눈물 단백질 사이 협회 같은 당뇨병 mellitus, vernal 결막염, 건조 한 눈 질환, 녹 내장, 갑 상선 관련 orbitopathy 및 암 여러 연구에서 발견 되었습니다. 2 , 3 , 4 눈물 샘플을 microcapillary 관에 의해 수집 될 수 있습니다 또는 눈물 흐름 스트립 (Schirmer 스트립). 또한, Schirmer의 시험 각 막 굴절 수술 클리닉, cytokine 분석 분석 실험의 결과 사용할 수 있습니다에서 수행 하는 표준 절차입니다. 비-침략 적 샘플 컬렉션, 생물 표본의 접근성 및 다양 한 생리 및 병리학 조건 눈물 구성의 협회 영화 여러 눈 및 전신 질환에 대 한 생체의 눈물 확인 합니다. 4 , 5 , 6
눈물 cytokines 안구 표면 상태를 공부 하 고 다양 한 눈 질환의 염증 성 조건에서 중요 한 역할을 한다. 7 눈물 샘플에서 여러 가지 cytokines의 비정상적인 농도 건조 눈 질병, vernal 성 각 결막염 (VKC), 아 토 피 성 각 결막염 (AKC), 계절 알레르기 결막염, 그리고 포도와 관련 된 것으로 알려졌다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 눈물 단백질 질량 분석, 서 부 럽 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA) 같은 전통적인 방법으로 분석할 수 있습니다. 14 , 그러나 15 , 이러한 방법의 한계는 불 쌍 한 감도 각 환자에서 여러 눈물 cytokines의 분석에 필요한 샘플의 더 큰 볼륨. 16 , 17 비드 기반 다중 분석 실험 분석 하는 복잡 한 혼합 샘플에 여러 analytes를 개발 하 고 되었습니다 눈물 샘플을 분석 하는 다른 질병에 여러 cytokines에 성공적으로 적용. 6 , 샌드위치 ELISA의 18 A 조합과 흐름 cytometry 기술을 단일 샘플에서 여러 analytes의 정량화에 대 한 엘리 사 보다 더 민감한 되기 이러한 분석 가능 19 이 메서드는 다양 한 임상 및 세포 문화 supernatants 샘플과 여러 병 태 생리 조건에서 면역 반응의 연구에 도움이에 적용할 수 있습니다. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
여러 연구 비교 기반 비드 멀티플렉스와 ELISA 분석 실험 방법 사이의 상관 관계를 보고 있다. 화장실 외. 비해 구슬 resistin, leptin 및 인간의 혈 청 또는 플라스마 견본에 렐 adiponectin의 검출에 대 한 기존의 ELISA 다중 분석 결과 기반으로 하 고 강한 상관 관계를 보고 (r &#62; 0.9)는 분석 실험 사이. 25 듀 폰 외. 보고 IL 1β의 검출에 대 한 비드 기반 다중 분석 실험 및 ELISA 사이 강한 상호 관계 일리노이-4, IL-5, 일리노이-6, 일리노이-10, IFN-ϒ, 및 phytohemagglutinin에 lipopolysaccharide TNF-α 전 혈 자극 임산부에서 수집. 26 피커링 외. 보고 Haemophilus 인플루엔자 b 형 다 당 류를 혈 청 항 체의 검출에 대 한 비드 기반 다중 분석 결과 엘리 사 사이 또 다른 강한 상관 관계 (r = 0.96), 의 toxoids Clostridium tetani (r = 0.96), 그리고 Corynebacterium diphtheriae (r = 0.91). 27 Biagini 그 외 여러분 보고 높은 긍정적인 상관 관계 (r = 0.852) 구슬 기반 다중 분석 결과 균 결국 안티-PA IgG 혈 청 샘플에서의 검출 ELISA 사이. 28 왕 외. 보고 알츠하이머병 바이오 마커의 아 밀 로이드 β 42의 검출에 대 한 비드 기반 다중 분석 결과 엘리 사 사이 상관 관계 (r = 0.77), 총 타우 (r = 0.94), 그리고 아미노산 181에 phosphorylated 타우 (r = 0.82)에 척수 샘플입니다. 29 이러한 연구 구슬의 적용 다양 한 임상 샘플, 작은 샘플 볼륨 요구 사항 및 표준 ELISA와 상관 관계는 유망한 비드 기반 다중 분석 실험에 다중 분석을 기반으로 증명 다른 유형의 다른 질병 고기에서 샘플에 여러 analytes의 검출을 위한 전통적인 ELISA 방법에 대안. 여기 우리가 cytokine Schirmer 스트립을 사용 하는 건강 한 과목에서 수집 된 눈물 샘플에서 41 analytes에 대 한 프로 파일링에 대 한 비드 기반 다중 분석 결과 대 한 표준화 된 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Milliplex MAP 인간 사이토카인 / 케모카인 자기 비드 패널 -1 키트</td><td>Merck, USA</td><td>HCYTOMAG-60K-41</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D luminex 기기&nbsp;</td><td>Luminex Corp, 미국</td><td></td><td></td>텍사스주 오스틴</tr><tr><td>xPonent 소프트웨어&nbsp;</td><td>Luminex Corp, 오스틴, 텍사스, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBX발전기 소프트웨어</td><td>BIO-RAD, 프랑스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Manager 6.1</td><td>BIO-RAD, 프랑스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 셰이커</td><td>코닝, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TECAN Microplate Washer</td><td>Tecan, 스위스</td><td>HydroSpeed</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries Inc, 미국</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Mettler Toledo, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen, USA</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Schirmer 눈물 흐름 테스트 스트립</td><td>Eye Care and Cure, USA</td><td>101657</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D Calibration Kit</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-028</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D Verfication Kit</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-029</td><td></td></tr><tr><td>안구 검사 의자</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

구슬 눈물 cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

눈물 영화 윤 활, 영양 및 원본 셀에 대 한 보호를 제공 하는 눈의 외부 표면을 커버 하는 지질, 단백질과 미네랄의 복잡 한 혼합물 이다. 눈물의 분석 예측, 진단, 및 각종 눈 질병의 예 후에 대 한 생체의 식별에 대 한 신흥 지역 이다. 눈물은 쉽게 접근할 수 있는 하 고 그들의 컬렉션은 비 침략 적 이다. 따라서, 발전 기술 여러 analytes 단백질 또는 대사 산물 구성과 연관의 병 적인 조건에 변화를 공부 하는 눈물에서의 식별에 대 한 굴지를 얻고 있다. 눈물 cytokines 안구 표면 상태를 공부에 대 한 이상적인 생체 이며 또한 건조 눈 질병 및 vernal 결막염 같은 다른 안구 표면 질환의 메커니즘을 이해에 도움이. 비드 기반 다중 분석 실험의 높은 감도와 적은 양의 샘플에서 여러 analytes를 감지 기능이 있다. 우리가 눈물 샘플 컬렉션의 표준화 된 프로토콜을 설명 하는 여기, 추출 및 cytokine 구슬을 사용 하 여 프로 파일링 분석 기반 다중 분석 결과.

눈물 샘플 눈물 흐름 스트립을 사용 하 여 4 건강 한 주제의 8 눈에서 수집 된 고 cytokine 레벨 위에서 언급 한 프로토콜을 사용 하 여 분석 했다. 모든 과목은 남성 및 4 명의 과목의 연령은 36, 42, 44, 52 년 각각. 안구 표면 상태 및 건조 눈 질병에 따라 임상 시험 (눈물 영화 휴식 시간, Schirmer의 시험, 각 막 얼룩, conjunctival 얼룩, 뚜껑/meibomian 동맥 검사, 각 막 눈물과 시각적 표시 증상과)에 의해 평가 되었다는 국제 건조 눈 워크숍, 2007 지침 및 과목의 어떤 징후와 건조 안과 질환의 증상을 보여주었다. 31
분석 41 cytokines에서 31 cytokines에에서 검색 된 모든 눈물 샘플, IL-17A, MIP 1β 및 TNF-α에서에서 발견 되었...

눈물 영화 cytokines의 분석은 다양 한 안구 질환을 공부에 도움이 됩니다. 비드 기반 다중 분석 간단 하 고 민감한 고 작은 볼륨으로 샘플에서 여러 대상의 테스트를 활성화. 우리가 눈물 영화 cytokine 사용 하 여 프로 파일링에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기 비드 다중 분석 결과 기반으로.

구슬 눈물 Cytokine 프로 파일의 분석에 대 한 다중 분석 결과 기반으로

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 비드 기반 멀티플렉스 어세이를 사용하여 Schirmer Strip으로 수집한 인간 눈물 샘플의 사이토카인 프로파일을 연구하는 것입니다. 이 방법은 다양한 안과 질환에서 사이토카인의 역할과 같은 안과학 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 더 적은 샘플 부피로 여러 분석물을 연구할 수 있다는 점입니다.본 절차의 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Praveen Balne이 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 피험자로부터 눈물을 채취한 후, 눈물 흐름 스트립을 0.5 cm 길이로 잘라 멸균된 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 넣습니다. 여기에 assay buffer 30 µL를 첨가하고 튜브를 상온에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 튜브를 14,000 ×g에서 1분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 다른 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 스트립은 폐기합니다. 그 후 샘플이 담긴 튜브를 얼음에 보관하고, 용출된 눈물 샘플을 즉시 사이토카인 프로파일링에 사용합니다.비드 기반 멀티플렉스 분석을 수행하려면, 모든 시약을 실온으로 맞추고 5~10초 동안 볼텍싱합니다. 용출된 눈물 샘플을 분석 전 -80 °C에서 보관한 경우, 냉동된 눈물 추출물을 얼음 위에서 해동하고 샘플을 1,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 인간 사이토카인 표준물질 QC-1, QC-2 및 샘플을 처리하기 위해 수직 구성의 분석 워크시트를 준비합니다.플레이트의 각 웰에 1X 세척 완충액 200 µL를 넣고 플레이트 실러로 밀봉합니다. 그런 다음 플레이트 셰이커를 사용하여 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 플레이트를 뒤집어 1X 세척 완충액을 따라내고 흡수성 타월에 여러 번 두드려 웰에 남아 있는 잔류 세척 완충액을 제거합니다.그 다음, 각 작동 인체 사이토카인 표준 물질 QC-1, QC-2, 분석 버퍼만 포함된 공시료(blank), 그리고 샘플을 각각 25 µL씩 해당 웰에 첨가합니다. 각 웰에 25 µL의 분석 버퍼를 추가합니다. 그런 다음, 각 웰에 1X 항체 비드 칵테일 솔루션을 25 µL씩 첨가합니다.항체 비드 용액은 빛에 민감하므로, 분석 중에 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 알루미늄 호일과 플레이트 커버로 덮어줍니다. 플레이트를 셰이커 위에 올려놓고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트를 자동 자기 플레이트 워셔의 플레이트 랙에 놓고 1분 동안 그대로 두어 자기 비드가 웰 바닥에 가라앉도록 합니다.자동 자기 플레이트 세척기를 사용하여 웰의 내용물을 흡입하고, 웰당 200 microliters의 세척 완충액을 추가합니다. 플레이트를 1분 동안 그대로 둔 다음, 이전과 동일하게 웰의 내용물을 흡입하고 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 각 웰에 25 microliters의 검출 항체 용액을 추가합니다.플레이트를 밀봉합니다. 알루미늄 호일과 플레이트 커버로 덮은 후, 쉐이커 위에서 실온으로 60분 동안 배양합니다. 그 다음 각 웰에 25 µL의 Streptavidin Phycoerythrin 용액을 첨가하고, 플레이트를 밀봉 및 커버한 후 쉐이커 위에서 실온으로 30분 동안 배양합니다.배양 후, 플레이트를 마그네틱 플레이트 세척기에 놓고 1분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 웰의 내용물을 흡입하고 웰당 200 µL의 세척 완충액을 추가합니다. 1분 동안 그대로 둔 다음 웰의 내용물을 흡입하며, 이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.각 웰에 150 µL의 sheath fluid를 추가합니다. 그다음 플레이트를 상온에서 5분 동안 쉐이커에 놓아 항체 비드를 재부유시킨 후, 플레이트를 판독하여 사이토카인 농도를 분석합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 분석 플레이트를 판독하려면, 배치(batches) 페이지를 열고 기존 프로토콜에서 '새 배치 생성(create a new batch)' 탭을 클릭하십시오.배치 이름 상자에 배치 이름을 입력하고, 선택적 설명 입력 상자에 배치에 대한 설명을 입력하십시오. 이전에 생성한 프로토콜을 클릭한 다음 다음을 클릭하십시오. 그러면 표준물질 및 대조군 탭이 열립니다.분석 표준물질의 세부 사항을 확인하고 다음을 선택하십시오. 플레이트 레이아웃 탭에서 배치에 대한 웰 명령을 할당하고, 저장 버튼을 클릭하여 배치 정보를 대기 배치 목록에 저장하십시오. 플레이트를 비드 기반 멀티플렉스 분석 플레이트 리더기에 로드하고 대기 배치 목록에서 배치를 실행하십시오.RBX 변환 소프트웨어를 실행하고 exponent 파일 선택 항목에서 비드 기반 멀티플렉스 분석 소프트웨어로 생성된 csv 파일을 선택하십시오. 그런 다음 generate 버튼을 클릭하십시오. 선택한 출력 폴더에 rbx 파일이 저장됩니다.이제 분석 소프트웨어를 실행하고 rbx 파일을 엽니다. 그런 다음 4PL-5PL 곡선 적합(curve fit)을 사용하여 표준 곡선을 최적화합니다. 표준 곡선을 최적화하려면 표준 곡선 탭에서 회귀 유형을 logistics 5PL로 선택하고, 변환 설정에서 log X, linear Y에 액세스하십시오. 그런 다음 농도 범위 선 표시, 미지 시료 표시, 대조군 시료 표시, 모든 분석물에 적용, 최적화 후 보고서 표시 확인란을 각각 선택하십시오.자동 최적화를 위해 optimize 버튼을 클릭하십시오. enter sample info 탭에서 샘플 식별 이름을 지정하십시오. 마지막으로, report table 탭에서 측정된 농도를 확인하고 export report table을 클릭하여 추가 분석을 위한 스프레드시트 파일로 데이터를 생성하십시오.36세에서 52세 사이의 건강한 남성 4명의 8개 안구에서 눈물 샘플을 수집하였습니다. 비드 기반 멀티플렉스 분석법을 통해 분석한 41가지 사이토카인 중 31가지가 모든 눈물 샘플에서 검출되었습니다. 예를 들어, IL-17A, MIP-1b 및 TNFa는 4명의 피험자 중 7개 안구에서 검출되었으며, IL-4는 4명의 피험자 중 6개 안구에서 검출되었습니다.또한, 3명의 피험자 중 6개의 안구에서 인터페론 감마가 검출되었습니다. 3명의 피험자 중 5개의 안구에서는 인터루킨-1a가 검출되었습니다. 2명의 피험자 중 3개의 안구에서는 에오탁신과 인터루킨-9가 검출되었습니다.Interleukin-3는 한 개의 눈에서 검출되었으며, MIP-1a는 어떤 샘플에서도 검출되지 않았습니다. 검출된 41가지 사이토카인의 평균값 및 표준편차 농도가 이 산점도에 표시되어 있습니다. Interleukin-1ra는 모든 샘플에서 높게 발현되었습니다.사이토카인 IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, Interleukin-a, EGF, PDGF-BB, VEGF 및 G-CSF 또한 ng/mL 수준으로 높게 발현되었으며, 나머지 사이토카인들은 pg/mL 수준으로 발현되었습니다. 여기서 보는 바와 같이, 눈물 사이토카인의 측정 농도가 가장 낮았던 것은 TNF-a였으며, 평균 ± 표준 편차는 27.25 ± 19.97 pg/mL였습니다. 모든 샘플에서 검출된 31종의 사이토카인 중, T 검정 결과 우안과 좌안 사이의 농도에서 통계적으로 유의미한 차이를 보인 것은 없었습니다.숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행될 경우 1.5일 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 눈물 사이토카인 프로파일링을 위한 비드 기반 멀티플렉스 분석 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

bead-based-multiplex-assay-for-analysis-of-tear-cytokine-profiles

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 인간 눈물의 사이토카인을 분석하기 위한 비드 기반 멀티플렉스 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 단일 샘플에서 여러 사이토카인을 동시에 분석할 수 있어 다양한 병태생리학적 조건에서 면역 반응을 연구하기 위한 감도를 높일 수 있습니다.

인간 눈물 샘플의 사이토카인을 분석하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 분석

이 동영상은 샘플에서 여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역 분석을 보여줍니다. 사이토카인 특이적 항체에 접합된 별개의 미세구체의 혼합물을 사용하여 샘플에 존재하는 사이토카인을 결합합니다. Streptavidin이 태그된 기자는 비오틴화 검출 항체를 사용하여 결합 사이토카인에 고정됩니다. 유세포 분석은 미세구의 고유한 크기와 내부 형광 강도를 기반으로 결합된 사이토카인을 식별하며, 리포터의 형광 강도는 사이토카인의 수를 나타냅니다.

여러 사이토카인 표적을 정량화하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 면역분석법

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배우세요 구슬 기반 다중 분석법을 이용한 인간 눈물 사이토카인 프로파일링 방법을 안과 질환 연구에 활용하는 기법입니다. 이 방법은 소량 샘플로 다중 분석이 가능하여 눈 건강 연구에 유용합니다.

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