실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 뇌 허혈 후 미세아교세포 대식세포 표현형 마커의 발현 및 세포 국소화를 시각화하는 것입니다. 먼저, 허혈성 쥐 뇌의 극저온 절편을 염색하여 미세아교세포 활성화의 마커를 식별합니다. 염색된 부분은 3차원 컨포칼 이미징을 받습니다.

그런 다음 결과 이미지를 처리하여 3차원 렌더링을 생성하고, 이미지 분석을 수행하여 세포 클러스터에서 마커의 발현을 국소화합니다. 결과 데이터는 특정 세포체에 마커 발현을 적절하게 할당하는 데 있어 3차원 컨포칼 분석의 효과를 보여줍니다.두 마커가 동일한 세포에서 발현되지만 다른 세포 내 구획에서 발현되는 경우 공동 국소화만으로는 그다지 유익하지 않을 수 있습니다. 여기에서 설명하겠지만 3차원 분석을 사용하면 해상도와 정확성을 높일 수 있습니다.

이 방법은 허혈성 손상에 대한 뇌 반응의 복잡성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 손상 및 복구에서 미세아교세포 대식세포의 이중 역할이 제안된 다른 급성 또는 만성 상태에도 적용할 수 있습니다. 또는 신호를 다른 특수 비행기에서 선택적으로 현지화해야 하는 경우 Magali의 Carlo Perigo와 Stefan이 절차의 여러 단계를 안내합니다. 다음 프로토콜은 중대뇌동맥의 영구적인 폐색에 의해 허혈이 유발된 쥐의 뇌 조직을 사용합니다.

저온 유지 장치를 사용하여 젤라틴에서 뇌의 연속 20미크론 관상 절편을 수집합니다. 덮인 슬라이드는 사용하기 전에 모든 시약과 샘플을 실온으로 가져옵니다. 동반 문헌에 기재된 항체 및 혈청의 작동 희석은 서로 다른 항체와 혈청을 사용할 때 최상의 성능을 얻기 위해 이루어진 시험의 결과입니다.

프로토콜의 유효성을 검사해야 합니다. 필요한 시약의 양을 최소화하기 위해 액체 차단 펜을 사용하여 슬라이드의 섹션을 돌리는 것으로 시작합니다. 다음으로, 1ml 피펫을 사용하여 뇌 절편을 젖은 챔버에 넣습니다.

섹션에 실온 PBS를 추가하고 5분 동안 배양하여 세척합니다. 그런 다음 바늘이 달린 1 밀리리터 일회용 주사기를 사용하여 용액을 제거하고 한 번 더 세척을 반복하십시오 두 번째 세척을 제거한 후 모든 용액 교환을 위해 1 밀리리터 피펫과 일회용 주사기를 사용하여 샘플을 염색하십시오. 염색 절차는 요약된 대로 수행해야 합니다. 여기.

세탁 단계를 포함한 자세한 내용은 동봉된 텍스트를 참조하십시오. 먼저, 세포는 일반 염소 혈청으로 차단한 후 1% 과산화수소로 배양합니다. CD 11 B에 대한 1차 항체를 1차 항체로 배양한 다음, 슬라이드를 적절한 2차 항체로 배양한 후 triss, NACL 트윈 완충액 또는 TNT, 트리스, H-C-L-N-A-C-L, 차단 완충액 또는 TNB를 투여합니다.

슬라이드는 스트렙타비딘 HRP로 배양한 후 시안화물 5 티롬을 함유한 증폭 희석액으로 배양하여 면역형광 신호를 증폭합니다. 다음으로, 슬라이드를 NGS와 함께 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 그런 다음 CD 68에 대한 1차 항체를 배양합니다.

1차 항체를 사용한 배양 후, 세포는 적절한 Fluor 접합 2차 항체에서 배양된 다음 후크 밀리리터당 1마이크로그램을 배양하여 DNA를 라벨링합니다. 염색이 완료되면 절편을 장착할 때 연장된 금을 사용하여 극저온 절편을 장착하고 기포가 발생하지 않도록 합니다. 분석될 때까지 섭씨 4도의 어두운 곳에 단면을 보관하십시오.

형광 신호의 획득은 1주일 이내에 수행해야 합니다. 이 프로토콜은 컨포칼 스캔 장치 FV 500, 3개의 레이저 라인이 있는 컨포칼 스캔 장치 FV 500, 488나노미터의 아르곤 크립톤, 646나노미터의 헬륨 네온 레드, 532나노미터의 헬륨 네온 그린, U 500 소프트웨어의 독감에 사용되는 UV 다이오드를 사용합니다. 적절한 excitation laser와 dichroic mirror를 선택합니다.

또한 이미지 해상도를 최소 800 x 600 픽셀로 설정합니다. 다음으로, 슬라이드를 현미경의 스테이지에 놓고 에피 형광을 사용하여 관심 영역을 식별하고 배율을 40 x 대물렌즈까지 점진적으로 높입니다. 그런 다음 레이저 스캐닝 현미경 방식으로 전환하고 각 채널의 광전자 증배관 전력 수준과 게인을 조정하면서 반복 스캔을 실행합니다.

이렇게 하면 서로 다른 파장에서 현대 여기(same excitation)로 인한 신호 중복이 줄어듭니다. 원치 않는 불특정 신호를 피하기 위해 게인을 가능한 한 낮게 유지하십시오. 반복 스캔을 계속하면서 초점을 조정하고 총 Z축 길이가 10미크론인 Z축의 하한과 상한 극단을 정의합니다.

그런 다음 반복 스캔을 중지합니다. 다음으로 단계 크기를 입력합니다. 픽셀 크기(0.225미크론)에 최대한 가까워야 합니다.

이렇게 하면 소프트웨어 Activate kalman filter에서 Z축에 대한 표준 일대일 크기 비율이 최소 두 번 제공됩니다. kalman 알고리즘은 배경 잡음에 속하는 단일 양의 복셀과 같은 무작위 신호를 제거하여 신호 대 잡음비를 개선하는 반복 함수입니다. 이제 순차 스캔 모드를 활성화하여 번짐 효과를 방지하십시오.

Z축의 중간점으로 이동하여 XY 순차 스캔을 실행합니다.만족스러운 신호 대 잡음비를 보장하기 위해 PMT 및 게인의 설정을 확인하십시오. 수집 후 XY, Z 수집을 실행합니다.

데이터를 다중 TIF 파일로 내보냅니다. 각 다중 TIF 파일에는 일반적으로 처리를 위한 3개의 색상 채널과 44개의 초점면이 포함되어 있습니다. imas 소프트웨어를 열어 시작합니다.

먼저 초과 보기를 선택한 다음 다중 TIF 파일을 업로드합니다. 다음으로 디스플레이 조정 패널에서 각 채널에 대해 원하는 색상을 선택합니다. 빨간색은 CD 11 B.녹색은 CD 68을 나타내고 파란색은 배경에서 노이즈를 제거하고 각 채널에 대한 디스플레이 조정 패널의 최소값을 높이기 위해 후크 DNA 염색을 나타냅니다.

그런 다음 단면 뷰로 이동하여 x, Z 및 YZ 축의 직교 투영이 있는 단일 XY 초점 평면을 시각화합니다. Z축을 따라 이동하여 노란색 픽셀로 표시되는 공동 국소화(colocalization)를 찾습니다. 노란색 영역을 클릭하면 Z축을 따라 colocalization이 존재하는지 여부를 확인할 수 있으며, 이는 솔리드 개체 Z축에 속한다는 것을 나타냅니다.

투영은 그림의 오른쪽과 아래쪽 부분에서 볼 수 있습니다. 스냅샷을 찍은 다음 능가 보기로 돌아갑니다. 그런 다음 편집 드롭다운 메뉴에서 3D 자르기를 선택하고 관심 영역의 윤곽을 그려 셀 또는 셀 클러스터를 분리합니다.

그런 다음 디스플레이 조정 패널에서 하나의 채널을 선택합니다. surpass surfaces 알고리즘 빌더를 선택합니다. 그런 다음 알고리즘을 설정하려면 먼저 채널을 선택합니다.

그런 다음 임계값을 디스플레이 조정 패널에 설정된 것과 동일한 최소값으로 정의하고 필요한 경우 크기 조정을 정의합니다. 다음으로, 평활을 0.200으로 정의합니다. 색상 패널을 선택하고 필요에 따라 모양을 변경합니다.

각 채널에 대해 surpass surfaces 알고리즘 빌더에 대한 설정을 반복합니다. 그런 다음 디스플레이 조정 패널에서 형광 채널을 선택 취소하고 세 개의 표면을 모두 선택합니다. 마지막으로, 볼륨을 이동하여 최상의 보기를 찾고 스냅샷을 찍어 MM 마커의 동시 발현 패턴을 확인합니다.

이 비디오에 설명된 면역형광 및 공초점 획득에 대한 프로토콜은 중대뇌동맥의 영구적인 폐색에 의해 유도된 국소 허혈의 마우스 모델에서 수행되었습니다. 획득된 이미지의 2차원 보기는 허혈 후 24시간이 지나면 녹색으로 표시된 리소좀 마커 CD 68이 허혈 코어에 존재하는 빨간색으로 보이는 CD 11 B 양성 세포 중 비대성에서 발현됨을 보여줍니다. 오른쪽 아래에 표시된 Z축 투영은 단일 평면 뷰에 문서화된 마커 분포가 경계 영역의 Z축을 따라 존재한다는 것을 보여줍니다.

CD 11 B 양성 세포는 CD 68에 대해 매우 양성인 과정을 가진 비대 세포체를 나타내며, 이는 식체가 세포막에 결합되어 있음을 시사합니다. 이는 CD 68 및 YM 1의 동시 발현을 평가하기 위해 미세아교세포의 활성 PHA 산성 거동을 나타내며, M 2 편광의 마커입니다. Mm.형광 이미지는 3차원 렌더링을 거쳤습니다.

여기에 표시된 획득된 이미지의 3차원 보기는 녹색으로 표시된 CD 68 양성 세포와 빨간색 형광 복셀로 표시된 YM 1 양성 세포의 존재를 나타냅니다. 평행하게 놓으면 관찰자의 시야는 노란색으로 보이는 co-localized 신호를 생성할 수 있으며, 이는 마커 사이의 실제 거리와 관련이 없을 수 있습니다. 공동 지역화를 정의합니다.

Z축의 투영이 있는 단일 평면 뷰가 Z축을 따라 이동하도록 생성되어야 합니다. 공동 지역화를 찾고 있습니다. Z축 투영은 이 이미지의 오른쪽과 아래쪽 부분에서 볼 수 있듯이 얻어진 것입니다.

형광 복셀은 특정 세포체에 마커 발현을 할당하여 3차원 렌더링을 통해 고체 물체로 변환할 수 있습니다. 고배율 및 3D 렌더링 후 두 마커는 매우 근접한 서로 다른 셀에 속하는 것으로 보입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 여러 마커와 염료를 사용하여 면역형광 분석을 수행하는 방법과 컨포칼 현미경으로 3차원 이미지를 올바르게 획득하고 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

또한, 후처리 분석은 세포 수준에서 공동 발현 또는 공동 국소화를 분석하거나 신호를 다른 공간 평면에서 선택적으로 국소화해야 하는 경우에 유용하게 활용될 수 있다고 설명했습니다.