Zebrafish의 단세포 운명 매핑

다음 실험의 전반적인 목표는 제브라피시 배아에서 선택된 단일 세포의 운명 매핑 및 계통 추적을 수행하는 것입니다. 이는 케이지에 갇힌 플루오레세인을 고분자량 덱스트란에 화학적으로 결합함으로써 달성됩니다. 다음으로, 준비된 케이지 플루오레세인 덱스트란을 제브라피시 배아에 마이크로 주입한 다음 두 개의 광자 흡수를 사용하여 선택한 세포에서 광활성화시킵니다.

배아의 광활성화 후, 활성화된 세포의 운명 매핑을 위해 케이지되지 않은 플루오레세인 덱스트란을 검출하기 위해 면역조직화학 분석을 수행합니다. 궁극적으로 이 방법은 광활성화 단세포의 계통 기여도 및 조직 국소화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 표준 형광 현미경 검사법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 믿음 매핑을 위해 단일 세포를 구별하여 라벨링하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 미분화 전구체 세포가 다양한 조직 유형에 어떻게 기여할 수 있는지와 같은 발생 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 배아 장착 및 사진 활성화 단계는 텍스트 설명만으로는 배우기 어렵기 때문에 시각적 시연이 중요합니다. 시작하기 전에 케이지 플루오레세인 덱스트란을 합성하고 금속 호일로 덮인 튜브에 보관하십시오. 그런 다음 1-2 세포 단계에서 합성된 케이지 플루오레세인 덱스트란을 사용하여 배아를 마이크로 주입합니다.

배아가 적절한 발달 단계에 도달한 후 코팅을 합니다. 그런 다음 코팅된 배아를 저융점 에어로에 장착하여 사진 활성화를 합니다. 발생이 응고되면 LSM five 10 소프트웨어를로드합니다.

백색광 빔 경로에 투명한 노란색 필터를 배치한 다음 새 이미지 스캔을 선택하고 전문가 모드 시작을 클릭합니다. 레이저 탭을 선택하고 아르곤 아이언과 mi tai 레이저 소스를 켭니다. mi tai 파장을 7 40 나노 미터로 설정하십시오.

그런 다음 구성 탭을 선택합니다. 아르곤 이온 및 mi tai 레이저에 대한 광학 경로 구성을 설정합니다. 그런 다음 스캔 탭을 선택합니다.

목표를 20 곱하기 0.8로 변경합니다. 최대 설정 모드 방법 및 숫자를 클릭하여 최대 스캔 속도를 설정하고 채널 탭에서 각각 하나를 라인 평균으로 설정하고 mi tai를 제외한 모든 레이저 소스를 선택 취소합니다. 그런 다음 광학 빔 경로에 파워 미터를 배치한 다음 con 버튼을 선택하여 연속 스캔을 활성화합니다.

파워 미터가 평균 47밀리와트의 레이저 출력을 읽을 때까지 전송 백분율을 조정합니다. 그런 다음 채널 탭에서 중지 버튼을 선택하여 스캔을 중지합니다. mi tai 레이저 소스를 선택 취소하고 아르곤 아이언을 선택합니다.

그런 다음 채널 탭에서 빠른 XY 버튼을 다시 선택하고 핀홀을 조정합니다. 게인을 감지하고, 오프셋을 증폭하고, 아르곤 철 레이저가 최상의 이미지 품질을 얻을 수 있도록 다시 증폭합니다. 스테이지 컨트롤러를 사용하여 활성화할 셀을 찾아 초점을 맞춘 다음 중지 버튼을 클릭합니다.자르기 도구를 사용하여 모드 탭 아래의 자르기 계수가 50에서 70으로 표시되도록 활성화된 셀을 자릅니다.

그런 다음 채널 탭에서 중지 버튼을 선택하여 스캔을 중지합니다. 아르곤 이온 레이저를 선택 취소하고 모드 탭에서 My Tai 레이저를 선택합니다. 스캔 속도를 31.46초로 설정합니다.

그런 다음 단일 버튼을 선택하여 선택한 세포의 케이지 플루오레세인 덱스트란의 두 광자 활성화에 대한 스캔을 시작합니다. 활성화 후 채널 탭으로 이동하여 mi tai 레이저를 선택 취소하고 아르곤 이온 레이저를 다시 선택하십시오. 그런 다음 모드에서 확대/축소 계수를 1로 설정합니다. 다음.

속도 제목 아래에서 최대 버튼을 클릭하여 가장 빠른 스캔 속도를 설정합니다. 사진이 활성화된 영역을 검토하려면 fast xy를 선택합니다. 그런 다음 채널 탭을 선택하고 핀홀을 조정하고 다시 감지하고 광 활성화 영역이 레이저로 절제되지 않았는지 확인합니다.

사진을 준비한 후, 첨부된 원고에 요약된 프로토콜에 따라 unaged fluorescein dextran immuno 검출을 위해 활성화된 배아를 활성화했습니다. 배아를 PBT에서 6회, AP 완충액에서 2회 세척합니다. 그런 다음 배아를 AP 완충액에 있는 9개의 웰 플레이트로 옮깁니다.

다음으로, AP 버퍼를 흡인하고 N-B-T-B-C-I-P를 추가합니다. N-B-T-B-C-I-P 용액을 흡인하여 N-B-T-B-C-I-P 염색 발생을 중지합니다. 그런 다음 배아를 PBT로 세척합니다.

이제 배아를 회수하고 실온에서 5분 동안 회전하는 플랫폼에서 흔듭니다. 그런 다음 세척 PBT를 두 번 더 반복합니다. 마지막으로, 배아를 0.6% 낮은 용융으로 장착하고 정립 복합 현미경을 사용하여 광활성화 세포의 이미지를 획득합니다.

이 그림에서 왼쪽에는 명시야 이미지, 오른쪽에는 광활성화 전 우리에 갇힌 fluorescein dex strand micro 주입된 제브라피시 배아의 형광 이미지가 표시됩니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 배아는 7 40 나노미터의 파장, 31초의 스캔 시간, 47 밀리와트의 평균 레이저 출력으로 왼쪽 명시야 그림의 화살표로 표시된 솜씨 중 하나에서 광활성화되었습니다. 오른쪽 게시물의 그림에서 이 그림에서 unaged fluorescein dextran의 사진 활성화 형광을 관찰할 수 있습니다.

unaged fluorescein dextran의 면역 염색은 측판의 작은 영역, 10의 중배엽으로 묘사됩니다. 따라서 진드기 배아는 면역 검출 절차를 사용하여 이전 그림과 동일한 레이저 매개변수를 사용하여 광활성화되었습니다. 여기에서 화살표로 표시된 활성화 영역은 이 절차에 따라 최소한의 배경 염색으로 식별할 수 있습니다.

표지된 세포의 위치와 운명을 더 잘 특성화하기 위해 다른 조직 특이적 마커에 대한 면역 염색과 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 혈관 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시 배아 발달 과정에서 정맥 전구 세포의 동맥 기원을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. NBT 및 BCIP와 같은 화학 시약으로 작업할 때 매우 위험할 수 있으므로 항상 장갑을 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.