성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

이 프로시저의 전반적인 목표는 공초점 현미경을 통해 획득한 성상교세포의 3차원 이미지를 분석하여 성상교세포의 형태를 평가하는 것입니다. 이 방법은 병리적 상태 또는 중재 전략의 효과로 인해 다양한 세포 유형에서 나타날 수 있는 형태학적 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 구조와 관련된 많은 파라미터를 동시에 연구할 수 있다는 점입니다.

Mariam Bodel 박사가 이 절차를 시연하겠습니다. 면역조직화학 염색을 위한 슬라이드 준비 후, 섹션을 xylene에 10분씩 두 번 담가 탈파라핀화합니다. 세척 후, 섹션을 재수화시키기 위해 99.8%, 95%, 70% ethanol 각각에서 10분 동안 배양합니다. PBS로 세척한 후, 1:1500으로 희석된 glial fibrillary acidic protein 또는 GFAP 1차 항체 용액에서 4°C로 하룻밤 동안 슬라이드를 배양합니다.

배양 후, 절편을 PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 그 다음, 1:100으로 희석한 alkaline phosphatase 접합 2차 항체 용액을 슬라이드에 처리하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 사용 전 30분 이내에 절편을 다시 PBS로 5분씩 3회 세척합니다.

기질 완충액 3 mL에 적색 발색제 용액 한 방울을 추가합니다. 각 슬라이드를 이 용액 100 µL에 넣고 암실에서 15~20분 동안 배양합니다. 그 후 슬라이드를 PBS로 5분 동안 3회 세척합니다.

마지막으로, PBS에 1:500으로 희석한 DPI로 핵을 염색합니다. 절편 위에 Antifa medium을 1~2방울 떨어뜨린 후 즉시 커버슬립으로 밀봉합니다. 밀봉 상태를 유지하기 위해 현미경 관찰 전 4°C에서 24~48시간 동안 슬라이드를 배양합니다.

공초점 현미경 관찰을 시작하려면, 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓고 63x 대물렌즈를 선택하십시오. 획득 소프트웨어를 실행한 후, 획득 탭의 smart setup을 클릭하고 적절한 fluorophore를 선택하십시오. 여기서는 DAPI와 Alexa Fluor 555가 사용되었습니다.

다음으로 best signal을 클릭한 후 apply를 클릭하십시오. 그런 다음 set exposure를 클릭하여 컴퓨터가 최적의 노출 파라미터를 결정하도록 합니다. 이미지를 최적화하려면 channels 창을 열고 이미지를 live로 전환하십시오. 필요한 경우 초점을 조정하십시오.

그런 다음 au 하나를 클릭하여 핀홀을 최적화하고, 최적의 강도를 위해 게인을 조정하십시오. 마지막으로 디지털 게인을 2에서 3 사이로 설정합니다. 이 최적화 과정이 끝나면 라이브 이미지를 중단하고 획득 모드 창을 엽니다.

X by Y를 클릭하여 프레임 크기를 조절하고 10 24 by 10 24를 선택하십시오. 또한 느린 속도(slow speed)를 선택하십시오. 다음으로, 평균화(averaging) 탭을 열고 4 이상의 숫자를 선택하십시오.

그런 다음 스냅 버튼을 클릭하고 캡처된 2D 이미지를 저장하십시오. 3D 이미징을 설정하려면 스마트 설정 탭을 열고 ZS 스택 항목을 체크하십시오. 그러면 Zs 스택 창이 열립니다. Z-스택의 시작 위치와 종료 위치를 설정하려면 다시 라이브를 클릭하고 초점을 성상교세포의 최상단 위치로 조정하십시오.

먼저 set을 클릭하십시오. 이제 초점을 astrocyte의 가장 낮은 위치로 조절한 다음 last를 클릭하고 라이브 뷰를 중단하십시오. 다음으로 optimal을 클릭하여 간격을 선택하십시오.

여기에서 슬라이스 수를 설정하며, 간격은 1.01 micrometers입니다. 마지막으로 start와 experiment를 클릭하고, 스캔이 완료되면 이미지를 저장하십시오. 또한, 10 x 또는 20 x 대물렌즈를 사용하여 2D 이미지를 획득하십시오.

형광 강도를 측정하려면 이미지 창에서 사각형 또는 원형 도구를 선택하고 측정 영역을 지정하여 성상교세포 핵, 세포체 및 영역의 부피와 표면적을 정량화하십시오. 3D 이미지를 분석 소프트웨어의 Velocity 6.1과 같은 적절한 분석 소프트웨어 프로그램으로 전송합니다. 새 라이브러리를 생성하고 모든 이미지를 왼쪽 회색 열로 드래그하십시오.

3D 이미지 하나를 선택하고 dapi와 같이 획득한 채널 중 관심 있는 채널 하나를 켭니다. 핵 측정을 위해 밝기를 수동으로 조절하여 대비를 최적화하십시오. 이제 도구 메뉴를 선택하십시오.

Make volume를 선택하여 Zack 이미지로부터 단일 3D 이미지를 생성합니다. 편집 메뉴를 열고 속성(properties)을 클릭합니다. X, Y, Z 속성이 표시되는지 확인하십시오.

그 다음, 툴바에서 자유형 ROI 도구를 선택합니다. 선택한 도구를 사용하여 DPI로 표시된 핵 주변에 선을 그려 성상교세포 핵의 부피와 표면적을 측정합니다. 다시 자유형 ROI 도구를 사용하여, 모든 가지의 표면을 따라 세포체 주변에 선을 그려 성상교세포 전체의 부피와 표면적을 측정합니다.

이미지 창 상단의 측정 메뉴를 클릭하고 'find objects'를 창 상단으로 드래그한 다음, population one에 기술적인 이름을 입력하고 관련 색상을 선택한 후 'measure'를 클릭하면 새 창이 열립니다. 이 새 창에서 매개변수로 부피(volume) 또는 표면적(surface area) 중 하나를 선택하고 확인을 클릭하십시오.

데이터를 저장하려면 측정 메뉴를 클릭하고 측정 항목 만들기 항목을 선택하십시오. 창에서 새로운 측정 항목을 선택하십시오. 데이터의 파일 이름을 입력하고 확인을 클릭하십시오.

마지막으로, 통계 분석을 수행하고 데이터 플롯을 생성하기 위해 측정 데이터를 적절한 소프트웨어 패키지로 내보냅니다. 본 연구에서 연구진은 amyloid beta one 40 또는 amyloid beta one 40과 Ian을 처리한 쥐의 고정된 뇌 조직 내 성상교세포를 비교하였습니다. 아밀로이드 단백질 주입 처리를 통해 성상교세포의 가지가 더 굵고 길어지는 결과가 나타났습니다.

Ian 투여 동물에서 유래한 이러한 성상교세포는 짧고 가는 분지를 가진 성상 형태를 나타냈습니다. 또한 Ian 투여 쥐의 뇌 절편에서는 성상교세포의 GFAP 양성 형광이 감소한 것으로 나타났습니다. 특정 성상교세포 부피에 대한 형태계측학적 분석 결과, amyloid 단독 처리군과 비교하여 Ian 투여 시 성상교세포 핵, 세포체, 성상교세포 전체 및 성상교세포 영역의 부피가 감소한 것으로 밝혀졌습니다.

이 이미지 분석 기술을 숙달하면, 적절하게 수행할 경우 세포당 몇 분 내에 분석을 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 구조물을 매우 정밀하게 표시하는 것이 중요합니다. 실험 개발 후 실제 실험을 시작하기 전에, 관심 구조물을 수동으로 표시하는 연습을 하는 것이 좋습니다.

이 기술은 세포 생물학, 조직학 및 병리학 분야의 연구자들이 건강하거나 질병 상태인 세포의 구조를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 3D 이미지를 사용하여 단일 세포의 12가지 서로 다른 파라미터를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.