강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

낙하 실험의 전반적인 목표는 기계적 파쇄를 통해 벡터 없이 거대 분자를 표적 세포로 전달하는 것입니다. 이는 먼저 표적 세포 유형을 원하는 전달 물질과 함께 현탁액 상태로 만든 후, 특수 설계된 미세유체 장치의 저장조에 로딩함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 미세유체 장치에 압력을 가하면 세포가 일련의 미세유체 채널을 통해 이동하며, 이때 세포가 압착되어 일시적인 세포막 파쇄가 촉진됩니다.

다음으로, 물질이 세포질 내로 확산 이동하는 것을 촉진하기 위해 표적 전달 물질이 있는 상태에서 세포를 배양합니다. 이 과정에서 세포막이 복구됩니다. 유세포 분석법을 사용하여 거대 분자가 효과적으로 전달되었음을 보여주는 결과를 얻습니다.

이 기술이 electroporation 및 lipofection과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 다른 방법으로는 효과적으로 전달할 수 없는 까다로운 세포 유형과 물질들을 처리할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 세포 재프로그래밍을 개선하는 방법과 같이 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 또한, 이 시스템은 면역 세포를 조작하여 항종양 효능을 높일 수 있기 때문에, 이 기술의 영향력은 암의 치료 및 진단 분야까지 확장됩니다.

먼저, 여기에 표시되어 있고 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 상세히 기재된 미세유체 장치, 장치 홀더, 플라스틱 유체 저장조 및 O-링을 제작하거나 구매한 다음, 밀폐 가능한 용기 3개를 70% ethanol로 일부 채웁니다. 첫 번째 용기에는 장치를, 두 번째 용기에는 저장조와 O-링을, 세 번째 용기에는 홀더를 넣습니다. 그런 다음 용기의 나머지 부분을 70% ethanol로 가득 채웁니다.

다음으로, 리저보어와 O-링이 들어 있는 용기 및 홀더가 들어 있는 용기를 사용 전 초음파 세척기에 5~10분 동안 넣어둡니다. 이는 구성품이 초음파 세척되는 동안 바이오 세이프티 캐비닛 내의 작업 공간을 70% ethanol로 닦아내어 이전 실험에서 발생한 오염 입자를 제거하는 데 도움이 됩니다. 그런 다음, 세 개의 용기와 핀셋 한 쌍을 포함하여 필요한 모든 재료를 70% ethanol로 닦아 멸균하고, 조립을 시작하기 위해 바이오 세이프티 캐비닛 내부에 배치합니다.

먼저, 작업 영역에 보풀이 적은 와이프를 2~3장 깝니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 에탄올 용기에서 플라스틱 저장조를 꺼내 와이프 위에 올려두어, 내부 표면의 에탄올이 모세관 현상으로 흡수되고 증발하기 쉽게 합니다. 저장조를 가볍게 두드려 에탄올 용액의 제거를 돕습니다.

필요한 경우, 가압 가스를 사용하여 리저버(reservoir) 내부를 완전히 퍼지(purge)하십시오. 리저버가 건조되면, 리저버의 적절한 슬롯에 O-링을 삽입하십시오. 그런 다음 핀셋을 사용하여 칩의 앞면이 위로 오도록 장치 홀더에 배치하십시오.

칩이 홀더에 평평하게 놓였는지 확인하고, 필요한 경우 핀셋을 사용하여 조정하십시오. 장치가 홀더에 제대로 맞지 않으면 이후 단계에서 파손될 위험이 있습니다. 다음으로, 리저버를 홀더 위에 조심스럽게 놓고 클립에 맞춰 정렬하십시오.

O-링이 슬롯에서 빠지지 않도록 주의하십시오. 이 과정에서 리저버가 딸깍 소리가 나며 고정될 때까지 부드럽게 눌러줍니다. 리저버의 양쪽 모두가 단단히 고정되었는지, 그리고 칩이 올바른 위치에 배치되었는지 확인하십시오.

리저보어를 과도한 힘으로 누르지 마십시오. 압력으로 인해 일차 세포 또는 부착성 세포주용 칩이 파손될 수 있습니다. 세포는 실험 1~2일 전에 접종하여 합류도(confluency)가 80%를 넘지 않도록 하십시오.

실험 당일, 실험 직전에 세포를 회수하고 배지 또는 원하는 다른 버퍼에 1~10 million cells/mL 농도로 현탁합니다. 그런 다음, 세포 덩어리와 매트릭스가 장치를 막는 것을 방지하기 위해 세포 현탁액을 40 micron 세포 스트레이너 메쉬에 조심스럽게 통과시킵니다.

여과 후, 별도의 튜브에 세포 현탁액 300 µL와 원하는 농도의 전달 물질을 혼합하였다. 본 시연에서는 세포 현탁액 50 µL당 5 mg/mL 농도의 덱스트린 2 µL와 Alexa 488 동위 효소 대조 항체 2 µL를 첨가하였다.

다음으로, 파이펫팅을 통해 세포 100 µL를 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 젤 로딩 팁을 사용하여 세포와 전달 물질을 두 개의 저장소 중 하나에 파이펫팅하고, 채워진 저장소에 압력 튜브를 연결한 뒤 매듭을 손으로 조여 밀폐되었는지 확인합니다. 그 후, 레귤레이터의 공기압을 70 PSI로 조절하여 세포가 장치를 통과하는 속도를 제어합니다.

압력은 각 실험에 사용되는 특정 세포와 미세유체 칩의 조합에 맞춰 최적화해야 합니다. 모든 준비가 완료되면, 장치를 눈높이까지 들어 올려 저장조의 액체가 잘 보이도록 방향을 맞춥니다. 그다음 푸시 버튼 밸브를 눌러 저장조에 압력을 가해 세포 흐름을 시작합니다.

저장조에서 유체가 흐르는 속도를 관찰하십시오. 유체 흐름이 초기 유속에 비해 상당히 느려진다면, 장착된 장치가 막혔을 가능성이 높으며 교체가 필요합니다. 폐쇄로 인해 증가한 전단력은 정상보다 더 많은 세포 사멸을 유발합니다.

액체 수위가 저장조 바닥에서 약 2mm 정도 되었을 때, 레귤레이터를 빠르게 0 PSI로 돌려 흐름을 중단시키십시오. 저장조가 완전히 비워지기 전에 공기의 흐름을 멈추는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 시료가 수집 저장조 밖으로 튕겨 나갈 수 있기 때문입니다. 그 다음, 유출 저장조에서 처리된 세포를 수집하여 마이크로 원심분리 튜브에 넣으십시오.

실온에서 처리된 세포는 최대 10분 동안 물질을 계속 섭취합니다. 10분 후, 추가 배지를 사용하여 세포를 플레이트에 분주하거나 실험적 요구에 따라 세포를 계속 사용하십시오. 필요한 만큼 처리된 세포를 수집하기 위해 이 단계들을 반복하고, 칩이 막히면 필요에 따라 교체하며, 이후 각 샘플에 대해 막힌 장치는 폐기하십시오.

막힘 현상을 최소화하기 위해 흐름 방향을 변경하십시오. 세포 수집이 완료되면 클립 암을 옆으로 밀어 리저버를 메인 홀더에서 조심스럽게 분리하십시오. 그 다음 재사용할 각 부품을 적절한 보관 용기에 넣고 신선한 70% ethanol로 채우십시오.

마지막으로 사용한 모든 칩을 적절한 폐기를 위해 별도의 용기에 담습니다. HeLa 세포의 전달 효율과 세포 생존율을 측정하였습니다. 일련의 실험을 통해, 세 가지 서로 다른 미세유체 칩을 최대 600 millimeters per second의 속도 범위에서 테스트하였습니다.

이러한 테스트 결과, 테스트한 모든 칩에서 유속이 증가함에 따라 3 kDa의 형광 접합 덱스트린이 세포 내로 더 잘 전달되는 것으로 나타났습니다. 또한, 유속의 증가는 테스트한 장치에서 세포 생존율을 약 20% 감소시키는 원인이 되었습니다. 이러한 수준의 세포 사멸은 상대적으로 낮은 수치이며, 부적절하게 설계된 장치에서는 이보다 훨씬 높게 나타나는 경우가 많습니다.

왼쪽에 표시된 대조군 세포군으로의 Pacific blue 접합 덱스트린 흡수는 제한적인 표면 결합 및 내포 작용 효과의 결과입니다. 이 세포들은 처리군 세포들과 동일한 시간 동안 전달 물질에 노출되었습니다. 오른쪽은 대조군 세포들과 동일한 농도의 덱스트린에 노출된 상태로 미세유체 장치를 통과한 생존 세포군입니다.

음영 처리된 영역의 세포는 전달되지 않은 것으로 간주되며, 선의 오른쪽에 있는 세포는 전달된 것으로 정의됩니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 전달 효율 및 개발 후 재료의 기능성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 다른 방법이나 수술 후 분석을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 재생 의학 분야의 연구자들이 직접적인 단백질 전달을 통해 성체 일차 세포의 세포 프로그래밍을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 원하는 응용 분야에 맞춰 셀 스퀴징(self squeezing) 시스템을 설정하고 작동하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.