도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 배양된 포유류 세포의 세포질에 형광 표지된 소분자 또는 단백질을 도입하고 마이크로미터에서 멀티 나노미터 분해능으로 유도된 형태학적 변화를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 격자 유리 커버 슬립에서 포유류 세포를 배양하고 형광 표지된 소분자 또는 관심 단백질을 마이크로 주입함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포를 포름알데히드에 고정하고 형광 현미경을 사용하여 관찰 및 이미지화합니다.

그런 다음 세포를 글루타르알데히드로 고정하고, 절단하고, 염색하고, 전자 현미경을 사용하여 이미지화합니다. 마지막으로, 명시야 형광등 및 전자 현미경 투시법으로 촬영한 이미지를 결합하고 정렬합니다. 궁극적으로 이러한 이미지의 상관 관계를 통해 연구자는 관심 있는 작은 분자 또는 단백질에 의해 유도된 고해상도 섭동을 이미지화할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 댈러스에 있는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터의 미생물학과 닐 알토 박사 실험실의 에반 레딕 박사입니다. 오늘은 M Clem 절차 또는 미세 주입 상관 광 및 전자 현미경에 대해 이야기 할 것입니다. 마이크로 주입 또는 현미경 검사와 같은 독립형 기술에 비해 이 절차의 주요 장점은 여기에서 함께 수행되고 격자 유리 커버 슬립의 사용을 지원한다는 것입니다.

이 격자 무늬 커버 슬립은 연구원들이 프로토콜의 다른 부분에서 동일한 세포로 돌아갈 수 있도록 합니다. 또한 이 기술은 연구자에게 다양한 주사 가능한 소분자 또는 관심 단백질에서 세포 내 구조 변화를 유도하는 것을 관찰하고 마이크로미터에서 수 나노미터 해상도로 이를 수행할 수 있는 능력을 제공합니다. 미세주입을 준비하기 위해 일반 쥐 신장 또는 불멸의 자궁경부암 세포와 같은 세포를 포토 에칭 유리, 격자 무늬 커버 슬립, 부착된 두 개의 살아있는 세포 접시에 배양하여 섭씨 37도 및 5%CO2에서 세포를 배양합니다.

사용할 실험 타임라인에 따라 세포의 co-fluency를 조정합니다. 완전히 융합된 플레이트는 전자 현미경에서 미세 주입된 세포를 식별하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 따라서 이와 같은 종자 세포는 짧은 실험 당일에 약 50%co 유창성에 도달하고 약 25%co 유창성에 도달합니다.

장시간 실험이 진행되는 날에는 형광 표지된 단백질 DNA 또는 작은 분자를 적절한 완충액에 넣어 최종 부피 50마이크로리터까지 준비합니다. 선택한 Fluor ofor에 따라 텍사스 레드 또는 캐스케이드 블루와 같은 추적 염료를 추가합니다. 밀리리터당 0.5에서 1밀리그램의 농도를 추가합니다.

0.22 미크론 원심 필터를 통해 용액을 여과합니다. 제조업체의 지침에 따라 미세 주사 바늘을 당긴 후 바늘 뒤쪽 끝에 마이크로리터의 용액을 조심스럽게 피펫으로 넣습니다. 도립 현미경에 부착된 상업용 미세 주입 장치의 마이크로 매니퓰레이터 암에 바늘을 로드합니다.

배양된 세포 접시를 도립 현미경의 접시 홀더에 놓습니다. 사진 에칭 그리드 내에서 자라는 셀을 찾고 그리드의 영숫자 식별자를 기록해 둡니다. 이는 이후의 모든 단계에서 사용됩니다.

커버 슬립의 중앙에 가깝게 부착되는 미세 주입 대상 세포를 선택하고 주변 근처에 부착하는 세포는 피하는 것이 중요합니다. 이것은 나중에 전자 현미경 매뉴얼에 사용되는 epon 수지 중앙 피스로 관심 세포를 효율적으로 전달하고, 커버 슬립 위로 주입 암을 수동으로 내리고, 팁이 세포 표면에 부드럽게 닿을 때까지 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 내리기 때문에 중요합니다. 약 50%Co 유창성으로 성장한 세포에 대해 선택한 그리드 내에서 다른 모든 세포를 마이크로 주입하면 600제곱 마이크로미터 그리드당 약 80개의 세포가 예상되며, 이는 약 30-40개의 실험 및 제어 세포의 N을 제공합니다.

주입 후 형광 현미경 검사를 수행하기 위해 원하는 시간 동안 접시를 인큐베이터에 다시 놓습니다. 성장 배지를 버리고 PBS에 포름알데히드로 세포를 실온에서 10분 동안 고정합니다. 정착액을 하나의 XPBS로 교체하십시오.

그런 다음 저배율 및 고배율에서 선택한 그리드의 5-10개의 명시야 이미지를 촬영하여 세포의 배열을 문서화합니다. 마이크로 주입된 세포를 식별하려면 inert injection dye eye의 excitation 및 emission 파장에서 형광 이미지를 촬영합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 이전에 이미징된 동일한 그리드 내에서 고배율로 마이크로 주입된 세포의 Zack을 수집합니다.

형광 이미지를 전자 현미경을 사용하여 식별될 세포 내 구조와 연관시키기 위해서는 고배율이 필요합니다. 컨포칼 이미징 후 커버 슬립 제거액을 사용하여 접시에서 커버 슬립을 분리하고 XPBS 1개가 들어 있는 신선한 배양 접시에 세포면이 위로 향하게 놓습니다. 전자 현미경 처리를 진행합니다.

표준 EM 프로토콜을 따른 후입니다. 얼룩을 고정하고 샘플을 탈수하려면 epon 수지를 준비하고 커버 슬립 셀 면이 아래로 향하게 하여 eon 수지로 채워진 튜브 위에 놓습니다. 수지가 섭씨 60도에서 24시간 동안 중합되도록 합니다.

epon 수지에서 커버 슬립을 제거합니다. 액체 질소에 빠르게 담그십시오. 섭씨 60도에서 영하 196도까지의 온도 충격.

수지 튜브에서 커버 슬립을 제거합니다. 5분에서 10분 정도 기다린 다음 커버 슬립이 없는 튜브를 회수합니다. 해부 범위 아래에서 수지의 표면을 검사하여 관심 그리드를 찾습니다.

멸균 면도날이나 메스를 사용하여 관심 그리드만 블록의 정점에 있도록 epon 블록을 자르고, 트리밍된 블록의 일련한 부분을 잘라내고, 소변기 아세테이트와 구연산납을 사용하여 표준 프로토콜을 사용하여 섹션을 대조합니다. 세포의 상대적 위치를 가이드로 사용하여 전자 현미경에서 원하는 세포를 재배치합니다. 앞서 캡처한 고해상도 형광 이미지를 사용합니다.

전자 현미경 사진에서 형광 신호에 해당하는 관심 영역을 식별합니다. 이종 염색질의 위치 및 핵 포막과 같은 랜드마크를 사용하여 어떤 형광 Zack 이미지가 EM 슬라이스에 해당하는지 확인할 수 있습니다. 현재 Image J 또는 Adobe Photoshop과 같은 이미징 프로그램으로 이미지화하고 있는 경우 형광 이미지의 불투명도를 50%로 줄이고 해당 TEM 이미지에 오버레이합니다.

표시된 배율을 조정하여 이미지를 정렬합니다. 다음은 microinjection과 correlative light and electron microscopy의 결과입니다. 이 이미지는 레이저 에칭 유리 격자 커버 슬립에서 자라는 NRK 세포의 명시야 현미경 사진을 보여줍니다.

주입된 세포를 포함하는 그리드를 식별하는 데 사용되는 b 및 m 배경 문자에 주목하십시오. 화살표는 전자 현미경으로 식별되고 이미지화된 두 세포를 나타냅니다. 여기에 표시된 것은 마이크로 주입된 세포를 식별하는 데 사용되는 비활성 추적 염료 캐스케이드 블루의 형광 이미지입니다.

다음은 small molecule로 표시된 아민의 명시야 및 형광 신호의 오버레이입니다. 이 패널은 주입된 세포의 명시야 형광등과 전자 현미경의 상관관계를 나타냅니다. 화살촉은 이 패널에서 더 높은 배율로 이미지화된 형광 반점을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 관심 단백질을 마이크로 주입하고 미세 주입 Clem 또는 상관 광 및 전자 현미경 검사를 사용하여 유도하는 세포 내 형태학적 변화를 추적하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.