공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 절차는 단세포 얼룩말 배아를 주입 몰드에 넣어 세포가 주사 장치와 반대편을 향하도록 하는 것으로 시작됩니다. 배아는 노른자를 통과해 세포 안으로 들어가는 방식으로 MRNA를 주입합니다. 다음 날.

플라스틱 장착 슬라이드는 아로스로 채워져 있습니다. 마취된 배아는 공초점 현미경으로 영상화한 무로스의 구멍에 역전시되어 배치됩니다. 안녕하세요, 저는 MIT 생물학과의 화이트헤드 생의학 연구소 헤이즐 시브 박사 연구실의 그랩햄입니다.

오늘은 단일 세포 단계에서 제브라피시 배아를 주입하고, 이후 공초점 현미경을 이용한 뇌의 생체 영상을 보여주는 절차를 보여드리겠습니다. 우리 연구실에서는 이 절차를 이용해 척추동물 뇌의 형태 발생을 단일 세포 해상도로 연구합니다. 그럼 시작해볼까요.

이 절차에 사용되는 mRNA는 C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A 막 결합 GFP를 암호화한 플라스미드에서 전사됩니다. 먼저 플라스미드를 하나 이하로 소화하여 선형화한 후, mRNA가 전사된 후 M 메시지와 기계 키트를 사용해 선형성된 플라스미드에서 막 GFP mRNA를 전사하여 결과 mRNA와 물을 1마이크로리터당 1마이크로그램으로 희석합니다. 엘로콰를 사용하고, 필요할 때까지 영하 80도에서 보관하세요. 주사 전날에는 짝짓기 우리를 설치하여 수컷과 암컷을 분리합니다. 세터 기기 마이크로피펫 폴라를 사용해 모세관 바늘을 뽑아 주입하세요.

주입 당일, 1% AGA 장미 주입 몰드를 준비하고, 1 마이크로리터당 1마이크로리터 농도로 세포 폭 레인을 가진 사출 몰드를 얼음 위에 해동합니다. mRNA를 물에 1에서 5번 희석하여 최종 농도는 200 나노그램/마이크로리터로 만들고 얼음 위에 보관합니다. 모세관 바늘에 준비된 막 1마이크로리터, GFP mRNA를 마이크로리터당 200나노그램으로 주입합니다.

여기서는 주사 시 mRNA를 가시적으로 보이게 하기 위해 0.05%의 페놀 레드를 첨가합니다. 장전된 바늘을 가스 동력 마이크로 인젝터에 연결된 마이크로 매뉴퓰레이터에 넣습니다. 주입량을 1나노리터로 조정하세요.

다음으로, 전날 번식용 우리에 설치된 야생형 물고기의 칸막이를 당기세요. 배아가 낳히자마자 바로 수거하세요. AGA 로즈 주입 몰드에 배아 배지를 채우고, 마이크로 매니퓰레이터 쪽에 단일 세포를 배치합니다.

코리온과 노른자를 통해 주입하여 mRNA가 단일 세포에 직접 침착되도록 합니다. 한 번에 약 50개의 배아를 주입하세요. 하지만 세포가 분열한 경우, 배아를 주입한 후에는 주입하지 말고, 배아 배지에서 28도 섭씨에서 하룻밤 배양하세요.

하룻밤 배양 후 주입된 배아는 장착 및 영상 촬영을 위해 준비됩니다. 이 절차를 시작하려면, 관심 시점 1시간 전에 입체 현미경 아래에서 핀자로 배아에서 코리온을 제거하고, 최대 네 개의 배아를 장착할 수 있는 슬라이드를 준비하세요. 그 다음 슬라이드 상단 바로 위에 0.7%의 aros를 채우고 약 20분 또는 aros가 굳어질 때까지 기다립니다.

무로스가 굳어지면, 200마이크로리터 피펫 팁을 사용해 에어로스에 작은 구멍을 내어 각 배아를 장착할 원통형 구멍을 만듭니다. 부착하기 전에 아로스 플러그를 집자로 제거하세요. 배아를 에어로가 채워진 슬라이드 위에 해부 현미경 아래 올려놓습니다.

마취를 위해 50마이크로리터의 트리카를 추가하세요. 배아들. 겸자를 사용해 아로스의 원통형 구멍에 배아를 거꾸로 배치하고, 뇌나 관심 부위를 아래 덮개 덮개 덮개에 대고 위치시킵니다.

AGA의 배아들은 또 다른 커버 슬립과 함께 부활하고 실리콘 진공 그리스로 고정했습니다. 배아는 이제 영상 촬영 준비가 완료되었습니다. 여기 보이는 역형광 레이저 주사 공초점 현미경을 사용해 배아를 영상화하거나, 63배 이상의 회전 디스크 공초점 현미경 이미지를 사용해 신경상피 내 단일 세포의 고해상도 이미지를 수집할 수 있습니다.

이미지는 LSM 소프트웨어에서 TIF 파일로 내보내져 포토샵으로 분석됩니다. 이 이미지는 24시간 제브라피시 배아의 대표적인 공초점 이미지로, 중뇌와 후뇌 뇌실 사이의 신경상피입니다. M은 중뇌, 심실을, H는 후뇌실을 나타냅니다.

각 세포는 막에 결합된 GFPE로 표지됩니다. 우리는 발달 중인 제브라피시 뇌를 단일 세포 해상도로 분석할 수 있는 기법을 방금 시연했습니다. 이 기법 덕분에 BA 기저 수축이라 불리는 새로운 세포 형태 변화를 연구할 수 있게 되었습니다.

또한 다른 유형의 현상을 분석하고 척추 기관형성과 그 근저 세포 생물학에 대한 이해를 크게 확장하는 데 사용될 수 있습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사하고, 실험 잘 하시길 바랍니다.