쥐 뇌 절편의 화합물에 대한 미세아교세포 돌기 인력을 연구하기 위한 이광자 현미경

2광자 현미경 아래에서 aCSF가 포함된 관류실에 마우스 뇌 절편을 놓습니다.

마우스는 미세아교세포에서 GFP를 발현하도록 유전자 조작되어 미세아교세포 움직임 추적이 가능합니다.

홀더로 슬라이스를 고정합니다.

명시야 조명을 사용하여 관심 영역을 찾습니다.

세아교세포를 시각화하기 위해 형광 조명으로 전환합니다.

마이크로피펫에 테스트 화합물을 채우고 주사기 홀더에 장착한 다음 슬라이스에 닿도록 내립니다.

2광자 이미징 모드를 활성화하여 저에너지 근적외선을 조직에 집중시킵니다.

레이저의 초점에서 두 개의 광자가 에너지를 결합하여 GFP를 여기시켜 형광을 방출합니다.

여러 Z-평면에서 이미지를 캡처하여 미세아교세포 과정에 초점을 맞춥니다.

기준선 활동을 기록한 다음 화합물을 주입하고 기록을 계속합니다.

이 화합물은 미세아교세포 수용체에 결합하여 미세아교세포 과정이 화합물 공급원으로 확장되도록 유도하는 신호 전달 경로를 유발합니다.

시간이 지남에 따라 주사 부위 근처의 형광 증가를 모니터링하여 움직임을 추적합니다.

기록을 시작하기 30분 전에 연동 펌프를 상단 및 하단 관류가 있는 맞춤형 기록 챔버에 연결하여 조직 조각의 산소화 및 생존력을 최적화하고 50밀리리터의 초순수로 전체 관류 시스템을 청소합니다. 세척 주기가 끝나면 일정한 탄화 하에서 유리 비커에 50밀리리터의 aCSF로 기록 챔버의 관류를 시작하고 일회용 광구 이송 피펫을 사용하여 이미지화할 첫 번째 슬라이스를 비커로 옮겨 렌즈 용지를 제거합니다.

섹션이 비커 바닥으로 가라앉으면 섹션을 기록 챔버로 옮기고 슬라이스 홀더를 슬라이스 위에 배치하여 관류 흐름으로 인한 움직임을 최소화합니다. 명시야 조명을 사용하여 5-10배 배율로 관심 있는 뇌 영역을 표적으로 삼습니다. 그런 다음 0.35배 침수 렌즈와 함께 25배 대물렌즈를 사용하여 시야의 위치를 조정합니다.

형광 조명을 사용하여 형광 미세아교세포를 찾고 최종 농도의 관심 화합물을 포함하는 10마이크로리터의 aCSF로 피펫을 다시 채웁니다. 팁을 부드럽게 흔들면서 팁을 아래쪽으로 향하게 하여 팁에 갇힌 기포를 제거하고 채워진 피펫을 5밀리리터 주사기에 연결된 피펫 홀더에 장착하고 플런저를 5밀리리터 위치에 배치하고 3축 마이크로매니퓰레이터에 장착합니다.

피펫 팁이 슬라이스 표면에 가볍게 닿을 때까지 피펫을 슬라이스 쪽으로 부드럽게 내리면서 대물렌즈를 제어하고 동시에 조정합니다. 이제 레이저를 조정하고 현미경을 다광자 모드로 전환하십시오. 챔버가 모든 광원으로부터 차단되어 있는지 확인하고 스캔되지 않은 검출기를 켭니다. 게인을 설정하고 색상으로 구분된 상한선이 있는 조회 테이블을 사용하여 이미지의 픽셀이 포화되지 않도록 합니다.

그런 다음 총 최소 30분 동안 기록을 시작하고 5초 동안 5분 후에 주사기 플런저를 5밀리리터 위치에서 1밀리리터 위치로 천천히 눌러 화합물을 섹션에 적용합니다. 이미지 분석을 위해 먼저 관심 파일에 대해 ImageJ를 사용하여 Z 투영 및 드리프트 보정을 수행합니다. 그런 다음 수정된 파일을 Icy에서 열고 주사 부위를 중심으로 직경 35마이크로미터의 원형 관심 영역을 그립니다.

ROI로 동영상을 다시 실행하여 적절한 위치에 있는지 확인합니다. 그런 다음 관심 영역 Intensity Evolution 플러그인을 사용하여 관심 영역에서 시간 경과에 따른 평균 강도를 측정하고 결과를 .xls 파일로 저장합니다.