Name: 실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 배우세요 뇌 허혈 후 소교세포/대식세포 표현형 마커의 3차원 공촛점 이미징 방법을. 마우스 뇌 조직에서 면역형광 염색과 공촛점 현미경을 활용하여 세포 내 마커 발현을 정확히 분석하는 기술입니다.

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스테파노 Fumagalli는 Monzino 재단의 동료입니다.

1. 면역 형광 다음의 프로토콜은 (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 식힌 50ml의 뒤에 PBS 20 ㎖, 0.1 몰 / 리터, pH가 7.4,) transcardially 관류 된 마우스로부터 얻은 뇌 관상 저온부에서 수행된다. 살포 후, 두뇌는 신중하게 제거하고 cryoprotection위한 4 ° C에서 하룻밤 PBS의 30 % 자당에 전송. 유리 병에 밀봉하여 -70 ° C에서 사용할 때까지에 저장되기 전에 3 분 동안 45 ° C - 뇌는 다음 빠르게에서 이소 펜탄에 담가 냉동. 코로나 뇌 저온부 (20 μm의)는 직렬로 잘라 면역 프로토콜 11, 6을 실시한다. 사용하기 전에 실온에 모든 시약 및 샘플을 가져와. 항체 혈청의 제시 작업 희석이 최적의 성능을 얻기 위해 만든 시험의 결과주의하시기 바랍니다. 다른 항체 및 혈청을 사용하는 경우, 프로토콜은 검증 될 필요가있다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 안티는 CD11b 및 안티 CD68 모두 차 항체는 쥐에서 만들어지기 때문에, 우리는 형광 신호 증폭과 함께 다음에 안티는 CD11b의 높은 희석을 사용 안티 쥐 알렉사 546에 의해 교차 신호를 방지 할 수 있습니다 TSA 키트 (Cy5에 Tyramide). 우리는 단계 1.17을 제외하고는 설명 프로토콜을 수행하고 표 1에보고 된 항-CD11b를 적어도 7 가지 희석액을 사용하여 안티 CD11b를위한 최적의 작업 희석을 설정했습니다. , 여기 파장에서 알렉사 546 2) 신호가 532 nm의 1) 눈에 보이는 신호 Cy5에있는 여기 파장 646 nm에서 : 그 결과, 1:30,000 유일한 희석 달성하는 것을 선택하고있다. 이러한 방법으로, 알렉사 546 형광 신호를 선택적으로 CD68의 발현과 연관되어 있습니다. 안티는 CD11b 및 안티 CD68 항체에 대한 최적의 희석은 조직의 유형에 따라 다를 수 있으며, 공동 라벨 프로토콜을 시작하기 전에 정의해야합니다. <ol><li> PBS로 두 번 뇌 저온부을 씻으십시오. </li><li> 에O 2 (형광 증폭 고추 냉이 퍼 옥시 다제, 스트렙 타비 딘-HRP와 함께 배양을해야하므로 필요한 단계는 단계 1.12 참조) 1 % H 2를 포함하는 PBS에서 5 분 cubate 저온부. </li><li> 세척 저온부 PBS로 2 배. </li><li> 10 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어. </li><li> PBS는 기본 AB 쥐 안티 CD11b를 [1:30,000], 10 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 저온부를 품어. </li><li> 세척 PBS로 2 배 (5 분) 저온부. </li><li> 바이오틴 차 반대로 쥐 AB [1:200] 1 % NGS를 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 2 배. </li><li> TNT (0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.4, 0.15 M 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20 트리스 - 염산, 염화나트륨, 트윈)와 저온부을 씻으십시오. </li><li> TNB에서 1​​.5 시간 동안 저온부를 품어 (버퍼 트리스 - 염산 - 염화나트륨 블로킹 : 0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.4, 0.15 M 염화나트륨, 적절한 키트에서 0.5 % 차단 시약 (시약의 표 참조)). </li><li> 씻어내는섹션은 TNT와 시간을 3 배. </li><li> 스트렙 타비 딘-HRP [1:100]을 포함 TNB의 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부는 TNT와 3 배. </li><li> 시아닌 5 Tyramide [1:300]을 포함 증폭 희석제 8 분 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 3 배. </li><li> 10 % NGS 0.1 % 트리톤을 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어. </li><li> PBS는 기본 AB 쥐 항 CD68 [1:200], 3 % NGS 0.3 % 트리톤을 포함에 4 ° C에서 하룻밤 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 3 배. </li><li> fluorconjugated 차 AB 알렉사 546 안티 쥐 [1:500] 1 % NGS를 포함하는 PBS에서 60 분 동안 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 3 배. </li><li> 헥스 1 ㎍ / ㎖의를 포함하는 PBS에서 10 분 동안 저온부를 품어. </li><li> 세척 저온부 PBS로 3 배. </li><li> 머리말 골드에서 저온부를 탑재합니다. </li></ol> 2. 공 초점 현미경으로 3 차원 영상의 획득 <ol><li> 흥분되는 형광 염료의 파장에 따라 여기 레이저를 선택 (Cy5에, CD11b를위한 그는 네브라스카 레드, Alexa546, CD68 및 훽스트, 핵에 대한 UV 다이오드 그는 네브라스카 녹색). </li><li> 빛 신호 수집을위한 최적의 다이크로 익 미러의​​ 조합을 선택합니다. </li><li> 800 x 600 픽셀의 최소 이미지 해상도를 설정합니다. </li><li> 에피 형광을 사용하여 점진적으로 40X 목적으로 배율을 증가하여 관심의 영역을 식별합니다. </li><li> 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 양상으로 전환합니다. </li><li> 광전자 증 배관 (PMT) 및 각 채널의 게인을 조정하는 반복적 인 검사를 실행합니다. 레이저는 셋업을 용이하게하기 위해 개별적으로 설정 될 수있다. 원치 않는 비특이적 신호를 피하기 위해 가능한 한 낮은 이득을 유지한다. </li><li> REPE로titive 검사 실행, z 축 (총 z 축 길이 = 10 ㎛)의 하부 및 상부 극단을 정의하는 초점 제어를 이동합니다. </li><li> 반복적 인 검사를 중지합니다. </li><li> 스텝 크기를 정의합니다. 이는 Z-축 위에 표준 1시 1분 크기 비율을 구하기 픽셀 크기 (0.225 μM)에 가능한 한 가까워 야한다. </li><li> 칼만 필터에게 최소한 2 회를​​ 활성화합니다. </li><li> 비쳐 효과를 피하기 위하여 순차 주사 모드를 활성화. </li><li> 반쯤 Z-축을 따라 이동하여 XY 연속 스캔을 실행합니다. PMT의 설정 및 게인 (좋은 신호 / 노이즈 비율)을 확인합니다. 만족스럽지 않은 경우, 단계를 반복합니다 2.6. </li><li> XYZ 인수를 실행합니다. </li><li> multitiff 파일로 데이터를 내 보냅니다. 각 multitiff 파일은 일반적으로 3 색 채널 (파랑, 녹색, 빨강), 44 초점 비행기가 포함되어 있습니다. </li></ol> 3. 공 촛점 취득 및 입체 렌더링의 3 차원보기 Imaris 소프트웨어 multitiff 파일을 업로드하고 다음을 처리 : <ol><li>공개 소프트웨어. </li><li> 능가보기를 선택합니다. </li><li> multitiff 파일을 업로드합니다. </li><li> 각 채널에 대해 원하는 색상을 선택합니다. </li><li> 디스플레이 조정 패널 최소값을 증가시킴으로써 배경으로부터 노이즈를 제거한다. 개별적으로 각 채널을 조정합니다. </li><li> 섹션보기로 이동합니다. 공동 현지화 (노란색 픽셀)을 찾고 Z-축을 따라 이동합니다. </li><li> colocalization을가 z 축 (즉, 고체 개체에 속하는)을 따라 존재 여부를 확인하기 위해 노란색 영역을 클릭합니다. Z-축 돌기는 그림의 오른쪽 아래 부분에 볼 수 있습니다. </li><li> 스냅 샷을 가져 가라. </li><li> 보기를 능가로 이동. </li><li> 셀 또는 셀 클러스터를 분리하는 3D를 자릅니다. </li><li> 화면 조정 패널에 하나의 채널을 선택합니다. </li><li> 능가 / 표면 알고리즘 빌더를 선택합니다. 알고리즘 단계 : <ol><li> 채널을 선택합니다. </li><li> 임계 값을 정의 (t에서 동일한 최소 값을 사용그는) 조정 패널을 표시합니다. </li><li> 크기 조정 정의합니다. </li><li> (최고의 = 0.200) 스무딩 정의합니다. </li><li> 색상의 외관을 정의합니다. </li><li> 알고리즘을 종료합니다. </li></ol></li><li> 각 채널에 대해 단계 3.12를 반복합니다. </li><li> 화면 조정 패널에 형광 채널을 모두 취소하고 모든 세 개의면을 선택합니다. </li><li> 최고의 전망을 찾기 위해 볼륨을 이동합니다. </li><li> 스냅 샷을 가져 가라. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

우리는 여기에서 허혈 영역 (더 자세한 분석을 위해 심판 6 참조)에 M / M 표현형 마커의 현지화 및 공동 발현을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 초점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 세 가지 차원 공 촛점 이미징 M / M 활성화의 관련 마커의 특정 염색을 결합한다. 항체, 혈청 희석 작업을 fluorconjugated의 미세 조정은 조사 마커 잡음 비율로 최적의 신호를 할 수 있습니다. 입체 렌더링을 얻기 위해 이미지 처리는 M / M의 기능 상태의 획득 된 영상을 나타내는하고, 세포의 클러스터에 마커 표현의 정의를 허용 연구의 증가는 이제 M / M은 다양한 표현형을 획득하고 주변 신호에 따라 서로 다른 기능을 프로그램에 참여할 수있는 고도의 플라스틱 세포 것을 동의합니다. 염증 환경은 시간이 지남에 따라 진화하고 조율 할 수 있습니다M / M의 편광, 생체 내 연구에 훨씬 더 유익 체외 모델보다, 모집 / 활성화 된...

급성 뇌 손상 후, 미세 아교 세포가 빠르게 활성화 극적인 형태 적 형질 1-3을 변경 받아야합니다. 이 내장 함수는 응답은 부상 뇌 실질 4.5으로 마이그레이션 혈액 태생의 대 식세포의 모집에 연결되어 있습니다. 항원 적으로 구별되지 않는 미세 아교 세포 및 대식 세포의 역할은 뇌 손상에서 여전히 논의된다 (이제부터 M / M라고한다). 연구의 증가는 유사 주변 식세포에 대해 설명한 것과, 미세 아교 세포와 뇌가 대식 세포는 그 극단 (M1) 고전적인 염증성 독성이나 항 염증 보호 (M2) 표현형에 해당하는 서로 다른 표현형을 가정 할 수 모집을 나타냅니다. 프로 또는 항 염증 인자의 분비를 포함하여 다른 활성 상태는, 신경 영양 분자와 리소좀의 활동 자료는 그 발현 시간에 따라 표현형 마커의 특정 패턴을 특징으로한다주변 환경의 진화. 손상된 뇌의 이러한 M / M의 표현형의 특성은 여전히​​ 빈약하다. 우리는 뇌졸중 후 M / M 발현과 진화를 분석하는 pMCAo의 잘 확립 된 쥐 모델을 사용했다. 여기에 제시된 면역 형광 기반의 프로토콜은 특정 M / M 표현형 마커, 현지화 및 허혈성 지역에서 휴대 공동 식의 모양에 대한 통찰력을 얻기를 목표로하고 있습니다. 우리는 다른 활성화 상태 또는 표현형에 관련된 몇 가지 분자를 조사, 즉 CD11b를, 백혈구 및 M / M의 활성화 / 모집 6-8의 널리 사용되는 마커로 표시되는 표면 마커 CD68 리소좀 6,7 및 YM1 분비의 마커 단백질을 선택적으로 활성화 (M2) 대 식세포에 의해 표현 및 복구 기능 복원 9-10에 관련된. 두 개의 마커가 동일한 셀에 의해,하지만 서로 다른 세포 내 구획으로 표현 될 때, 혼자 colocalization을 많이 INF하지 않을 수 있습니다ormative. 이 경우, 동시 발현의 분석은 하나의 평면 뷰를 사용하여 입체 렌더링에서 수행 될 수있다. 우리는 여기에서 마커 동시 발현의 철저한 입체 분석을 얻기 위해 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD11b</td><td>친절하게 제공: Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-mouse CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-mouse Ym1 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Life technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated Goat Anti-Rat 항체</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyanine 5 System </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>안티 토끼 Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vectors Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tritin X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 컨포칼 현미경 </td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS 소프트웨어</td><td>Olympus</td> Imaris 소프트웨어 5.0 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 패키지 GraphPad Prism 버전 4.0</td><td>GraphPad 소프트웨어 Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

뇌 스트로크 미세 아교 세포 / 대 식세포 후 (M / M)가 새로운 표면 항원의 발현 및 축적되어 염증 반응을 유지하는 매개체의 생산을 포함 극적인 형태 및 표현형의 변화와 급속한 활성화를 받고있다. 신흥 증거는 M / M은 급성 뇌 손상 후 클래식 (M1) 염증성 또는 다른 항 염증 (M2) 활성화를 가정 할 수있다 높은 플라스틱 셀 있음을 나타냅니다. 그러나 부상 뇌의 M / M 표현형 마커 표현, 자신의 colocalization을 시간적 진화의 전체 특성은 아직 행방 불명입니다. 구체적으로는 M / M 활성화의 관련 마커를 염색 면역 프로토콜은 허혈성 뇌에서 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 현지화와 같은 M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 촛점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시CD11b를, CD68, YM1, 중대 뇌동맥 (pMCAO)의 영구적 인 폐쇄에 의해 유도 된 국소 허혈의 마우스 모델에서. 오염 된 곳의 두 가지 차원의 분석은 각각의 마커가 정의 된 M / M의 형태에 관련된 및 허혈성 병변에 지정된 현지화를 가지고 있는지 알 수있다. M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴은 허혈 영역에서 입체 공 촛점 이미징에 의해 평가 될 수있다. 이미지가 비쳐 영향을 최소화하고, 파장 중복을 피하기 위해 순차 주사 모드 (180 X 135 X 10 ㎛의 부피에 해당하는 10 ㎛ Z 축 및 0.23 μm의 스텝 사이즈) 정의 된 볼륨에서 취득 할 수있다. 이미지이어서 Imaris 소프트웨어에 의해 입체 렌더링을 얻기 위해 처리된다. 세 가지 차원 렌더링의 단단한보기는 세포의 클러스터에있는 마커 식의 정의를 할 수 있습니다. 우리는 M / M은 병변 사이트 및 TI의 위치에 따라, 표현형의 다수쪽으로 분화하는 능력을 가지고 있음을 보여나 부상 후.

라벨 프로토콜 및 공 촛점 인수는 허혈 영역으로 수행 될 때 얻어진 결과의 일례는도 1a 및도 1b에 도시되어있다. 획득 된 영상의 2 차원보기는 허혈 후 이십사시간에서 (A), 리소좀 마커 CD68 (녹색) 허혈성 핵심에 존재 비대 ameboid CD11b를 세포 (적색)로 표시되어 있음을 보여줍니다. 국경 지역에서 (B)는 CD11b 양성 세포는 둥근 세포 기관 및 CD68에 대한 긍정적 인 분지의 프로세스를 표시합니다. Z 축 돌기 (오른쪽 아래 부분과 B)는 하나의 평면도에 설명 된 마커 분포는 또한 Z-축을 따라 존재하는지 여부를 시각화 할 수 있습니다. colocalization을가 발생할 경우, 노란색 픽셀이 생성됩니다. CD11b를는 C3 단편에 대한 수용체이며, 막 분포를 나타낸다. CD68는 리소좀 레이블 주로 세포질에 따라서 존재한다. CD11b/CD68 이중 양성 세포는 일반적 colo...

뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

다음 실험의 전반적인 목적은 뇌 허혈 이후 미세아교세포 대식세포 표현형 마커의 발현 및 세포 내 위치를 시각화하는 것입니다. 먼저, 허혈성 마우스 뇌의 동결 절편을 염색하여 미세아교세포 대식세포 활성화 마커를 식별합니다. 염색된 절편은 3차원 공초점 이미징을 통해 관찰됩니다.결과 영상은 3차원 렌더링을 생성하기 위해 처리되며, 이미지 분석을 통해 세포 클러스터 내 마커의 발현 위치를 국소화합니다. 결과 데이터는 3차원 공초점 분석이 특정 세포체에 마커 발현을 정확하게 할당하는 데 효과적임을 보여줍니다. 두 개의 마커가 동일한 세포에서 발현되지만 서로 다른 세포 내 구획에서 발현되는 경우, 공국소화 분석만으로는 충분한 정보를 얻지 못할 수 있습니다. 여기서 보여줄 3차원 분석을 사용하면 더 나은 해상도와 정확도를 확보할 수 있습니다.이 방법은 허혈성 손상에 대한 뇌 반응의 복잡성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 손상 및 회복 과정에서 미세아교세포-대식세포의 이중 역할이 제안된 다른 급성 또는 만성 질환에도 적용될 수 있습니다. 또는 신호를 서로 다른 공간 평면에서 선택적으로 국소화해야 하는 경우에도 유용하며, Carlo Perigo와 Stefan of Magali가 이 절차의 단계별 과정을 안내할 것입니다. 다음 프로토콜은 중간 뇌동맥의 영구 폐쇄를 통해 허혈을 유도한 마우스 뇌 조직을 사용합니다.크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 뇌의 관상면(coronal section)을 20 micron 두께로 연속 절편하여 젤라틴 위에 수집하십시오. 커버 글라스를 사용하며, 모든 시약과 시료는 사용 전 실온 상태가 되도록 준비하십시오. 동반 문서에 기재된 항체 및 혈청의 작동 희석 배수는 서로 다른 항체와 혈청을 사용할 때 최적의 성능을 얻기 위해 수행한 실험 결과임을 유의하시기 바랍니다.프로토콜 검증이 필요합니다. 우선, 필요한 시약의 양을 최소화하기 위해 액체 차단 펜을 사용하여 슬라이드 위의 절편 구역에 원을 그립니다. 다음으로, 1 mL 피펫을 사용하여 뇌 절편을 습윤 챔버에 넣습니다.절편에 상온의 PBS를 첨가하고 5분 동안 배양하여 세척합니다. 그다음, 바늘이 달린 1mL 일회용 주사기를 사용하여 용액을 제거하고 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 두 번째 세척액을 제거한 후, 모든 용액 교체 단계에서 1mL 피펫과 일회용 주사기를 사용하여 시료를 염색합니다. 염색 절차는 여기에서 요약된 대로 수행해야 합니다.세척 단계를 포함한 자세한 내용은 동반된 텍스트를 참조하십시오. 먼저, normal goat serum으로 블로킹한 후 세포를 1% hydrogen peroxide와 함께 배양합니다. 그 다음 CD 11 B에 대한 1차 항체와 함께 배양합니다. 이어서 슬라이드를 적절한 2차 항체와 함께 배양하고, triss, NACL tween buffer 또는 TNT로 세척한 후, TNB 배양 후 triss, H-C-L-N-A-C-L, blocking buffer 또는 TNB로 세척합니다.슬라이드를 streptavidin HRP와 함께 배양한 다음, 면역형광 신호를 증폭시키는 cyanide five tyrom이 포함된 증폭 희석액으로 처리합니다. 다음으로, 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 슬라이드를 NGS와 함께 배양합니다. 그런 다음 CD 68에 대한 1차 항체와 함께 배양합니다.1차 항체와 함께 배양한 후, 세포를 적절한 형광 표지 2차 항체로 배양하고, 이어서 DNA 표지를 위해 1 µg/mL의 hooks를 처리합니다. 염색이 완료되면, prolonged gold를 사용하여 동결 절편을 마운팅하며, 이때 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 분석 전까지 절편을 4 °C 암소에 보관합니다.형광 신호 획득은 1주일 이내에 수행해야 합니다. 본 프로토콜에서는 488 nanometers의 argon krypton, 646 nanometers의 helium neon red, 532 nanometers의 helium neon green 세 가지 레이저 라인과 U 500 소프트웨어의 flu 내 UV 다이오드가 장착된 공초점 스캔 유닛 FV 500이 탑재된 IX 81 현미경을 사용합니다. 적절한 여기 레이저와 다이크로익 미러를 선택하십시오.또한 이미지 해상도를 최소 800 by 600 픽셀로 설정하십시오. 다음으로 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓고 에피 형광(epi fluorescence)을 사용하여 관심 영역을 확인한 뒤, 배율을 40 x 대물렌즈까지 점진적으로 높이십시오. 그런 다음 레이저 주사 현미경(laser scanning microscopy) 모드로 전환하고, 각 채널의 광전증배관(photomultiplier) 출력 레벨과 게인을 조정하면서 반복적으로 스캔을 수행하십시오.이렇게 하면 서로 다른 파장에서의 동시 여기로 인해 발생하는 신호 중첩을 줄일 수 있습니다. 원하지 않는 비특이적 신호를 방지하기 위해 게인(gain)을 가능한 한 낮게 유지하십시오. 반복 스캔을 계속하면서 초점을 조절하고, Z축의 전체 길이를 10 microns로 설정하여 Z축의 하한 및 상한 범위를 지정하십시오.그런 다음 반복 스캔을 중지합니다. 다음으로 스텝 크기를 입력합니다. 이는 픽셀 크기인 0.225 microns에 최대한 가깝게 설정해야 합니다.이렇게 하면 소프트웨어에서 Z축을 기준으로 표준 1:1 크기 비율을 얻을 수 있습니다. 칼만 필터를 최소 2회 활성화하십시오. 칼만 알고리즘은 배경 소음에 해당하는 단일 양성 복셀과 같은 무작위 신호를 제거하여 신호 대 잡음비를 개선하는 반복 함수입니다. 이제 블리드 스루(bleed through) 효과를 방지하기 위해 순차 스캐닝 모드를 활성화하십시오.Z축의 중간 지점으로 이동한 후 XY 순차 스캔을 실행합니다. 만족스러운 신호 대 잡음비를 확보하기 위해 PMT 및 게인 설정을 확인합니다. 이후 XY, Z 획득을 수행합니다.데이터를 멀티 TIF 파일로 내보내십시오. 각 멀티 TIF 파일은 일반적으로 처리를 위해 3개의 색상 채널과 44개의 초점 평면을 포함합니다. 먼저 imas 소프트웨어를 실행하여 시작하십시오.먼저, surpass 뷰를 선택한 다음 multi TIF 파일을 업로드하십시오. 다음으로 디스플레이 조정 패널에서 각 채널에 원하는 색상을 여기서 선택하십시오. 빨간색은 CD 11 B를, 녹색은 CD 68을, 파란색은 hooks DNA 염색을 나타냅니다. 배경의 노이즈를 제거하려면 각 채널의 디스플레이 조정 패널에서 최소값을 높이십시오.그런 다음 단면 보기(section view)로 이동하여 X, Z 및 YZ 축의 직교 투영과 함께 단일 XY 초점 평면을 시각화합니다. Z축을 따라 이동하며 노란색 픽셀로 나타나는 공국소화(colocalization) 지점을 찾습니다. 노란색 영역을 클릭하여 공국소화가 Z축을 따라 존재하는지 확인하며, 이는 해당 지점이 고체 객체의 Z축에 속함을 나타냅니다.그림의 오른쪽과 하단 부분에서 투영도를 확인할 수 있습니다. 스냅샷을 촬영한 후, 다시 surpass 뷰로 돌아가십시오. 다음으로, edit 드롭다운 메뉴에서 crop 3D를 선택하고 관심 영역의 외곽선을 그려 단일 세포 또는 세포 군집을 분리합니다.그런 다음 디스플레이 조정 패널에서 채널 하나를 선택합니다. surpass surfaces 알고리즘 빌더를 선택하십시오. 알고리즘을 설정하려면 먼저 채널을 선택합니다.그다음 임계값을 디스플레이 조정 패널에서 설정한 최소값과 동일하게 정의하고, 필요한 경우 크기 조정을 정의합니다. 이어서 평활화 값을 0.200으로 정의합니다. 색상 패널을 선택하고 필요에 따라 모양을 변경합니다.각 채널에 대해 surpass surfaces 알고리즘 빌더 설정을 반복합니다. 그런 다음 디스플레이 조정 패널에서 형광 채널의 선택을 해제하고 세 가지 표면을 모두 선택합니다. 마지막으로, 볼륨을 이동하여 최적의 뷰를 찾고 스냅샷을 촬영하여 MM 마커의 공동 발현 패턴을 결정합니다.본 동영상에서 설명하는 면역형광 염색 및 공초점 이미지 획득 프로토콜은 중대뇌동맥의 영구 폐쇄로 유도된 국소 허혈 마우스 모델에서 수행되었습니다. 획득한 이미지의 2차원 뷰를 보면 허혈 24시간 후, 허혈 중심부에 존재하는 CD 11 B 양성 세포(적색) 내의 비대해진 부위에서 리소좀 마커인 CD 68(녹색)이 발현됨을 알 수 있습니다. 우측 하단에 표시된 Z축 투영 이미지는 단일 평면 뷰에서 확인된 마커 분포가 경계 구역의 Z축을 따라서도 나타남을 보여줍니다.CD 11 B 양성 세포는 비대해진 세포체와 CD 68에 강한 양성을 보이는 돌기를 나타내며, 이는 파고솜이 세포막에 결합되어 있음을 시사합니다. 이는 M2 분극화 마커인 YM 1과 CD 68의 공동 발현을 평가했을 때, 미세아교세포의 활발한 PHA 산성 거동을 나타냅니다. 형광 이미지는 3차원 렌더링 과정을 거쳤습니다.여기에 표시된 획득 이미지의 3차원 뷰는 녹색으로 표시된 CD 68 양성 세포와 빨간색 형광 복셀로 표시된 YM one 양성 세포의 존재를 나타냅니다. 평행하게 배치될 경우, 관찰자의 시점에서 노란색으로 보이는 공국소화 신호가 나타날 수 있으며, 이는 마커 사이의 실제 거리와는 관련이 없을 수 있습니다. 공국소화를 정의하기 위해.Z축을 따라 이동하며 Z축 투영이 포함된 단일 평면 뷰를 생성해야 합니다. 이는 공국소화(colocalization)를 확인하기 위함입니다. Z축 투영은 이 이미지의 오른쪽과 하단 부분에서 보는 바와 같이 얻어집니다.형광 복셀은 마커 발현을 특정 세포체에 할당하는 3차원 렌더링을 통해 고체 객체로 변환될 수 있습니다. 고배율 및 3D 렌더링 결과, 두 마커는 서로 근접해 있는 서로 다른 세포에 속하는 것으로 보입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 다중 마커와 염료를 이용한 면역형광 분석 수행 방법과 공초점 현미경을 통해 3차원 이미지를 적절하게 획득하고 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.또한, 설명된 후처리 분석은 세포 수준에서의 모든 공동 발현 또는 공동 국소화를 분석하거나, 신호를 서로 다른 공간 평면에서 선택적으로 국소화해야 하는 경우에 유용하게 활용될 수 있습니다.

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

Two-photon intravital imaging은 등쪽 기둥 외상성 척수 파쇄 손상이 있는 골수 키메라 동물의 원래 조직 환경에서 척수의 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

이 프로토콜은 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투뿐만 아니라 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 분석 뿐만 아니라 IBA1 및 TMEM19의 면역 형광 유행성 화에 대한 단계별 워크플로우를 설명합니다.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

뇌타박상을 동반한 뇌골 출혈 및 신경 염증은 심각한 2차 뇌 손상을 유발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 제어 피질 영향(CCI) 모델을 자세히 설명하여 연구원들이 출혈, 타박상 및 외상 후 면역 반응을 연구하고 잠재적인 치료법을 탐색할 수 있도록 합니다.

외상성 출혈 타박상 및 신경염증에 대한 전임상 제어 피질 영향 모델

이 프로토콜은 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응을 특성화하고 부분 최소 제곱 회귀를 사용하는 다변량 시스템 분석의 일부로 이러한 데이터를 통합하는 방법을 제시합니다.

외상성 뇌 손상에 대한 신경 염증 및 혈역학 반응의 시스템 분석

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

이 프로토콜은 마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상을 설명합니다. 특히, 경미한 정중선 폐쇄 두부 손상을 유도하기 위한 단계별 프로토콜 및 동물 모델의 특성화가 충분히 설명된다.

생쥐의 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 전자기 제어 폐쇄 머리 모델

손상된 척수에서 미세아교세포(MG)와 말초 침투 대식세포(Mø)를 식별하는 것은 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 유세포 분석법(FCM)을 사용하여 각각 M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø 및 M2-like Mø를 식별했습니다. 이 기술은 MG와 Mø의 역할을 이해하기 위해 다른 중추 신경계 질환에도 적용될 수 있습니다.

유세포분석을 사용하여 손상된 척수에서 미세아교세포(microglia) 및 말초 침투 대식세포(peripheral infiltrating macrophages in the injured spinal cords) 확인

여기에서는 미니 뇌졸중 모델에서 유세포 분석을 사용하여 허혈성 뇌졸중 후 면역 세포 기능을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 신경면역 상호 작용을 자세히 검사할 수 있으며 다른 신경퇴행성 질환을 연구하는 데 적용할 수 있어 뇌졸중 병리학의 면역 반응에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

Mini-Stroke Murine Model에서 신경면역 상호작용의 분리 및 유세포 분석 평가

미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS)는 코딩 전문 지식이 필요 없는 사용자 친화적인 분석 파이프라인으로, 면역형광 이미지로부터 단일 세포 미세아교 형태학 분석을 반자동으로 수행합니다. 설치류 지다당류 유도 신경염증 모델에서 검증된 MMPS는 활성화 관련 형태학적 변화를 재현 가능하게 감지하고 표준화되고 확장 가능한 미세아교세포 표현형을 가능하게 합니다.

미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS): 정량적 미세교교세포 형태학 분석을 위한 오픈 소스 사용자 친화적 도구입니다

배우세요 뇌 허혈 후 소교세포/대식세포 표현형 마커의 3차원 공촛점 이미징 방법을. 마우스 뇌 조직에서 면역형광 염색과 공촛점 현미경을 활용하여 세포 내 마커 발현을 정확히 분석하는 기술입니다.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

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