공초점 현미경을 이용한 면역표지 성상세포의 3차원 이미징

형광 표지된 성상세포가 있는 면역염색된 마우스 뇌 절편을 취하십시오. 성상세포의 세포질은 빨간색 형광을 발하고 핵은 파란색 형광을 발합니다.

슬라이드를 공초점 현미경의 스테이지에 적절한 대물 렌즈 아래에 놓습니다.

획득 소프트웨어를 사용하여 초점을 조정하고 성상세포의 세포질과 핵을 표지하는 형광단을 선택합니다.

라이브 이미징을 시작하고 이미징 매개변수를 최적화하여 획득한 이미지의 노이즈를 줄입니다.

획득 매개변수 (acquisition parameters) 에서 고품질 2 차원 이미지를 캡처하기 위한 저속 스캔 모드를 선택합니다.

성상세포의 최위 위치를 Z-스택의 시작점으로, 가장 낮은 위치를 끝점으로 식별합니다.

전체 셀 깊이를 덮는 슬라이스 수를 정의합니다.

슬라이스를 병합하여 성상세포의 3차원 이미지를 생성합니다.

공초점 현미경을 시작하려면 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 63x 대물렌즈를 선택합니다. 획득 소프트웨어를 연 후 획득 탭에서 Smart Setup을 클릭하고 적절한 형광단을 선택합니다. 여기서는 DAPI와 Alexa Fluor 555가 사용됩니다.

그런 다음 Best signal을 클릭한 다음 Apply를 클릭합니다. 그런 다음 노출 설정을 클릭하여 컴퓨터가 최적의 노출 매개변수를 결정할 수 있도록 합니다.

이미지를 최적화하려면 채널 창을 열고 이미지를 라이브로 전환합니다. 필요한 경우 초점을 조정하십시오. 그런 다음 1 AU를 클릭하여 핀홀을 최적화합니다. 최상의 강도를 위해 게인을 조정합니다.

마지막으로 디지털 게인을 2에서 3 사이로 설정합니다. 이 최적화 후 라이브 이미지를 중지하고 획득 모드 창을 엽니다. X x Y를 클릭하여 프레임 크기를 조정하고 1024 x 1024를 선택합니다. 또한 느린 속도를 선택하십시오.

그런 다음 평균화 탭을 열고 4보다 크거나 같은 숫자를 선택합니다. 그런 다음 스냅 버튼을 누르고 캡처한 2D 이미지를 저장합니다. 3D 이미징을 설정하려면 스마트 설정 탭을 열고 Z-Stack 항목을 표시하면 스택 창이 열립니다.

Z-Stack의 첫 번째 및 마지막 위치를 설정하려면 다시 라이브를 클릭하고 성상세포의 가장 높은 위치로 초점을 조정합니다. 먼저 설정을 클릭합니다. 이제 초점을 성상세포의 가장 낮은 위치로 조정하고 마지막으로 설정을 클릭합니다. 그런 다음 라이브 뷰를 중지합니다.

그런 다음 최적을 클릭하여 간격을 선택하여 슬라이스 수를 설정합니다. 여기서 간격은 1.01마이크로미터입니다. 마지막으로 실험 시작을 클릭하고 스캔이 완료되면 이미지를 저장합니다.