Microfluidic 장치를 사용하여 셀 캡처

우리가 준비한 장치는 10개 또는 20개의 키트로 포장되어 도착하면 상자에 담겨 차갑게 배송되며 키트에는 실행해야 하는 모든 구성 요소가 포함되어 있습니다. 키트의 실험은 실온에 남아 있을 수 있는 모든 주사기와 완충액이 들어 있는 패킷입니다. 이 실험에서 따를 프로토콜의 사본도 있습니다.

또한 실제 장치와 냉장 보관해야 하는 모든 실행 중인 버퍼가 들어 있는 냉장 상자도 있습니다. 일반적으로 키트는 10개 또는 20개의 그룹으로 포장됩니다. 키트를 사용하지 않을 때는 냉장 보관해야 합니다.

각 주사기와 각 키트 구성 요소에는 신중하게 레이블이 지정되어 있으며 레이블은 우리가 따르는 프로토콜의 표에 해당합니다. 따라서 개별 단계에서 어떤 주사기 또는 키트 구성 요소를 사용해야 하는지에 대한 모호함이 없습니다. 장치의 포장을 풀고 생물 안전 캐비닛에 넣은 후, 우리는 호중구를 분리하고 다운스트림 게놈 응용 프로그램을 위해 용해하는 절차를 수행할 것입니다.

그렇기 때문에 우리는 멸균 의미뿐만 아니라 환경에 일반적으로 존재하는 RNA가 깨끗한지 확인하기를 원합니다. 따라서 RNA를 파괴하는 솔루션으로 모든 영역과 장치를 닦는 것이 매우 중요합니다. 따라서 일반적으로 우리는 RNA SAP 또는 RNA로 모든 도구와 작업 표면을 닦아내며, 이는 여러 제조업체에서 구할 수 있습니다.

이 장치는 열 밀봉 파우치에 포장되어 제공됩니다. 각 장치에는 이 바코드가 밀봉되고 바코드가 찍혀 있습니다. 임상 샘플로 작업하는 경우 이 바코드를 기록해 두어야 합니다.

따라서 장치의 밀봉이 풀리고 덮개가 벗겨져 펌프 홀딩 매니폴드 장치에 배치됩니다. 우리가 사용하는 혈액 샘플은 전혈 샘플입니다. 우리는 표준 1mil BD 주사기를 통해 그것을 흘려보낼 것이고, 이것은 주사기 1이라고 표시되어 있습니다.

패키지에서 주사기를 제거하고 혈액 튜브에서 캡을 조심스럽게 제거하는 것입니다. 700마이크로리터 또는 0.7mil의 혈액을 떨어뜨리고 그 절반인 350마이크로리터를 1.5mil 튜브에 주입합니다. 감사. 그렇게 하면 혈액이 추가 처리를 위해 전달될 수 있습니다.

혈액 튜브는 전달될 수 있지만 장치 고장의 경우 여전히 더 많은 혈액이 남아 있습니다. 이제 우리가 할 일은 혈액이 들어있는 주사기를 이 바늘 위에 넣는 것입니다. 우리는 미세유체 절연 장치와 함께 매우 함께하고 싶습니다.

우리는 기포가 장치 내부로 유입되거나 장치가 오작동하지 않도록 매우 주의하고 싶습니다. 그래서 일반적으로 우리가 하는 일은 주사기를 가져다가 플런저를 아래로 누르고 액체를 장치의 상단 표면에 넣고 모든 액체를 배출하기 전에 완전히 결합되었는지 확인하는 것입니다. 우리는 멈추고 바늘에서 주사기 본체를 조심스럽게 제거하고 기본적으로 바늘 끝 또는 바늘의 루어 커넥터에 이 주사기에 있는 나머지 버퍼로 채웁니다.

우리는 그것을 처분합니다. 그런 다음 주사기에 혈액을 주입하여 이 루어 허브에 삽입할 것입니다. 피를 흘리지 않도록 주의하고 기포가 유입되지 않도록 주의합니다.

피가 엎질러질 경우를 대비하여 주사기의 몸체와 튜브를 잡고 있는 케모를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 일단 주사기가 튜빙 하우징이나 바늘에 연결되면 주사기를 몇 번 날카롭게 두드려 커넥터에 있을 수 있는 기포를 제거합니다. 그런 다음 이 주사기를 주사기 펌프에 넣은 다음 잠금 나사로 고정합니다.

주사기 펌프가 켜져 있고 이미 흐름 조건에 맞게 사전 설정되어 있습니다. 우리는 이 혈액을 분당 30마이크로리터의 속도로 장치를 통해 흐를 것입니다. 주사기 본체가 주사기 펌프에 로드되면 이동식 플런저 암의 버튼을 누르고 플런저 상단에 닿을 때까지 아래로 밀어 넣고 이 끝을 통해 유체를 밀어내기 시작합니다.

뭉툭한 끝, 스테인레스 스틸 바늘입니다. 시스템이 준비되었다는 것을 알게 되면 실행을 누릅니다. 혈액의 흐름을 시작하려면 정지를 눌러 혈액 흐름을 멈춘 다음 깨끗한 1.5mil 원심분리기 튜브 또는 펜더 튜브를 사용하여 조심스럽게 플러그를 뽑습니다.

하나만 분리하고 장치의 한 포트에서 튜브를 뽑습니다. 이 튜브의 플러그를 뽑으면 1.5mil 펜더 튜브에 삽입합니다. 달리기를 눌러 혈류를 다시 시작합니다.

그리고 혈액 한 방울이 보이면 펌프를 멈추고 장치에서 방금 연 흡입구에 삽입합니다. 달리기를 눌러 혈액 흐름을 시작하고 타이머를 5분으로 설정합니다. 우리는 혈액이 모든 챔버를 균등하게 채우고 장치에 명백한 기포가 없는지 확인하고 싶습니다.

챔버 중 하나로로의 흐름을 막고 있는 기포가 있는 경우, 핀셋 한 쌍을 가져다가 포획 챔버 또는 포획 챔버에서 나오는 작은 채널로 이어지는 작은 채널을 따라 실행할 수 있습니다. 이 장치는 잘 채워지고 있으므로 5 분 후에 주사기 펌프의 정지를 눌러 혈액의 흐름을 멈추고 주사기 클램프를 풀고 주사기 펌프 홀더에서 꺼냅니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 PBS가 들어 있는 3번 주사기를 사용할 것입니다. 기본적으로 기포를 피하기 위해 장치 표면이 결합되어 있는지 확인하고, 주사기를 두드려 기포를 만들고, 기포가 주사기 본체 상단에 있는지 확인합니다.

주사기 펌프의 암을 풀고 3 밀 주사기를 펌프에 삽입합니다. 주사기를 단단히 조인 다음 주사기의 플런저에 닿을 때까지 플런저를 아래로 누릅니다. 실행을 누르고 액체가 장치를 프라이밍할 때까지 기다렸다가 스테인리스 스틸 바늘 끝에 물방울이 보일 때까지 기다립니다.

방울이 형성되는 것을 보면 펌프를 멈춥니다. 우리는 피, 피가 들어 있는 스테인리스 스틸 끝을 제거할 것입니다. 세척 버퍼를 삽입하고 실행을 누릅니다.

그리고 우리는 이것을 5분 동안 실행하도록 할 것입니다. 그리고 당신은 깨끗한 닦음을가지고 입구 또는 출구에있을 수있는 소량의 혈액을 닦아야합니다.5 분 동안 장치를 통해 세척 버퍼를 실행 한 후 장치에서 혈액을 완전히 제거해야하며 기본적으로 장치에 붉은 피가 남아 있지 않다는 것을 알 수 있습니다. 장치가 선명하게 보입니다. 그래서 우리가 할 일은 5분이 지나면 세척 버퍼가 실행되는 것을 멈추는 것입니다.

그리고 다시, 주사기 펌프에서 주사기를 제거할 것입니다. 1.5mil 마이크로 원심분리기 튜브를 유연한 배출구 튜브에 바로 덮을 것입니다. 그리고 우리는 튜브, 마이크로 원심분리기 튜브를 조심스럽게 들어 올려 장치에서 폐기물 튜브를 빼낼 것입니다.

우리는 그것을 생물학적 위험 용기에 버릴 것입니다. 키트에는 실제로 테프론으로 만들어진 새로운 배출 튜브가 있습니다. 다시 스테인리스 스틸 팁이 있습니다.

기존 배출구 튜빙을 이 새로운 배출구 튜빙으로 교체할 것입니다. 우리는 그 배출구 튜브를 가져와서 U 또는 V 모양으로 구부리려고 할 것입니다. 그리고 키트와 함께 카야 슈레더 컬럼이 있는데, 이것은 DNA를 깎아내고 기본적으로 세포 생명을 균질화합니다.

그래서 우리는 파쇄기 컬럼의 보라색 캡을 열고 배출 튜브를 Kay 파쇄기 컬럼에 넣을 것입니다. 우리는 키트 주사기 번호 2에서 RLT를 위해 사용할 것이라고 말합니다. 22게이지 무딘 팁, 스테인리스 스틸이 있는 표준 BD 1mil to syringe입니다.

이를 사용하여 kyogen의 표준 RLT 350마이크로리터를 장치에 주입할 것입니다. 이 장치에는 약 50마이크로리터의 데드 볼륨이 있기 때문에 우리가 원하는 것은 RLT를 주입하는 것이지만 RLT 뒤에는 공기 플러그를 주입하여 장치의 데드 볼륨을 chi 슈레더 컬럼으로 방출하고 싶습니다. 그래서 우리가 할 일은 주사기를 가지고 당기고 350마이크로리터의 공기를 빨아들인 다음 350마이크로리터 또는 0.35mil의 RLT를 빨아들이고 RLT는 이제 주사기의 맨 아래에 있습니다.

주사기를 뒤집고 공기를 주입하려는 유혹을 물리치십시오. 공기는 모든 RLT를 Kay 파쇄기 기둥으로 가져올 수 있도록 합니다. 세탁 버퍼에서 튜브를 꺼낼 것입니다.

RLT와 함께 주사기를 삽입하고 약 30초 동안 RLT를 장치에 천천히 주입하여 배출 튜브가 폐기물을 chi 슈레더 컬럼으로 배출하는지 확인합니다. 공기가 장치에 주입되기 시작하면 플루머를 누르고 모든 유체가 Kay 슈레더 컬럼으로 방출될 때까지 기다립니다. 우리는 케이 슈레더 칼럼을 만들고 15, 000 RPM 또는 벤치 탑 마이크로 센터 퓨즈에서 최대 RPM의 균형을 가진 마이크로 센터 퍼그에서 2 분 동안 회전시킵니다.

따라서 컬럼을 2분 동안 회전시킨 후 RLT에 있는 샘플을 추출하여 제공된 보라색 캡 극저온 바이알 중 하나에 넣을 것입니다. 임상 샘플로 작업하는 경우 이 극저온 바이알을 샘플링하고 실험을 시작할 때 라벨을 지정합니다. 다음은 극저온 바이알의 용해물입니다.

이 극저온 바이알은 즉시 영하 80도의 AC C 냉동고에 넣고 선적 또는 나중에 RNA 추출을 위해 보관합니다. 이것은 호중구 분리를 위한 대체 프로토콜입니다. RLT 완충액으로 세포를 용해하는 대신 표준 조직학적 염색으로 세포를 염색할 것입니다.

얼룩. 그래서 우리는 장치에 밀봉 된 장치를 가방에서 꺼내 다시 포장을 풀고 장치의 로트 번호를 기록하고 페트리 접시를 놓습니다. 페트리 접시 홀더에.

우리는 1번 주사기 가방에서 1mil 주사기를 꺼내 700마이크로리터의 혈액을 장전하고 그 중 절반인 350마이크로리터를 eend DPH 튜브에 주입할 것입니다. 그 점은 접어두겠습니다. 우리가 선택하는 데 사용할 튜브가 있는 주사기 4를 예로 들어 장치에 혈액을 주입합니다.

화학 방식으로 튜브 끝에서 바늘 바닥을 잡을 것입니다. 주사기 본체를 벗기고 루어를 채웁니다. 어댑터는 해당 주사기를 버퍼링하고 폐기합니다.

화학 물티슈를 사용하여 주사기가 들어있는 혈액을 바늘에 삽입하여 엎질러진 것을 모을 것입니다. 주사기를 두드려 바늘과 주사기 본체 사이의 연결부에서 기포를 제거합니다. 주사기를 주사기 펌프에 로드하고 주사기 펌프의 움직이는 암을 눌러 튜브를 프라이밍하거나 튜브를 준비합니다.

장치의 콘센트 중 하나인 캡처 장치에서 튜브를 분리하고 1.5mil einor 튜브에 넣습니다. 그런 다음 주사기 펌프를 눌러 혈액이 흐르기 시작합니다. 스테인리스 스틸 끝에서 핏방울이 형성될 때까지 기다립니다.

물방울이 형성되면 중지를 누르고 해당 혈액을 두드리고 장치에 삽입한 다음 실행을 누릅니다. 이제 타이머를 5분으로 설정합니다. 좋아요, 5분 동안 장치를 통과한 후 주사기 펌프의 중지를 누르고 주사기를 놓습니다.

그리고 우리는 그 주사기를 우리의 세척 버퍼가 들어 있는 3mil 주사기로 교체할 것인데, 이 주사기는 XPBS 1개에 불과합니다. 다시 말하지만, 우리는 장치의 상단이 끼워져 있는지 확인한 다음 혈액 또는 플러스 런이 들어있는 바늘 끝을 제거하려고합니다. 장치 프라이밍을 시작합니다.

우리는 물방울 형태를 만들 것이고, 그것을 장치에 삽입하고 입구 또는 출구 튜브에 있는 혈액을 가볍게 두드리고 세척 단계 후 5분 동안 혈액이 흐르도록 할 것입니다. 다시 말하지만, 실린지 펌프를 멈추고 펌프 홀더에서 실린지를 제거합니다. 표준 GIM 유지를 수행하려면 먼저 100% 메탄올을 사용하여 세포를 고정하고 탈수할 것입니다.

그래서 우리는 메탄올이 미리 적재된 3mil 주사기인 주사기를 가지고 있습니다. 다시 말하지만, 주사기를 프라이밍하고, 메탄올이 흐르고 있는지 확인하고, 주사기 펌프를 중지하고, 장치에 삽입하고, 실행을 누릅니다. 이 메탄올 용액에서 2-4분 동안 고정할 것입니다.

그래서 2-4분 동안 메탄올을 고정한 후 펌프를 멈추고 메탄올이 든 주사기를 방출한 다음 시그마에서 1-5로 희석한 시그마의 eem sustain standard eem sustain을 포함하는 3mil 주사기를 로드합니다. 희석한 후 주사기에 넣고 주사기 끝에 0.8미크론 필터를 부착하여 장치를 막을 수 있는 입자를 걸러냅니다. 5분에서 10분 동안 얼룩을 묻힙니다.

그런 다음 Deion i의 물로 헹굽니다. 따라서 5분에서 10분 동안 염색한 후 주사기 펌프를 멈추고 염색 버퍼가 있는 주사기를 탈이온수가 들어 있는 주사기로 교체한 다음 기본적으로 SAI의 파란색이 장치에서 세척될 때까지 세척할 것입니다. 장치에서 여분의 김 서스테인을 헹구면 세척 용액을 중지합니다.

그런 다음 우리가 할 일은 유입구에서 물 주사기를 제거하는 것입니다. 그런 다음 장치의 배출 튜브를 가져갈 것입니다. 핀셋으로 끝에 있는 튜브를 잡을 것입니다.

이것은 유연한 tigon 튜브이며 장치의 입구에 다시 삽입할 것입니다. 이것은 장치를 밀봉하고 세포를 수화시키고 형태를 그대로 유지합니다. 이제 제 동료인 John Hong Chang 박사는 CD 4개의 양성 림프구를 분리한 다음 미세유체 장치 내에서 직접 면역형광 염색을 위한 대체 프로토콜을 보여줄 것입니다.

그래서 제 이름은 Shong 홍홍이고 오늘 저는 당신에게 이 단계에서 microfluidic 장치에 있는 세포 염색이 이미 보여줄 수 있습니다 마이크로 flic 면역 친화력 고립 장치를 사용하여 전례 없는 전혈에서 혈구를 특별히 분리하는 방법을 보여줄 것입니다. 그의 목적을 위해, 그는 세포를 이가 만들고 그 고립된 세포에서 단백질과 DNA 함량을 얻기를 원합니다. 글쎄요, 제 연구의 목적을 위해, 저는 세포를 채취한 다음 세포 수를 구하는 것, 예를 들어 전혈에서 CD 4 세포 수를 구하고 그것을 진단 목적의 지표로 사용하는 데 관심이 있습니다.

따라서 사용하는 장치는 Ken의 장치와 매우 유사합니다. P-D-M-S-A 스트레이트 챔버로 만들어졌습니다. 형상이 약간 다르기 때문에 작동 매개변수가 약간 다르지만 일반적으로 전체 작업 절차는 매우 유사합니다.

따라서 모든 세포 포획 및 헹굼 단계를 건너뛰고 세포 계수 절차의 세포 염색 단계로 바로 이동하겠습니다. 여기 전혈에서 이미 절반의 세포를 채취한 장치가 있고 이 장치는 이미 PBS로 헹궈져 있습니다. 그래서 아웃바운드 세포는 이미 장치에서 씻겨 나갔고 저는 장치에 격리된 세포를 라벨링하는 데 특별히 사용되는 항체 혼합물을 미리 준비했습니다.

따라서 여기에서 사용한 항체 농도는 형광 현미경에서 매우 높은 형광 강도로 세포를 염색하는 데 최적화되어 있습니다. 따라서 절차는 매우 간단합니다. 항체 용액으로 채워진 주사기를 주사기 펌프에 로드한 다음 유속이 필요한 올바른 매개변수로 설정되었는지 확인합니다.

그런 다음 주사기 펌프를 시작하고 튜브의 끝을 관찰하고 용액이 이미 나와 튜브에 더 이상 기포가 없는지 확인합니다. 그런 다음 튜브를 우리가 포획한 세포가 있는 미세유체 장치에 연결할 수 있습니다. 이제 항체가 장치로 유입되어 분리된 세포를 염색하고 있으며, 이 장치에서는 분당 5마이크로리터를 사용하고 있지만 장치의 형상에 따라 용도에 따라 다른 흐름 매개변수가 있을 수 있습니다.

그리고 우리는 항체 용액 흐름을 5분 동안 랩핑할 것인데, 이는 마이크로pho 채널 내의 모든 용액을 대체하기에 충분한 양입니다. 따라서 항체 주입 후에, 우리는 교류를 멈출 것입니다. 그래서 우리는 5분 동안 분당 5마이크로리터의 속도로 항체를 부유시켜 마이크로채널 내의 모든 용액을 대체합니다.

그 후 흐름을 멈추고 장치를 배양하고 30 분 동안 실온으로 유지합니다. 따라서 이 작업은 어두운 곳에서 수행되어야 합니다.항체는 담금질되지 않는 반면 세포, 형광 항체는 세포가 염색 항체와 함께 배양되는 동안 담금질될 수 있습니다. 따라서 보통 15분에서 30분 동안 염색한 후 장치에서 튜브의 플러그를 뽑고 항체 주사기를 완충 주사기로 교체하여 장치에서 결합되지 않은 항체를 씻어냅니다.

따라서 여기의 세척 용액에는 PBS 용액에 1%BSA가 포함되어 있습니다. BSA는 표면에서 항체의 비 결합을 차단하는 데 사용되며 동일한 작업을 수행합니다. 따라서 먼저 주사기 펌프의 유속을 조정하여 원하는 올바른 유속인지 확인한 다음 주사기 펌프를 시작하고 장치에 연결하기 전에 튜브에서 실제로 액체가 나오는지 확인합니다.

그렇게 하는 목적은 튜브에 남은 것과 같은 거품이 남아 있지 않다는 것입니다. 따라서 주입할 때 장치에 거품이 들어가지 않습니다. 그래서 우리는 튜브를 장치에 꽂고 5분 동안 더 흐르게 하여 장치에서 모든 세척 물질, 모든 결합되지 않은 항체를 교체합니다.

세척 단계가 끝나면 1%PFA로 셀을 고정합니다. 그렇게 하는 목적은 이미징을 즉시 수행할 수 있는 경우 장치를 몇 주에서 최대 몇 주 동안 보관할 수 있도록 하는 것입니다. 따라서 절차는 매우 간단합니다.

우리가 전에 했던 것과 비슷합니다. 주사기를 펌프에 로드하고 유속을 원하는 속도로 조정한 다음 주사기 펌프를 시작하고 튜브를 장치에 연결하여 세포를 고정하기 위해 장치에 고정제인 파라폼 IDE 솔루션을 주입합니다. 다시 말하지만, 우리는 약 5분 동안 흐르게 했습니다.

따라서 PFA는 장치의 모든 버퍼를 교체하여 장치의 모든 셀을 고정합니다. 따라서 PFA 고정 단계가 끝나면 PFA 주사기를 제거하기만 하면 이제 장치를 이미징할 준비가 됩니다. 어떤 경우에는 세포 표면 마커 염색과 오버레이하기 위해 핵 염색을 원합니다.

따라서 이를 위해 마지막에 DPI를 사용하여 핵 염색을 수행합니다. 따라서 DPI 주사기를 로드하고 주사기 펌프를 켜고 DPI를 장치로 흐르게 하기만 하면 됩니다. 이제 세포의 위치를 보여주기 위해 그 세포에서 핵을 염색할 것입니다.

그리고 이렇게, DPI 염색 이미지는 나중에 표면 마커 염색과 중첩되어 세포가 어디에 있는지 보여줄 수 있습니다. 따라서 DPI 염색이 끝나면 버퍼 용액으로 L 대역 DPI P를 다시 씻어내야 합니다. 다시 말하지만, 1%BSA가 포함된 PBS를 사용하여 아웃바운드 dpi를 씻어냅니다.

그리고 작업은 우리가 이전에 했던 것과 유사합니다. 버퍼 주사기를 장치에 꽂기만 하면 버퍼가 장치로 흘러 들어가 바인딩되지 않은 dap를 씻어낼 수 있습니다. 그래서 그것은 마이크로 유체 장치에서 세포를 염색하는 전체 절차입니다.

그리고 모든 염색 절차가 끝나면 장치를 이미징할 준비가 된 것입니다. 또한 PFA 수정을 수행했기 때문에 장치를 몇 주 동안 보관할 수도 있습니다. 이미지 이미징을 즉시 수행할 수 없는 경우.