강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

낙하 실험의 전반적인 목표는 기계적 파괴를 사용하여 거대분자 벡터를 표적 세포에 자유롭게 전달하는 것입니다. 이는 먼저 타겟 세포 유형을 원하는 전달 물질과 함께 현탁액에 배치하고 특별히 설계된 미세유체 장치의 저장소에 적재함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 미세유체 장치는 가압되고 세포는 일시적인 멤브레인 파괴를 촉진하기 위해 세포를 압착하는 미세유체 채널 어레이를 통해 구동됩니다.

다음으로, 세포는 세포 세포질로의 물질의 확산 수송을 용이하게 하기 위해 표적 전달 물질의 존재 하에서 배양할 수 있습니다. 세포막이 수리되는 동안. 유세포 분석을 통해 거대분자의 효과적인 전달을 보여주는 결과가 얻어졌습니다.

ation 및 lipo perfection과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 다른 방법으로는 효과적으로 전달할 수 없는 까다로운 세포 유형 및 물질을 처리할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 세포 재프로그래밍을 개선하는 방법과 같은 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 암 치료 및 진단으로 확장되는데, 그 이유는 이 시스템이 면역 세포를 조작하여 항종양 효능을 향상시킬 수 있기 때문입니다.

시작하려면 여기에 표시되고 동반 텍스트 프로토콜에 세부 정보와 함께 나열된 미세 유체 장치, 장치 홀더, 플라스틱 유체 저장소 및 O-링을 제작하거나 구매한 다음 3개의 밀봉 가능한 용기에 70% 에탄올을 부분적으로 채웁니다. 장치를 첫 번째 용기에, 저장소와 O-링을 두 번째 용기에, 홀더를 세 번째 용기에 넣습니다. 그런 다음 나머지 용기를 70% 에탄올로 채웁니다.

다음으로, 저장소와 O- 링이 들어있는 용기와 홀더가 들어있는 용기를 사용하기 전에 5-10 분 동안 초음파 욕조에 넣으십시오. 이것은 이전 실험에서 오염 입자를 제거하는 데 도움이 될 것이며, 성분은 초음파 처리되어 70% 에탄올로 생물 안전 캐비닛의 작업 공간을 닦습니다. 그런 다음 3개의 용기와 핀셋 한 쌍을 포함하여 필요한 모든 재료를 70% 에탄올로 닦아내고 생물 안전 캐비닛 내부에 넣어 조립을 시작합니다.

먼저 작업 영역에 보푸라기가 적은 물티슈 두세 개를 깔아줍니다. 그런 다음 핀셋으로 에탄올 용기에서 플라스틱 저장소를 제거하고 물티슈에 올려 내부 표면에서 에탄올의 위킹 및 증발을 용이하게 합니다. 에탄올 용액을 제거하는 데 도움이 되도록 저장소를 부드럽게 두드립니다.

필요한 경우 가압 가스를 사용하여 저장소를 완전히 퍼지하십시오. 저장소가 건조되면 O-링을 저장소의 해당 슬롯에 삽입합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 칩의 앞면이 위로 향하게 하여 장치 홀더에 놓습니다.

칩이 홀더에 평평하게 놓여 있는지 확인하고 필요한 경우 핀셋을 사용하여 조정합니다. 장치가 홀더에 제대로 맞지 않으면 다음 단계에서 파손될 위험이 있습니다. 그런 다음 저장소를 홀더에 부드럽게 놓고 클립에 맞춥니다.

O-링이 슬롯 밖으로 떨어지지 않도록 하십시오. 이 과정에서 딸깍 소리가 나면서 제자리에 고정될 때까지 저장소를 부드럽게 누릅니다. 저장소의 양쪽이 고정되어 있고 칩이 올바른 위치에 있는 것처럼 보이는지 확인하십시오.

물통을 무리한 힘으로 누르지 마십시오. 압력은 1 차 또는 접착을 위해 칩을 끊을 수 있기 때문입니다. 세포주, 실험 1-2일 전에 세포를 배치하여 80% 이상 융합되지 않도록 합니다.

실험 당일. 실험 직전에 세포를 채취하여 소련을 일으키고, 배지 또는 다른 원하는 완충액에 1밀리리터에서 1,000만 개 사이의 세포로 현탁시킵니다. 그런 다음 40미크론 셀 스트레이너 메쉬를 통해 세포 현탁액을 조심스럽게 통과시켜 세포 덩어리와 매트릭스가 장치를 막는 것을 방지합니다.

일단 변형되면 300마이크로리터의 세포 현탁액을 원하는 농도의 전달 물질과 별도의 튜브에 혼합합니다. 이 시연을 위해 밀리리터당 5밀리그램의 덱스트린 2마이크로리터와 알렉사 2마이크로리터를 사용합니다. 세포 현탁액 50마이크로리터당 4 88개의 동위원소 조절 항체가 추가됩니다.

다음으로, 피펫팅으로 100마이크로리터의 세포를 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 겔 로딩 팁을 사용하여 세포와 전달 물질을 저장소 중 하나에 피펫팅하고 채워진 저장소 중 하나에 압력 튜브를 부착한 다음 매듭을 손가락으로 조여 적절한 천장을 확인합니다. 그런 다음 레귤레이터의 공기 압력을 70PSI로 조정하여 세포가 장치를 통해 이동하는 속도를 제어합니다.

압력은 각 실험에 사용된 특정 셀과 미세유체 칩 조합에 맞게 최적화되어야 합니다. 모든 준비가 완료되면 장치를 눈높이로 올리고 저장소의 액체가 쉽게 볼 수 있도록 방향을 잡습니다. 그런 다음 푸시 버튼 밸브를 눌러 저장소를 가압하고 세포 흐름을 시작합니다.

유체가 저장소에서 흐르는 속도를 관찰하십시오. 유체가 초기 유속에 비해 상당히 느려지면 장착된 장치가 막혔을 가능성이 있으므로 교체해야 합니다. 막힘으로 인한 증가된 전단은 정상적인 세포 사멸보다 더 큰 원인이 됩니다.

액체 레벨이 저장소 바닥에서 약 2mm 떨어져 있으면 조절기를 신속하게 0 PSI로 돌려 흐름을 중지하십시오. 저장소가 비워지기 전에 공기의 흐름을 멈추는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 샘플이 수집 저장소에서 배출될 수 있습니다. 그런 다음 유출 저장소에서 처리된 세포를 수집하여 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.

실온에서 정격 셀은 최대 10분 동안 물질을 계속 흡수합니다. 10분 후 세포에 추가 배지를 주입하거나 실험적 필요에 따라 세포를 계속 사용합니다. 이 단계를 반복하여 필요한 만큼 처리된 세포를 수집하고, 각 후속 샘플에 대해 C로 막힌 장치를 막고 폐기하는 경우 필요에 따라 칩을 교환합니다.

막힘 효과를 최소화하기 위해 흐름 방향을 변경합니다. 세포 수집이 완료되면 클립 암을 옆으로 밀어 메인 홀더에서 저장소를 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 재사용할 각 부품을 적절한 보관 용기에 넣고 새로운 70% 에탄올로 채웁니다.

마지막으로 사용한 모든 칩을 적절한 폐기를 위해 별도의 용기에 넣으십시오. 헬라 세포의 전달 효율 및 세포 생존율을 측정했습니다. 일련의 실험에 따라 세 가지 다른 미세유체 칩을 초당 최대 600밀리미터의 속도 범위에서 테스트했습니다.

이 테스트는 증가된 유속이 테스트된 각 칩에 대해 형광 접합 3킬로달톤 덱스트린의 세포 전달을 개선한다는 것을 보여주었습니다. 또한 속도 증가로 인해 테스트된 장치에서 세포 생존율이 약 20% 떨어졌습니다. 이 세포 사멸의 양은 상대적으로 낮으며 부적절하게 설계된 장치에서 훨씬 더 높은 경우가 많습니다.

왼쪽에 표시된 대조 세포 집단에 Pacific blue conjugated dextrin이 흡수된 것은 제한된 표면 결합 및 내세포 효과의 결과입니다. 세포는 처리된 세포와 동일한 시간 동안 전달 물질에 노출됩니다. 오른쪽에는 대조 세포와 동일한 농도의 덱스트린에 노출되는 동안 미세유체 장치를 통과하는 살아있는 세포의 집단이 있습니다.

음영 처리된 영역의 셀은 전달되지 않은 것으로 간주되고 라인 오른쪽에 있는 셀은 전달됨으로 정의됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 개발 후 납품 효율성 및 재료 기능과 같은 추가 질문에 답하기 위해 다른 방법, 수명 후 검안을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 재생 의학 분야의 연구자들이 직접 단백질 전달을 사용하여 성인 1차 세포의 세포 프로그래밍을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원하는 응용 프로그램에 대한 자체 압착 시스템을 설정하고 작동하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.