마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

이 절차의 전반적인 목표는 단일 단백질의 단백질 분해 절단에 대한 기계적 부하의 영향을 매우 병렬적이고 비용 효율적인 방식으로 연구하는 것입니다. 이 시연에서는 첫 번째 단계에서 매트릭스 금속단백분해효소 1에 의한 콜라겐 절단을 검사하고, 콜라겐 트리머를 플로우 셀의 유리 커버 슬립에 부착한 다음 개별 콜라겐 분자에 마이크로미터 크기의 마그네틱 비드를 부착합니다. 두 번째 단계는 플로우 셀을 마그네틱 핀셋 장치에 장착하고 커버 슬립 표면에서 특별히 부착되지 않은 비드가 제거되었는지 확인하는 것입니다.

다음으로, 프로테아제를 플로우 셀(flow cells)에 첨가합니다. 마지막 단계는 비드 박리를 실시간으로 모니터링하여 단백질 가수 분해 속도를 측정하는 것입니다. 다양한 단백질 분해 효소 농도와 힘에서 비드 박리 속도를 측정함으로써 미세한 양의 기질과 단백질 분해 효소를 사용하여 표준 동물학적 동역학 매개변수를 도출할 수 있습니다.

또한 이 기술은 단백질 가수 분해 속도와 절단에 수반되는 기질 단백질의 구조적 변화에 대한 기계적 힘의 영향에 대한 고유한 정보를 제공합니다. 광학 T 트레이스 및 원자력 현미경과 같은 다른 방법과 비교하여이 기술의 주요 장점은 이 기술이 높은 처리량과 비용 효율적이라는 것입니다. 이 방법은 단일 단백질의 단백질 분해 절단에 대한 효과적인 힘에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 기기 및 기술은 단백질 접힘 및 확인에 대한 힘의 영향을 포함하여 광범위한 생물물리학적 문제에 적용할 수 있습니다.

초음파 처리를 사용하여 커버 슬립을 청소하여 플로우 셀 준비를 시작합니다. 커버 슬립을 에이터에 들어갈 수 있는 작은 유리 용기에 추가합니다. 용기에 이소프로판올을 채우고 목욕기에서 이소프로판올을 20분 동안 초음파 처리한 다음 다량의 탈이온수로 덮개를 헹굽니다.

용기에 물을 채우고 20분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 건조 후 덮개는 여과된 먼지가 없는 공기의 흐름에서 미끄러집니다. 커버 슬립을 검사하고 얼룩이 없는 것만 사용하십시오.

덮개를 통과하여 남아 있는 먼지와 습기를 청소하기 위해 몇 초 동안 덮개를 부드럽게 불을 붙입니다. 분젠 버너에서 발생하는 가스 화염을 통해 미끄러지며 과도한 열로 인해 커버 슬립이 뒤틀리지 않도록 주의합니다. 이 단계는 잔류 표면 오염 물질을 제거합니다.

그런 다음 양면 스카치 테이프를 사용하여 두 개의 커버 슬립을 함께 부착합니다. 먼저 길이 약 3cm, 너비 0.3cm의 테이프를 절단하여 테이프를 22 x 40mm 커버 슬립에 부착하고 중간에 1.6cm 채널을 남겨 둡니다. 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 부드럽게 눌러 테이프가 제대로 부착되었는지 확인합니다.

자기 핀셋 장치는 이 실험실에서 직경 1mm의 핀홀이 있는 알루미늄 L 브래킷을 사용하여 구성되었으며 핀셋의 높이를 조절하기 위해 수직 Z 변환기에 장착되었습니다. 두 개의 영구 희토류 자석이 핀홀 양쪽의 브래킷에 부착되어 자기장 구배를 생성했습니다. 마그네틱 트랩의 적절한 보정은 이 절차의 필수 요소입니다.

성공을 보장하기 위해 이 섹션에 설명된 대로 두 가지 방법을 사용합니다. 마그네틱 트랩을 보정하려면 보정을 위해 서면 프로토콜에 설명된 대로 5개의 프라임 및 3개의 프라임 끝에 비오틴과 doxygen이 포함된 라벨을 붙인 Lambda 파지에서 미리 준비한 DNA를 사용합니다. 먼저 DNA를 플로우 셀에 부착하려면 플로우 셀에 항D 산소와 항체 용액을 채우고 항체가 유리 표면에 15분 동안 부착되도록 합니다.

다음으로, 플로우 셀에 BSA 용액을 첨가하여 DNA의 비특이적 부착을 방지하기 위해 플로우 셀의 표면을 먹었습니다. 이 단계와 모든 후속 단계에서 flow cell에 추가되는 시약 부피는 최소 2배가 되어야 합니다. 이 시연에서 75마이크로리터인 플로우 셀의 부피는 실온에서 45분 동안 플로우 셀을 배양합니다.

이 단계를 반복한 후 기능화된 람다 DNA 50피코 몰을 추가하고 15분 동안 커버 슬립에 부착한 후 1개의 XPBS로 여분의 DNA를 씻어냅니다. 마지막으로 스트렙타비딘으로 코팅된 초상자성 비드를 추가하고 15분 동안 고정된 DNA에 부착되도록 합니다. 이 데모에서는 2.8마이크로미터 비드가 사용됩니다.

하나의 XPBS로 여분의 비드를 씻어냅니다. 다음으로, 영구 자석을 샘플 표면에서 멀리 떨어진 위치로 이동하여 자기 핀셋 보정을 수행합니다. 그런 다음 준비된 플로우 셀을 현미경에 놓습니다.

영구 자석을 플로우 셀(flow cell) 위의 위치로 이동합니다. 두 유리 표면에서 멀리 떨어진 비드에 초점을 맞춰 Lambda DNA 기능화 비드의 초점면을 선택합니다. 올바른 초점면은 원하는 구슬의 중심이 밝은 초점면입니다.

500프레임에 대해 80헤르츠가 더 큰 비드 모션의 비디오를 가져옵니다. 자석을 샘플 표면에 더 가깝게 이동하고 각 위치에서 비드 동작의 비디오를 녹화합니다. 5mm를 초과하는 거리의 경우 1mm에서 5mm 사이의 거리에 대해 1mm씩 이동합니다.

1mm 미만의 거리에 대해 0.5mm 단위로 이동, 0.25mm 단위로 이동 각 데이터 세트에 대해 2D 가우스 피팅을 사용하여 비드의 중심을 추적합니다. 서면 절차에 설명된 대로 브라운 변동을 통해 힘을 계산합니다. 파워 스펙트럼 Lian fit을 통해 힘 계산을 확인하여 힘의 정확도를 확인합니다.

롤오프 빈도를 찾기 위해 적용된 힘과 롤오프 빈도 사이의 관계는 콜라겐 펩타이드가 플로우 셀에 부착되고 콜라겐 펩타이드와 MMP one 단백질을 발현 및 정제하기 전에 텍스트에서 찾을 수 있습니다. 먼저 플로우 셀에 anti mic 항체 용액을 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양하여 안티 마이크가 플로우 셀의 표면에 부착되도록 하고, 플로우 셀을 먹음으로써 단백질의 비특이적 부착을 방지하기 위해 밀리리터당 5mg을 사용합니다. BSA 150 피코몰라 콜라겐 펩타이드를 첨가하고 45분 동안 M ttag를 통해 항체에 부착되도록 합니다.

플로우 셀에 2.8 마이크로미터 비드를 추가하기 전에 PBS 버퍼를 사용하여 과도한 콜라겐을 씻어냅니다. 강력한 자석을 사용하여 연쇄상구균 분열 및 코팅된 비드 용액에서 분리한 다음 PBS에 재현탁해야 합니다. 이 과정을 세 번 반복해야 합니다.

이 단계는 2.8마이크로미터 비드가 표면 고정 콜라겐 펩타이드에 결합하는 데 필수적입니다. 다음으로, 연쇄상구균 분열 스트렙타비딘 코팅된 초상자성 비드를 추가하고 45분 동안 콜라겐 분자에 부착되도록 합니다. 플로우 셀(flow cell)이 콜라겐 펩타이드(collagen peptide) 및 마그네틱 비드(magnetic bead)로 조립되면 마그네틱 트랩(magnetic trap)에서 플로우 셀(flow cell)을 이미지화합니다.

낮은 힘으로, 구슬의 하위 집단은 때때로 약하고 불특정 방식으로 표면에 부착됩니다. 적당한 힘을 가하면 이 구슬이 해방됩니다. flow cell에 활성 효소를 추가합니다.

이 경우, MMP one을 3.5 millimolar A PMA를 첨가하여 사전 활성화하고 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양했습니다. 플로우 셀(flow cell)이 마그네틱 핀셋 장치에 다시 도입되는 즉시 몇 가지 시야에 걸쳐 비디오를 녹화하면 일반적으로 수백 개의 비드가 부착됩니다. 이 측정은 시간이 0과 같음에 해당합니다.

모든 비드가 분리되거나 더 이상 단백질 분해가 식별되지 않을 때까지 일정한 시점에서 여러 시야를 기록하는 동일한 프로세스를 반복합니다. 마그네틱 핀셋은 1마이크로미터 및 2.8마이크로미터 비드에 대해 보정되었습니다. 강제 단백질 분해 실험에서 관찰된 브라운 변동의 크기와 다양한 자석 위치에서 롤오프 빈도 계산을 모두 사용하여 단백질 분해 속도를 찾기 위한 시간 함수로 남아 있는 정규화된 비드 수를 표시할 수 있습니다.

그리고 이 과정은 다양한 효소 농도와 힘에 대해 반복될 수 있습니다. 단백질 분해 속도는 적용된 힘에 따라 다릅니다. 단백질 분해 속도는 1 피코 뉴턴, 6.2 피코 뉴턴, 13 피코 뉴턴으로 결정되었습니다.

구슬 unpro의 분율은 15분 이상이며 다른 실험에서 0.25로 거의 일정하게 유지됩니다. 우리의 경우, 이 분석을 통해 적용된 힘의 함수로서 MMP one의 촉매 효율을 측정할 수 있었습니다. 데이터를 분석한 결과, 콜라겐 삼중 나선(collagen triple helix)은 단백질 분해 전에 국부적으로 풀려야 한다는 것을 발견했습니다.

이 기술을 숙달하면 올바르게 수행하면 5-6시간 안에 수행할 수 있습니다. 데이터의 좋은 통계적 유의성을 얻으려면 뷰의 연료당 최소 30-50개의 구슬이 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. PMA는 매우 위험할 수 있으므로 이 실험을 수행하는 동안 항상 장갑, 실험실 가운 및 안면 마스크와 같은 예방 조치를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

이 비디오를 시청한 후에는 자기 핀셋을 사용하여 단일 단백질의 단백질 분해 절단에 대한 힘의 영향을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자기 핀셋은 단일 분자 생물물리학 실험을 이해하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이 기술은 다른 프로테아제 및 기질 조합으로 확장될 수 있습니다.

더하여, 유사한 기술은 단백질 구조상 역학을 이해하기 위하여 뿐 아니라 RNA 및/또는 DNA를 결합하거나 변경하는 다른 단백질을 이해하기 위하여 이용될 수 있습니다.