성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 컨포칼 현미경을 통해 획득한 성상세포의 3차원 이미지를 분석하여 성상세포 형태를 평가하는 것입니다. 이 방법은 병리학적 조건 또는 중재 전략의 효과로 다양한 세포 유형에서 나타날 수 있는 형태학적 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 구조와 관련된 많은 매개변수를 동시에 연구할 수 있다는 것입니다.

Mariam Bodel 박사는 이 절차를 시연합니다: 면역조직화학 염색을 위한 슬라이드를 준비한 후 10분 동안 자일렌에 두 번 담궈 절편을 파리즈 섹션으로 염색합니다. 세척 후 섹션을 재수화하기 위해 99.8%95% 및 70%에탄올 각각에서 10분 동안 슬라이드를 배양합니다. PBS는 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 1500 희석된 신경교섬유산성 단백질 또는 GFAP 1차 항체 용액에서 슬라이드를 배양합니다.

배양 후 PB S3의 절편을 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 1-100 알칼리성 인산가수분해효소 접합 2차 항체 용액으로 슬라이드를 배양합니다. 다시 말하지만, 사용 전 30분 이내에 PB S3로 섹션을 5분 동안 세척하십시오.

3ml의 기질 완충액에 적색 발색 용액 한 방울을 추가합니다. 이 용액의 100 마이크로 리터에 각 슬라이드를 어둠 속에서 15-20 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 PB S3에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다.

마지막으로 PBS에서 1에서 500으로 희석된 DPI로 핵을 염색합니다. 섹션에 Antifa 매체 1-2방울을 바르고 즉시 커버 슬립으로 밀봉하십시오. 밀봉을 보장하기 위해 현미경 검사 전에 24-48시간 동안 섭씨 4도에서 슬라이드를 배양합니다.

컨포칼 현미경 검사를 시작하려면 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓고 63 x 대물렌즈를 선택합니다. 획득 소프트웨어를 연 후 획득 탭에서 스마트 설정을 클릭하고 적절한 4층을 선택합니다. 여기, dappy와 Alexa, 5 층 55가 사용됩니다.

그런 다음 최상의 신호를 클릭한 다음 적용을 클릭합니다. 그런 다음 노출 설정을 클릭하여 컴퓨터가 최적의 노출 매개변수를 결정할 수 있도록 합니다.이미지를 최적화하려면 채널 창을 열고 이미지를 라이브로 전환하십시오. 필요한 경우 초점을 조정합니다.

그런 다음 하나의 au를 클릭하여 핀홀을 최적화하고 최상의 강도를 위해 게인을 조정합니다. 마지막으로 디지털 게인을 2와 3 사이로 설정합니다. 이 최적화 후 라이브 이미지를 중지하고 획득 모드 창을 엽니다.

X by Y를 클릭하여 프레임 크기를 조정하고 10 24 x 10 24를 선택합니다. 또한 느린 속도를 선택하십시오. 그런 다음 평균 탭을 열고 4보다 크거나 같은 숫자를 선택합니다.

그런 다음 스냅 버튼을 클릭하고 캡처한 2D 이미지를 저장합니다. 3D 이미징을 설정하려면 스마트 설정 탭을 열고 ZS 스택 항목을 표시하면 Zs 스택 창이 열립니다. Zack의 첫 번째 위치와 마지막 위치를 설정하려면 다시 live를 클릭하고 초점을 성상세포의 가장 높은 위치로 조정합니다.

먼저 세트를 클릭합니다. 이제 초점을 성상세포의 가장 낮은 위치로 조정하고 마지막으로 설정을 클릭한 다음 라이브 뷰를 중지합니다. 그런 다음 최적을 클릭하여 간격을 선택합니다.

여기서 슬라이스 수를 설정하려면 간격은 1.01마이크로미터입니다. 마지막으로 시작을 클릭하고 실험하고 스캔이 완료되면 이미지를 저장합니다. 또한 10 x 또는 20 x 대물렌즈를 사용하여 2D 이미지를 획득합니다.

형광 강도 측정의 경우, 이미지 창에서 사각형 또는 원 도구를 선택하고 측정할 영역을 강조 표시하여 성상세포핵, 체세포 세포체 및 영역의 부피와 표면적을 정량화합니다. 3D 이미지를 분석 소프트웨어의 Velocity 6.1과 같은 적절한 분석 소프트웨어 프로그램으로 전송합니다. 새 라이브러리를 만들고 모든 이미지를 왼쪽 회색 열로 드래그합니다.

하나의 3D 이미지를 선택하고 dapi와 같은 획득된 관심 채널 중 하나를 켭니다. 핵 측정의 경우 밝기를 수동으로 조정하여 대비를 최적화합니다. 이제 도구 메뉴를 선택합니다.

볼륨 만들기를 선택하고 Zack 이미지에서 단일 3D 이미지를 생성합니다. 편집 메뉴를 열고 속성을 클릭합니다. X, Y 및 Z 속성이 표시되는지 확인합니다.

그런 다음 도구 모음에서 자유형 ROI 도구를 선택합니다. 선택한 도구를 사용하여 DPI 라벨링된 핵 주위에 선을 그려 성상세포 핵의 부피와 표면적을 측정합니다. 다시 말하지만, 자유형 ROI 도구를 사용하여 모든 가지의 표면을 따라 체세포 주위에 선을 그려 전체 성상세포의 부피와 표면적을 측정합니다.

이미지 창 상단의 측정 메뉴를 클릭하고 찾은 개체를 창 상단으로 끌어다 놓고 population one에 설명이 포함된 이름을 지정하고 관련 색상을 선택한 다음 측정을 클릭하면 새 창이 열립니다. 이 새 창에서. 부피 또는 표면 영역을 매개변수로 선택하고 확인을 클릭합니다.

데이터를 저장하려면 측정 메뉴를 클릭하고 측정 항목 만들기를 선택합니다. 창에서 호출된 새 측정 항목을 선택합니다. 데이터의 파일 이름을 입력하고 확인을 클릭합니다.

마지막으로, 측정 데이터를 적절한 소프트웨어 패키지로 내보내 통계 분석을 수행하고 데이터 플롯을 생성합니다. 여기에서 연구자들은 아밀로이드 베타 원 40 또는 아밀로이드 베타 원 40 및 이안을 투여한 쥐의 고정 뇌 조직에 있는 성상세포를 비교했습니다. 아밀로이드 단백질을 이용한 치료 주사로 더 두껍고 긴 가지를 가진 성상세포가 생성되었습니다.

이안(Ian)이 처리한 동물의 이 성상세포는 짧고 얇은 가지를 가진 별모양 형태를 나타냈다. Ian을 처리한 쥐는 또한 뇌 절편에서 감소된 성상세포 GFAP 양성 형광을 보여주었습니다. 특정 성상세포 부피에 대한 형태학적 분석은 아밀로이드 치료만 했을 때보다 Ian 처리로 성상교세포의 핵 세포체 전체와 성상세포 영역의 부피가 감소한 것으로 나타났습니다.

이 이미지를 마스터하면 분석 기술이 제대로 수행되면 셀당 몇 분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 높은 정밀도로 구조를 표시하는 것이 중요합니다. 개발 후 실험을 시작하기 전에 관심 구조를 수동으로 표시하는 연습을 하는 것이 가장 좋습니다.

이 기술은 세포 생물학, 조직학 및 병리학 분야의 연구자들이 건강하거나 질병이 있는 환경에서 세포의 구조를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 3D 사진을 사용하여 단일 셀에 대해 12개의 서로 다른 매개변수를 측정하는 방법을 잘 이해해야 합니다.