Name: 정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 학습하세요 급성 뇌 슬라이스에서 단일 시냅스 글루타메이트 방출 및 섭취량 평가 방법을. 형광 센서 iGlu u와 투광자 현미경을 활용하여 정상 및 헌팅턴 마우스의 시냅스 기능 장애를 식별하고 신경퇴행성 질환의 병태생리를 이해합니다.

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이 작품은 CHDI (A-12467), 독일 연구 재단 (Exc 257/1 및 DFG 프로젝트 ID 327654276 - SFB 1315) 및 샤리테의 교내 연구 기금에 의해 지원되었다. 우리는 K. Török, 세인트 조지의, 런던 대학, N. Helassa, 리버풀 대학, iGluu 플라스미드와 많은 유용한 토론에 감사드립니다. D. 베턴스와 A. 숀허르는 우수한 기술 지원을 제공했습니다.

저자는 공개 할 것이 없다.

이 실험은 일반적인 관심사에 관한 것입니다 — 시냅스 독립성과 신경 변성 과정에서 의 가능한 손실, 우리는 노인 (>1 년) 마우스에서 급성 뇌 조각에 영향을받는 시냅스를 식별하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 최근 도입된 글루타메이트 센서 iGluu의 개선된 운동 특성을 활용하여 시냅스 글루타메이트 방출과 섭취량 사이의 관계를 이전에는 불가능했던 방식으로 조명하는 실험이 있었다.
조미료 클리어런스의 기능 및 유지에 미치는 영향은 잘 해명되지 않지만, 글루타메이트 유발 흥분독성이 신경 손실 및 시냅스 가지치기를 일으킬 수 있다는 가설은 간질, 뇌졸중 및 신경 퇴행성질환38,,39,,40,,41에대한 거의 모든 관련 검토에서 언급된다...

"단일 연결"(즉, 2개의 신경 세포 사이의 연결)에 속하는 각 시냅스 말단의 상대적 영향은 전형적으로 후진성 뉴런1,,2의초기 세그먼트에 미치는 영향에 의해 평가된다. 후성 신경세포로부터의 신체 및/또는 수지상 기록은 가장 흔한 것을 나타내며, 지금까지 가장 생산적인 수단은 하향식 또는 수직 관점 하에서 정보 처리를 명확히 하는수단3,4,,5.4 그러나, 그들의 이산성상체및(설치류에서) 중첩되지 않은 영토의 존재는 시냅스 사이트6,7,7,88,9,,10에서신호 교환, 통합 및 동기화의 국소 메커니즘에 기초한 수평 적 관점에 기여할 수 있다.
아스트로글리아가 노는 것으로 알려져 있기 때문에, 일반적으로, 퇴행성신경질환(11,,12)의 병인에 중요한 역할을 하며, 특히, 글루타마테르시냅스13,14, 15,,15,16의유지 및 가소성에 대한 역할을 하며, 다양한 표적 섬유의 공유 대상 영역에서 성상세포의 상태에 따라 시냅스 성능의 변질이 진화하는 것으로 생각된다., 건강과 질병에 있는 표적/astroglia 파생한 현지 규정 기계장치를 더 탐구하기 위하여는, 개별 적인 시냅스를 평가할 필요가 있습니다. 본 접근법은 기능성 글루타메이트 방출 및 클리어런스 지표의 범위를 추정하고 운동 개시와 가장 밀접한 관련이 있는 뇌 영역에서 기능 장애(또는 복구된) 시냅스를 식별하는 데 사용될 수 있는 기준을 정의하기 위해 노력되었다(즉, 모터 피질 및 등쪽 줄무늬에서 우선).
줄무늬는 본질적인 글루타마테르기뉴런이 부족합니다. 따라서, 엑스트라 스트리아탈 기원의 글루타마테르기성 구심을 식별하는 것은 비교적 쉽습니다. 후자는 주로 내측 시상과 대뇌 피질에서 발생합니다(17,,18,,19,,20 참조). 코르티코스타탈리탈 시냅스는 피질 층에 국한된 피라미드 뉴런의 축색에 의해 형성된다 2/3 과 5. 각각의 축삭은 섬유 계통을 통해 양측 내 말뇌파(IT) 연결 또는 동측 연결을 형성하여 피라미드 관(PT)을 더 많이 구성합니다. 또한 IT-및 PT 형 단말은 방출 특성 및 크기21,,22가다르다는 것이 더 제안되었다. 이러한 데이터를 고려할 때 글루타민산염 처리에 약간의 차이가 있을 수 있습니다.
줄무늬는 헌팅턴병(HD)에서 가장 영향을 받는 뇌영역5이다. 인간 헌 화는 심각한 유전상속 신경 퇴행성 질환이다. Q175 마우스 모델은 파킨슨병과 많은 공통점이 있는 HD의 저운동성 강성 형태의 세포 기반을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다. 약 1년의 나이부터, 호모자이고트 Q175 마우스(HOM)는 개방된필드(23)에서운동 없이 소요된 시간을 측정함으로써 밝혀진 바와 같이 저운동증의 징후를 나타낸다. 본 실험에서 헤테로지고테 Q175 마우스(HET)를 사용하여 HOM에서 관찰된 이전 모터 적자를 확인하였고, 또한 관찰된 모터 결핍은 코르티코스테리아시냅스 말단24의바로 부근에서 성상세포성 흥분성 아미노산 수송기 2 단백질(EAAT2)의 감소된 수준을 수반하였다. 따라서 성상 성미 글루타메이트 섭취량의 적자가 각 시냅스의 기능 장애 또는 심지어 손실로 이어질 수 있다고 가설되었습니다25,,26.
여기에서, 우리는 방출된 신경 전달 물질의 양에 대하여 단 하나 시냅스 글루타메이트 정리를 평가할 수 있는 새로운 접근을 기술합니다. 새로운 글루타메이트 센서 iGluu는 코르티코스타탈 피라미드 뉴런으로 발현되었다. 카탈린터뢰크(27)에 의해 개발되었으며 이전에 도입된 높은 친화도이지만 느린 글루타메이트 센서 iGluSnFR28의변형을 나타낸다. 두 센서 모두 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)의 유도체입니다. 스펙트럼 및 운동 특성에 대한 경우 Helassa 등27을참조하십시오. 간단히 말해서, iGluu는 빠른 비활성화 역학을 가진 낮은 친화도 센서이므로 글루타메이트 방출 시냅스 터미널에서 글루타메이트 클리어런스를 연구하는 데 특히 적합합니다. iGluu의 해리 시간 상수는 정지-유동 장치에서 결정되었고, 이는 20°C에서 2.1 ms의 타우오프 값을 렌더링하지만, 34°C27의온도로 추정될 때 0.68 ms를 렌더링하였다. 2-광자 현미경 하에서 organotypic 해마 배양물의 CA1 영역에서 나선형 레이저 스캐닝으로 34°C에서 프로브된 단일 샤퍼 부수적 말단은 2.7 ms의 평균 시간 상수 로 나타내었다.

<table><tbody><tr><td>스테레오 마이크로솝</td><td>WPI</td><td>PZMIII</td><td>정밀 스테레오 줌 양안 현미경</td></tr><tr><td>입체 구조</td><td>스톨팅</td><td>51500D</td><td>디지털 랩 새로운 표준 입체 프레임</td></tr><tr><td>고속 드릴 장비</td><td>스톨팅</td><td>514439V</td><td>Foredom K1070 크로 모터 키트</td></tr><tr><td>사출 시스템</td><td>스톨</td><td>53311</td><td>Quintessential 입체 인젝터 (QSI)</td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 5 &micro; l</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>75RN Syr (26s/51/2)</td></tr><tr><td>레이저 포지셔닝 시스템</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA-40</td><td>UGA-40</td></tr><tr><td>iGluu 여기용 블루 레이저</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-473-020-S</td><td>473 nm 레이저 473</td></tr><tr><td>nm용 이색성 거울</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>ROE TB-355-405-473</td><td>이색성</td></tr><tr><td>1P 정립 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1066-600</td><td>Axioskop 2 FS Plus</td></tr><tr><td>Objective 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td>421480-9900</td><td>W Plan-Apochromat</td></tr><tr><td>4x objective</td><td>Carl Zeiss</td><td>44-00-20</td><td>Achroplan 4x/0,10</td></tr><tr>iGluu <td>Omega 광학</td><td>XF2030</td><td></td>용<td>Dichroic mirror</td></tr><tr><td>iGluu</td><td>Omega 광학</td><td>XF3086</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Omega 광학</td><td></td><td></td>QMAX_DI580LP</tr><tr><td>자가형광 subtr을 위한 방출 필터.</td><td>오메가 광학</td><td>QMAX EM600-650</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS 카메라</td><td>Andor</td><td>ZYLA4.2PCL10</td><td>ZYLA 4.2MP Plus</td></tr><tr><td>Acqusition 소프트웨어</td><td>Andor</td><td>4.30.30034.0</td><td>Solis</td></tr><tr><td>AD/DA 컨버터</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895035</td><td>InstruTECH LIH8+8</td></tr><tr><td>Aquisition 소프트웨어</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895153</td><td>TIDA5.25</td></tr><tr><td>전극 포지셔닝 시스템</td><td>Sutter Instrument</td><td>MPC-200</td><td>Micromanipulator</td></tr><tr><td>전기 자극기</td><td>Charite 워크샵</td><td>STIM-26</td><td></td></tr><tr><td>슬라이서</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td>Vibrotome</td></tr><tr><td>Brown/Flaming-type puller</td><td>Sutter Instr</td><td>SU-P1000</td><td>P-1000</td></tr><tr><td>사출 피펫용 유리관</td><td>WPI</td><td>1B100F3</td><td></td></tr><tr><td>유리관 자극 피펫</td><td>WPI</td><td>R100-F3</td><td></td></tr><tr><td>테트로도톡신</td><td>Abcam</td><td>ab120054</td><td>TTX</td></tr><tr><td>iGluu 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>106122</td><td>pCI-syn-iGluu</td></tr><tr><td>Q175 마우스</td><td>Jackson Lab</td><td>27410</td><td>Z-Q175-KI</td></tr></tbody></table>

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

시냅스는 서로 독립적으로 작동하는 고도로 구획화된 기능 단위입니다. 헌팅턴병(HD) 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 조미료 통관이 부족하고 유출 및 유출 효과로 인해 이러한 독립성이 손상될 수 있습니다. 시냅스 전 단말 및/또는 수지상 척추의 변경된 성상 세포 적 범위뿐만 아니라 글루타메이트 방출 사이트에서 글루타메이트 수송 클러스터의 감소 된 크기는 이긴장 / 과다 운동 장애의 증상을 초래하는 질병의 발병 기전에 연루되었습니다. 그러나, 헌정판에 있는 글루타마테르지시냅스의 역기능으로 이끌어 내는 기계장치는 잘 이해되지 않습니다. 시냅스 이미징을 개선하고 적용하면 움직임의 개시를 방해하는 메커니즘에 새로운 빛을 발산하는 데이터를 얻었습니다. 여기서, 우리는 새로운 유전자 부호코딩 된 초고속 글루타메이트 센서 iGluu,광시야 광학, 과학 적인 CMOS (sCMOS) 카메라, 473 nm 레이저 및 레이저 포지셔닝 시스템을 사용하여 단일 시냅스 분해능을 달성하기 위해 비교적 저렴한 접근법의 원리 요소를 설명하여 건강한 나이 또는 급성 슬라이스에서 코르티코스타탈 시냅스의 상태를 평가하였다. 글루타메이트 과도제는 활성 영역 및 ii 옆의 글루타메이트 농도[Glu]의 최대 고도에 기초하여 글루타메이트 방출의 추정치를 얻기 위해 단일 또는 다중 픽셀로부터 구성되었고, 글루아메이트 는 회음부[Glu]의 부패(TauD)의 시간 상수에 반영된 바와 같이 글루타메이트 섭취량이다. 휴식 bouton 크기와 단기 가소성의 대조 패턴의 차이는 내뇌 phalic (IT) 또는 피라미드 기관 (PT) 통로에 속하는 코르티코스테리아 말단의 식별을위한 기준으로 봉사했다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 증상 HD 마우스에서 ~ 40% PT 형 코르티코테리아 시냅스의 불충분 한 조미료 클리어런스를 전시 발견, 이러한 시냅스는 흥분 독성 손상에 위험이있을 수 있음을 시사. 결과는 hypokinetic 표현형을 가진 헌팅턴 마우스에 있는 역기능 시냅스의 biomarkers로 TauD의 유용성을 강조합니다.

코르티코스트리아탈 글루타마테르균 성 정맥류의 두 가지 유형의 식별 IT 및 PT 구심체는 각각 2/3 및 5층에서 발생하며, 동측 및 반대측(IT 단말만 해당) 줄무늬에서 차등 파급 효과 및 종료 패턴을 나타낸다. 아직도 거의 운동의 개시 동안 관찰 된 반복적 인 활성화 조건 하에서 글루타메이트 방출 및 클리어런스의 특성에 대해 알려져 있지만, 각각의 글루타메이트 방출 정맥류가 크기22에서다르다는 것이 잘 문서화되어 있다. 크기 기준을 적용하면 IT 및 PT 단말이 단기가소성(24)의대조적인 형태를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 50ms의 자극 간격으로, 더 작은 IT 단말은 쌍펄스 불경기 (PPD)에 경향이 있었고 더 큰 PT 단말은 쌍펄스 촉진을 보여주었습니다. 이 차이는 또한 더 짧은 간격 (20 ms)에서 그리고 6 펄스의 시리즈를 통해 관찰되었다. 도 3</stron...

우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

빠른 글루타메이트 센서를 표현하는 단일 시냅스의 고해상도 이미징을 통해 송신기 방출과 섭취 사이의 로컬 불일치를 감지할 수 있습니다. 질병의 경우,이 방법은 기능 장애 시냅스를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 자동 발광 보정을 위해 먼저 관심있는 마우스에서 뇌 조각을 한 광자 현미경의 기록 챔버에 놓습니다.산소, 인공 뇌척수액에 슬라이스를 침수하고 등쪽 striatum을 찾기 위해 20 배 물 침수 목표를 사용합니다. 백금 하프에 나일론 그리드로 슬라이스를 고정하여 조직의 움직임을 최소화하고 63배의 수분 침수 목표로 전환합니다. 510 나노미터의 하이 패스 필터를 사용하여 자동 형광 및 글루타민트 센서 양성 구조의 이미지를 함께 획득합니다.600 나노미터의 하이 패스 필터를 사용하여 자동 형광 구조의 두 번째 이미지를 단독으로 획득하십시오. 범위를 정의하려면 10개의 가장 밝은 픽셀과 10개의 어두운 픽셀의 평균 강도를 사용하여 빨간색과 노란색 이미지를 배율조정합니다. 그런 다음, 노란색 마이너스 빨간색 이미지의 빼기를 수행하고 빼기 된 이미지를 다시 조정하여 관심있는 bouton의 편리한 시각화를 위해 표준 8 비트 TIFF 파일을 생성합니다.반응성 부폰을 검색하려면 전기 자극에 적합한 유리 마이크로 파이프가 필요합니다. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 약 1 마이크로미터의 내부 팁 직경을 가진 보로실리케이트 유리 모세 혈관에서 자극 파이펫을 생성합니다. 후보 부톤 세트에서 글루타메이트의 작용 잠재력 에 따라 방출을 조사하려면 63x 배율 및 510 나노미터 방출 필터를 선택합니다.감산 된 이미지를적재하여 형광 실도 옆에 유리 자극 전극을 배치하여 추가 축축의 근접성을 피합니다. 슬라이스의 깊은 부분 내에서 최대 분기 또는 할당과 관련된 점만도 있습니다. 녹음은 완전한 어둠 속에서 수행되어야하므로 자극 전극을 관심의 부톤 근처에 놓고 빛을 끕니다.그런 다음, 다중 채널 목욕 응용 시스템을 켜고, 하나의 채널은 표준 목욕 용액을 제공하고 다른 채널은 작용 잠재적 생성을 차단하는 테트로톡신을 포함하여 이온 채널, 수송기 또는 멤브레인 수용체의 필요한 차단제를 제공합니다. 레코딩 부위의 흐름을 제어하고 자극기를 켜서 자극 파이펫에 2 내지 10 마이크로앰프의 탈극전류 펄스를 전달한다. 이제 방출은 전압 게이트 채널을 통해 직접 칼슘 유입에 의해 활성화됩니다.글루타민제 방출을 클리어런스에서 시각화하려면 현미경 X,

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 단일 피질 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소를 평가하는 방법을 보여줍니다. 전기 자극은 시냅스에서 글루타메이트 방출을 촉진합니다. 방출된 글루타메이트는 시간이 지남에 따라 감소하는 센서 단백질의 형광을 변경하여 방출 및 제거 효율을 나타냅니다.

Analyzing the Glutamate Release and clearance at a single neuroron synapse(마우스 뇌 절편의 단일 뉴런 시냅스에서 글루타메이트 방출 및 청소)

출처: McLeod, F., et al. 해마 설치류 뇌 절편의 시냅스 밀도 평가. J. Vis. 특급 (2017). 이 비디오는 컨포칼 면역형광 분석을 사용하여 해마 뇌 절편에서 시냅스 마커를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 슬라이스는 시냅스전 및 시냅스후 마커를 표적으로 하는 1차 항체로 면역 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 면역 염색됩니다. 그런 다음 표지된 마커는 공초점 현미경을 사용하여 시각화하여 공동 국소화를 통해 시냅스 구조를 평가합니다.

면역형광을 이용한 마우스 해마 절편의 시냅스 현미경 분석

우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

여기서는 토닉과 효소 결합 된 미세 배열 (MEA)를 사용하여 생체 내 세포 외 글루타메이트 phasic 변화를 측정하는 공간적 및 시간적 정확한 방법에 대한 설치 소프트웨어 탐색 및 데이터 분석을 기술한다.

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

이것은 조직에 저산소 손상을 줄이기 위해 얼음 차가운 NMDG-aCSF와 함께 경내 관류 및 슬라이스 절단을 활용하는 성인 및 노화 마우스 해마의 급성 슬라이스 준비를위한 프로토콜입니다. 결과 슬라이스는 여러 시간 동안 건강하게 유지되며 장기 패치 클램프 및 필드 레코딩에 적합합니다.

성인과 노화 마우스에서 해마 조각에서 저산소증 최소화

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.

급성 뇌 슬라이스에서 내인성 모아민 방출 측정을 위한 판 기반 분석

학습하세요 급성 뇌 슬라이스에서 단일 시냅스 글루타메이트 방출 및 섭취량 평가 방법을. 형광 센서 iGlu u와 투광자 현미경을 활용하여 정상 및 헌팅턴 마우스의 시냅스 기능 장애를 식별하고 신경퇴행성 질환의 병태생리를 이해합니다.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

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