제브라피시 라라바(Larava)에서 이광자 현미경을 사용한 표적 신경 세포 절제

취된 형질전환 제브라피쉬 유충을 아가로스에 고정하고 마취 용액이 들어 있는 페트리 접시에 넣는 것으로 시작합니다.

상세한 이미징을 위해 두 개의 광자를 사용하는 2 광자 레이저 현미경 아래에 배치하십시오.

뇌의 최상층과 최하층에 집중하여 이미징 경계를 설정합니다.

레이저 치료 전에 뉴런을 관찰하기 위해 다양한 깊이에서 이미지를 캡처합니다.

관심 영역에 초점을 맞추고 프레임 크기를 조정하여 뉴런에 초점을 미세 조정합니다.

2광자 레이저를 사용하여 뉴런을 선택하고 조사합니다.

레이저는 국부적인 열을 유도하여 주변 조직의 손상을 최소화하면서 신경 세포 사멸을 초래합니다. 이미지를 캡처합니다.

치료 전후 이미지를 비교하여 형광 변화를 평가합니다.

뉴런을 더 깊은 평면에 다시 집중시키고 조사를 반복하여 관심 영역의 모든 뉴런을 치료합니다..

이미지를 다시 캡처하고 처리 전 이미지와 비교합니다. 레이저 치료 후 형광 손실은 성공적인 신경 절제를 확인합니다.

아가로스 포매 유충을 2광자 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓고 현미경 시스템을 시작합니다. 이미지 획득 소프트웨어를 열고 레이저 탭에서 켜기 버튼을 클릭하여 레이저를 켭니다. 레이저 상태가 사용 중에서 잠금 모드로 바뀔 때까지 기다립니다.

채널 탭에서 레이저의 파장을 EGFP 절제의 경우 880나노미터, GcAMP 절제의 경우 800나노미터로 설정합니다. 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 20배 대물 렌즈를 선택합니다. 그런 다음 찾기 탭을 클릭합니다. GFP를 클릭하여 광학 경로를 변경하고 눈으로 형광을 직접 봅니다. 제브라피쉬 유충 뇌를 시야의 중앙에 배치합니다. 그런 다음 획득 탭을 클릭하여 2광자 현미경으로 돌아가 레이저 출력과 이득을 설정합니다.

절제 전 조건의 기록으로 Z-Stack을 클릭하여 Z-Stack 옵션을 선택합니다. 그런 다음 유충 뇌의 복부 끝에 초점을 맞춘 후 먼저 설정 버튼을 클릭하여 하한을 설정합니다. 그리고 뇌의 가장 등쪽 표면에 초점을 맞춘 후 마지막으로 설정 버튼을 클릭하여 상한을 설정합니다. 마지막으로 실험 시작 버튼을 클릭하여 Z-Stack 이미지 획득을 실행합니다.

그런 다음 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 63x 대물 렌즈를 선택합니다. 그런 다음 찾기 탭을 클릭하여 낙산화형광 현미경으로 전환합니다. 눈으로 절제할 세포를 중앙에 배치합니다. 그런 다음 획득 탭을 클릭하여 레이저 스캐닝 현미경으로 돌아갑니다.

획득 모드 탭에서 프레임 크기를 256 x 256으로 설정합니다. 라이브를 클릭하고 관심 있는 뉴런을 관찰합니다. 그런 다음 가장 등쪽에서 시작하여 절제할 세포에 초점이 맞춰져 있는 초점면을 찾습니다. 영역 기능을 사용하여 각 뉴런의 직경 세포 크기의 약 1/3에 해당하는 작은 원형 영역을 ROI로 표시합니다.

스캔 속도를 256 x 256픽셀당 13.93초로 설정하며, 이는 픽셀당 약 200마이크로초 또는 반미크론당 200마이크로초의 레이저 체류 시간에 해당합니다. 또한 반복 주기를 4회 반복으로 설정합니다. 실험 시작을 클릭하여 시계열 및 표백 함수를 실행합니다. 시계열 주기에서 절제 전 이미지와 절제 후 이미지를 비교하여 표적 세포의 형광이 사라졌는지 확인합니다.

그런 다음 초점면을 약간 더 깊게 이동하고 제거되지 않은 셀이 나타나는 다음 초점면을 선택합니다. 방금 시연한 대로 표백 기능을 수행하고 관심 있는 신경 구조의 모든 세포가 제거될 때까지 이 과정을 반복합니다. 절제 후 세포에 형광이 제거되었는지 확인하고 필요한 경우 레이저 조사를 반복합니다.