Name: 도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 CLEM 기법을 통해 진핵 세포에 미세주입된 분자의 아형태학적 변화를 나노미터 해상도로 관찰하는 방법을. 이 기술은 형광현미경과 전자현미경을 결합하여 세포 소기관의 초고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

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우리는 도움이 토론의 알토 연구소의 회원 감사드립니다. 우리는 또한 기술적 인 전문 지식과 조언을 UT 남서 의료 센터, 특히 박사 크리스 Gilpin, 톰 Januszewski, 그리고 로리 뮬러에서 분자 및 세포 이미징 시설 감사드립니다. 우리는 또한 원고의 중요한 읽기에 대한 박사 Xionan 동 감사드립니다. 이 작품은 NMA에 NIH 보조금 AI083359에서 지원

1. 포유류의 세포 배양 <ol><li> 일반 쥐 신장 (NRK)는 (모든 시약에 대해 표 1를 참조하거나 셀 요리를 살고 부착 photoetched 유리 gridded coverslips에 자궁 경부암 (헬러), 또는 기타 적절한 포유류의 세포 라인 37 배양 아르 ° C, 5 % CO 2, 불후의 장치 DMEM + 10% FBS에)이 프로토콜에 사용하고 1% 펜 / 패 혈성. 주의 사항은 양식 포유류의 세포와 함께 작업 할 때 무균 환경을 유지하기 위해주의해야한다. </li><li> 실험 시간 선 (0~5시간 대 1~2일의 포스트 분사)에 따라 세포의 confluency는 ~ 50 %로 조정하거나 각각 25 % ~해야한다. </li></ol> 2. Microinjection <ol><li> ~ 50 μl의 최종 볼륨에, 세포 문화의 복종 할 의무에 따라, 버퍼의 선택 원하는 단백질, DNA, 또는 작은 분자를 준비합니다. 이러한 텍사스 레드, 캐스케이드 블루 등의 불활성 형광 염료microinjected 셀을 표시하기 위해 포함되어 있습니다, 사출 염료 및 형광 프로브의 선택은 겹치지 여기와 방출 파장이 있어야합니다. microinjection에 필요한 관심 분자의 농도는 경험적으로 결정되어야하고, 형광등 추적 염료는 일반적으로 0.5-1.0 MG / ML에서 사용됩니다. 일반적으로, rhodamine 또는 다른 형광는 covalently 감지하지만 다른 방법은 감도에 따라 사용할 수 있습니다, 상용 키트를 사용하여 귀하의 관심 분자에 부착된다. 자세한 내용은 아래 중요 고려 사항을 참조하십시오. </li><li> 0.22 μm 원심 필터를 통해 injectant (~ 50 μl)를 필터링 할 수 있습니다. 원심 필터는 진공 및 / 또는 죽은 볼륨을 연결 한 주사기 여과 선호하고 있습니다. </li><li> microinjection의 바늘을 생성하려면, 붕규산 유리 피펫은 불타는 브라운 Micropipette 풀러 다음 제조업체의 지침을 사용하여 뽑아 있습니다. 또한, microinjection바늘은 femtotip의 microinjection의 바늘하게 Eppendorf 등의 업체에서 구입하실 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 Eppendorf 20 Femtotips를 사용하여 microinjection의 바늘의 unmolested 끝으로 injectant 4 μl를 피펫. 더 거품이 당겨 microinjection의 바늘 내에 존재하지 있는지 확인합니다. 역 현미경에 부착 된 Eppendorf FemptoJet Injectman의 micromanipulator 암에 microinjection의 바늘을로드합니다. microinjection 절차의 좋은 검토, 독자는 시각화 실험 제 8의 이전 저널로 이동합니다. </li><li> 역 Zeiss 현미경의 요리 홀더에 gridded coverslip 및 배양 세포와 라이브 셀 요리를 놓습니다. photoetched 그리드 내에서 성장하는 세포를 찾아 격자의 영숫자 식별자를 참고, 다 다음 단계에 사용됩니다. 다음 단계는 coverslip의 가장자리에서 샘플 전송을 제한하므로 이상적으로, coverslip의 중심에 셀을 찾습니다. </li><li> 수동으로 낮은 주입 coverslip 위에 자리로 팔, 그리고 끝이 부드럽게 교양 세포와이 시점 이후 바늘의 움직임을 방지하기 위해 언론 &#39;제한의 표면을 만지는 때까지 micromanipulator 조이스틱 및 컨트롤, 낮은 사출 바늘을 사용하기 때문에 허약 한을 깨는 붕규산 유리를 꺼냈다. 셀 microinjection의 모든 다른 측면 Eppendorf FemtoJet InjectMan 사용자 설명서에 따라 수행됩니다. microinjection 기술은 최근에 박테리아가 9 개인 분비 독성 단백질을 이해하는 데 사용되었습니다. </li><li> 선택한 그리드 내의 모든 다른 셀을 Microinject. 세포가 ~ 50% confluency에서 성장으로, 하나는 600 μm이 그리드 당 ~ 80 셀 (예를 들어이 그림. 3A) 기대할 수 있습니다. 따라서, 형광 및 전자 현미경 검사시 ~ 30-40 실험 및 제어 세포의 N가있을 것입니다. </li><li> 원하는에 대한 포유류의 세포 배양 배양기에 다시 라이브 셀 요리를 놓으십시오시간은 실험 설정에 의해 결정. 또한, 하나는 이전에 고정이 관심의 특정 subcellular 구조의 모양을 기다리고 microinjection에서 시간 경과 현미경 분석에 직접 진행할 수 있습니다. </li></ol> 3. 형광 현미경 <ol><li> 원하는 경우, microinjected 세포의 라이브 셀 시간이 경과 형광 측정을 수행, 그 이후, 0.1 M cacodylate 버퍼 (산도 7.4)에 2.5 %의 글 루타 알데히드와 미디어를 교체하고 실온에서 10 분에 품다. 라이브 셀 측정이 필요하지 않는 경우 그러나, 세포의 성장 미디어를 버리고 10 분 동안 실온에서 1xPBS 5 ML 3.7 %의 포름 알데히드로 세포를 해결할 수 있습니다. 정착액을 취소하고 5 ML의 1xPBS로 교체, 3.2 단계로 진행합니다. 참고 : 형광 현미경이 완료 때까지 글 루타 알데히드를 추가하지 중요합니다. </li><li> 형광 현미경의 photoetched gridded coverslip으로 라이브 셀 요리를 장소 (공 촛점이 생 필요하지 않습니다S 단계)과 세포의 배열 (그림 4A)를 문서화하는 5-10 시야하고 적절한 격자의 형광 이미지를 수집합니다. 불활성 분사 염료 (그림 4B)의 여기 및 방출 파장을 사용하여 microinjected 된 해당 셀을 식별합니다. 이 전자 현미경을 포함한 후속 단계에 microinjected 세포의 식별을 용이하게하기 위해 다른 배율 (예 : 10X와 65x)에서 이미지를 얻는 것이 중요합니다. </li><li> 공 촛점 형광 현미경을 사용하여 단계 위의 2.5에서 확인 된 격자 내에서 microinjected 세포의 Z-스택을 수집합니다. 높은 배율 (100x)는 전자 현미경에 표시됩니다 subcellular 구조와 형광 이미지를 상관 관계하기 위해 필요합니다. </li><li> coverslips는 상업적으로 이용 가능한 coverslip 제거 유체와 함께 라이브 셀 요리의 바닥에서 제거, 5 ML을 포함하는 처녀 세포 배양 접시에 세포 측을 배치됩니다1xPBS. 아래의 설명과 같이 coverslip 그런 다음 전자 현미경에 처리됩니다. </li></ol> 4. 전송 전자 현미경 <ol><li> 0.1 M cacodylate 버퍼 (산도 7.4) 2 ML 2.5 %의 글 루타 알데히드와 1xPBS 버퍼를 교체하고 10 분 동안 실온에서 알을 품다. 더 이상 부화가 필요하지하면서, subcellular 구조의 유지에 도움이됩니다. 참고 : 혼자 포름 알데히드는 EM 분석을위한 충분한 정착액하지 않습니다. </li><li> cacodylate 버퍼 든 세 세차에 이어 30 분에 0.1 M cacodylate의 버퍼 2 ML 1 % 오스뮴의 tetroxide의 추가와 정착액 및 얼룩 세포를 제거하고 마지막으로 ddH 2 O.있는 모든 버퍼를 교체 </li><li> 표준 EM 프로토콜 후, 에탄올의 등급 (70 % ~ 100 %) 시리즈의 샘플을 탈수. Epon 수지가 채워진 튜브의 상단에 Epon 수지 및 장소 coverslip 세포 쪽을 준비합니다. 60에서 24 시간을위한 중합을 허용 ° C. photoetched gridded coverslip 셀 측 수행을 배치하여Epon 수지로 wn은 관심뿐만 아니라 격자 패턴의 세포 모두 (예 그림. 3B) 중합 동안 Epon 수지로 전송됩니다. </li><li> 신속하게 액체 질소 및 / 또는 끓는 물에 immersing하여 Epon 수지의 coverslips를 제거합니다. 관심 격자를 (: 그리드 찰싹 찰싹 소리가 미러 이미지로 전송됩니다 주) 찾을 수 쌍안 해부 범위에서 수지의 표면을 검사합니다. 관심 만 그리드 Epon 수지 블록의 정점에 있습니다 있도록 아래 멸균 면도날이나 메스, 트림 Epon 블록을 사용합니다. </li><li> ultramicrotome 사용하여 원하는 두께 (단층 TEM에 대한 기존의 TEM 및 ~ 250 nm의 두께에 ~ 70 nm의 두께)에 다듬어 블록의 직렬 섹션을 습득. 표준 프로토콜에 따라 uranyl 아세트산과 리드 구연산과 대비 섹션을. </li></ol> 5. 상호 빛과 전자 현미경 <ol><li> 에 대한 관심의 세포를 재이미지를 사용하여 전자 현미경은 이전 단계에서 얻은. 관심되면 microinjected 세포가있는 한, 관심 있던 세포 내의 지역을 식별하는 고해상도 공 촛점 형광 이미지를 사용합니다. TEM을 사용하여 높은 해상도 이미지이 있습니다. 이러한 세포 주변과 형광 Z-스택 이미지 EM이 갈라에 해당하는 결정 핵 봉투와 같은 랜드 마크를 사용합니다. </li><li> 선택의 이미징 프로그램을 (예 : 이미지 J, 어도비 포토샵 등) 사용, 50 %로 형광 이미지의 불투명도를 줄이고 연결합니다되는 TEM 이미지에를 입혀 라. 규모를 조정 (비율을 제한하는 것을 잊지)과 TEM 이미지와 일치하는 공 촛점 이미지의 회전에 의해 이미지를 맞 춥니 다. 형광 이미지의 대비, 선명도 등을 정밀 조정 정렬에 도움이 될 수 있습니다. 참고 : 우리는 heterochromatin, 핵 봉투, 그리고 세포 주변이 도움이 할 수있는 훌륭한 랜드 마크를 나타낸다는 것을 발견했습니다두 이미지의 방향 인치 </li></ol> 6. 중요 고려 사항 <ol><li> 크게 주입 작은 분자를 찾는에 도움이 같은 Rhodamine 또는 Fluorescein 같은 형광 태그는 covalently 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 부착 할 수 있습니다. 추가 정보는 ectopically 전에 microinjection에 형광 subcellular 지방화 마커 단백질을 표현하여 얻은 수 있습니다. 따라서, fluorophores 및 불활성 microinjection 추적 염료의 선택이 중요합니다. </li><li> 가까운 coverslip의 중심에 준수하고 microinjection에 대한 셀을 선택하고 가장자리에 가까운 격자를 선택하지 마십시오. 이 관심의 세포 전자 현미경에 사용되는 Epon 수지로 전송하는 가장 큰 가능성을 제시합니다. </li><li> 세포의 Confluency 전S 중요한 완전히 합류 플레이트는 매우 어렵 전자 현미경에 microinjected 세포의 식별을 줄 것이라고 믿습니다. 오히려, 종자 세포들은 이러한 짧은 실험 당일 ~ 50% confluency에 도달하거나 이상의 날 (1-2 일) 실험에 ~ 25% confluency.하는 위치와 모양 세포의뿐만 아니라 방향에 랜드 마크와 같은 &#39;빈 공간 전자 현미경 이미지를 사용합니다. </li><li> 공 촛점 광학 슬라이스 두께는 실험의 요구에 조정해야하기 때문에 경험적으로 10 결정해야합니다. </li><li> fixatives의 포름 알데히드 및​​ 글 루타 알데히드는 가장 높은 등급의해야합니다. 포름 알데히드는 단백질과 작은 형광 분자 (예 : Rhodamine 또는 FITC 등) 모두의 형광 특성을 보존 아직 세포가 해결됩니다. 그러나, 구조가 높은 EM 해상도를 허용 보존되지 않습니다. 글 루타 알데히드는 analy EM에 대한 높은 수준의에 멤브레인과 subcellular 구조를 유지시스,하지만 크게 형광 방해합니다. 따라서 두 단계로 고정 모두 형광을위한 중요하고 EM 현미경. 최종 고정이 글 루타 알데히드 처리에 의해 수행 될 수 있으므로 포름 알데히드 고정 단계는 라이브 셀 측정을 수행 할 경우 생략 할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 이 절차는 직접 진핵 세포의 세포질에 관심있는 분자를 제공 및 멀티 나노 미터 해상도 mm에서 휴대폰 및 organeller 건축에서의 현지화 및 / 또는 효과를 모니터링 할 수있는 능력을 갖게. 실험 설정 및 절차의 개략도는 그림 2에 표시됩니다. 이 기술은 (그림 공 촛점 현미경 후 Epon 수지에 관심뿐만 아니라 격자 패턴의 세포를 모두 양도 할 수있는 레이저 에칭 유리 gridded coverslip (그림 3A)에 성장 세포의 microinjection에 의존3B). 전형적인 microinjection의 클레멘 타인 절차는 상관이 때, subcellular 지방화와 ultrastructural 분석을 모두 허용 형광 이미지와 전자 micrographs를 산출. photoetched 유리 gridded coverslip에 성장 세포는 밝은 필드 이미지가 취득하는 후 관심있는 분자 (그림 4A)로 microinjected 있습니다. 불활성 추적 염료가 아닌 microinjected 세포 (그림 4B)에서 microinjected 세포를 구별 할 통합됩니다. 공 촛점 Z-스택은 형광 또는 관심 microinjected 작은 분자 (그림 4C)에 첨부 된 다른 식별자를 사용하여 얻을 수 있습니다. 샘플은 글 루타 알데히드로 고정하고 전자 현미경에 처리됩니다. 전자 micrographs들은 해당하는 셀 (그림 4D)에 취득과 중첩되어 있습니다. 형광 신호를 품고 영역은 (그림의 4E 높은 배율에서 더 상세하게 검사 아르 </STRONG&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. microinjection의 클레멘 타인 절차의 타임 라인. 실험 설정에 따라 microinjection 및 형광 측정은 같은 날에 수행 할 수 있습니다. 전자 현미경의 샘플을 준비하는 것은 긴 incubations 단계에 가장 많은 시간이 소요 때문입니다 후 2-3 일 지속됩니다. TEM 분석 및 전자 현미경 이미지 형광 신호를 상호 연관은 하루에 수행 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2 microinjection의 클레멘 타인 절차의 일반 그림 1 단계 :.. 레이저 에칭 유리 gridded coverslip에 성장 세포를 찾아 관심 분자를 microinject 2 단계 :.. 시야 이미지 및 microinjected 세포의 공 촛점 형광 Z-스택을 모두 캡처 3 단계 : 준비EM에 대한 coverslip 분석하고 Epon 수지에 삽입 할 수 있습니다. 전송 그리드 패턴을 사용하여 관심 등 그 세포를 차단을 다듬 꼭대기에 있습니다 4 단계 :. ultramicrotome과 시리얼 부분을 잘라 5 단계 :. EM 이미지로 형광 이미지를 상관 관계. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="그림 3"/> . 그림 3 그리드 패턴은 관심 세포의 식별을 용이하게 패널은 ~ 50% confluency로 성장 세포의 microinjection을 묘사,. 격자 식별자 AK을 확인합니다. 스케일 바는 100 μm이다. 패널 B는 관심의 그리드가 해부 현미경에서 확인 후 순차적으로 sectioned 될 polymerized Epon 수지 블록 위에 coverslip에서 전송 격자 패턴을 보여줍니다. 패널 C는 sectioning에 대비 양도 그리드 패턴을 보여줍니다 . 전송 그리드 찰싹 찰싹 소리가 수지 블록에 역에 있습니다, scal전자 바는 1200 μm이다. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="그림 4"/> .. 그림 4 microinjection의 상호의 빛과 전자 ​​현미경의 대표 결과 패널은 레이저 에칭 유리 gridded coverslip에 성장 NRK 세포의 밝은 필드 현미경을 보여줍니다, 화살표는 패널 CD에서 클레멘 타인에 의해 시각화 두 셀을 나타냅니다 패널 B의 형광을 보여줍니다. 불활성 추적 염료 때문에,이 경우에는 캐스케이드 블루, microinjected 된 셀을 식별하는 데 사용됩니다. 패널 C는 밝은 분야의 오버레이와 Rhodamine-라벨 작은 분자의 형광 서명을 보여줍니다. 여기에 표시된 두 개의 세포는 A &amp; B. 패널 D는 시야, 형광 및 전자 현미경의 클레멘 타인을 나타내는 패널의 화살표로 표시되며,. 화살표 머리 형광 puncta이 패널 E의 높은 배율의 이미지로 나타냅니다 스케일 바는 fol과낮은 : 패널 A &amp; B, 100 μm, C &amp; D, 50 μm, E, 100 nm의.

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</ol>

관심의 충돌이 선포되지 않습니다.

여기에 제시된 방법은 진핵 세포 세포질에 정화 단백질, 핵산, 또는 작은 분자의 직접 전송을 할 수 있으며 형광 및 전자 현미경의 상관 관계를 통해 초 고해상도 분석을 갖게. 이 방법의 사용은 단순하지만 강력한이 많은 기존의 핵심 시설 및 / 또는 적절하게 구비 전자 현미경 실험실와 함께 집에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 사용자가 실시간으로 휘황 태그 분자의 역학을 모니터링 할 수 있으며 따라서 시간 경과 현미경과 함께 사용 단층 전자 현미경에 상관 할 수 있도록 라이브 셀 의무가 있습니다. 예비 경험적 실험은 전자 micr에 대한 최적의 confluency, microinjection 효율과 injectant, fluorophores의 최적화 및 사출 / 염료 (들)을 추적의 적절한 수량의 전달, 가용성 및 / 또는 전문 지식을 결정하기 위해 실험의 모든 단계에서 실시되어야한다oscopy 분석. 클레멘 타인 절차의 모든 단계에서 주입 셀을 찾기이 프로토콜에 중요하다,...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Photoetched Coverslip와 라이브 셀 플레이트 </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGR​​D </td><td></td></tr><tr><td> 텍사스 레드 </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> 캐스케이드 블루 </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 라벨 키트 </td><td> 열 과학 </td><td> 53,002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 μm 원심 여과 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> 붕규산 유리 피펫 </td><td> 셔터 악기 </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> 모델 P-97 </td><td> 램프 테스트를 수행 한 후에는 프로그램을 # 4를 사용 </td></tr><tr><td> FemtoJet의 Microinjection 시스템 </td><td> Eppendorf </td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslip 제거 유체 </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai 전송 전자 현미경 </td><td> 페이 </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

진핵 세포는 복잡한에 의존 높은 규제하고, 적절한 세포 기능에 필요한 생화학 극성을 보존 기능 뚜렷한 막 바인딩 된 구획. 효소, 단백질, 그리고 cytoskeletal 부품이 생화학 분리를 적용하고 유지하는 방법을 이해하는 것은 파라마운트 중요성을 따라서입니다. 휘황 태그 분자의 사용 또는 교란 subcellular 구획은 풍부한 지식이 나왔고 및 셀룰러 규제에 대한 우리의 이해를 전진했다와 / 현지화입니다. 이러한 형광 및 공 촛점 현미경 등의 이미징 기술은 비교적 간단 휘황 태그 작은 분자의 위치를 ascertaining 수 있도록 매우 작은 구조 그러나 해상도는 1 제한됩니다. 한편, 전자 현미경은 매우 높은 해상도로 subcellular 형태의 세부 사항을 발표했다 있지만 정적 자연은 어려운 매우 동적 프로를 측정 할 수 있습니다정밀도 2,3와 cesses. 따라서, 동일한 샘플의 전자 현미경, 칭했다 상호 빛과 전자 ​​현미경 (클레멘 타인) 4,5과 빛 현미경의 조합은, 전자 현미경 6 높은 해상도로 ultrafast 형광 이미징의 듀얼 장점을 갖게. 이 강력한 기술은 세포 생물학 5,7의 여러 측면을 연구 구현되었습니다. 처음 소개 된 이래,이 절차는 높은 해상도의 subcellular 구조와 morphologies를 구별 할 수있는 능력을 향상 시켰습니다. 여기, 우리는 클레멘 타인 (그림 1) 다음 빠른 microinjection을 수행하기위한 간소화 된 방법을 제시한다. microinjection의 클레멘 타인 절차는 직접 진핵 세포 세포질에 작은 분자 및 / 또는 단백질의 특정 수량을 소개하고 (그림 2) 멀티 나노 미터 해상도 mm의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 기술은 microinjecting을 기반으로합니다세포는 모두 공 촛점 형광 및 전자 현미경과 라이브 셀 요리와 이미지의 하단에 부착 레이저 에칭 유리 gridded coverslips에 성장. 관심 세포의 현지화 (들) 쉽게 (그림 3) 시료의 고정에 사용되는 Epon 수지에 이르기까지 관심의 세포와 함께 양도 및 이전 전자 현미경 분석에 sectioning되는 격자 패턴에 의해 촉진된다. 형광 및 EM 이미지의 중첩은 사용자가 subcellular 지방화뿐만 아니라 관심 microinjected 분자 (그림 4)에 의해 유도 된 형태학 및 / 또는 ultrastructural 변경 사항을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 microinjected 샘플의 특성에 따라 몇 시간이 ≤에서 5 초를 이르는 시간이 가리키는 의무가 있습니다.

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

진핵세포는 생화학적 극성을 유지하는 복잡하고 고도로 조절되며 기능적으로 구분된 막 결합 구획에 의존합니다...

다음 실험의 전반적인 목적은 배양된 포유류 세포의 세포질 내로 형광 표지된 소분자 또는 단백질을 도입하고, 마이크로미터에서 멀티 나노미터 해상도까지 유도된 형태학적 변화를 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 격자가 있는 유리 커버슬립 위에 포유류 세포를 배양한 후, 관심 있는 형광 표지 소분자 또는 단백질을 미세 주입합니다. 그다음, 세포를 포름알데히드로 고정하고 형광 현미경을 사용하여 관찰 및 이미징을 수행합니다.그 다음 세포를 glutaraldehyde로 고정하고, 절편을 제작하여 염색한 후 전자현미경으로 이미징합니다. 마지막으로, 명시야 형광 현미경 및 전자현미경으로 촬영한 이미지들을 결합하고 정렬합니다. 궁극적으로, 이러한 이미지들의 상관관계를 통해 연구자는 관심 있는 저분자 화합물이나 단백질에 의해 유도된 섭동을 고해상도로 이미징할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 댈러스에 위치한 텍사스 사우스웨스턴 의료센터 미생물학과의 Neil Alto 박사 연구실에 소속된 Evan Reddick 박사입니다. 오늘은 M Clem 절차, 즉 미세주입 상관 광학 및 전자 현미경법에 대해 말씀드리고자 합니다. 미세주입이나 현미경 관찰과 같은 단독 기술과 비교했을 때 이 절차의 주요 장점은, 그리드 유리 커버슬립을 사용하여 이 두 가지 기술을 결합하여 수행할 수 있다는 점입니다.격자 무늬 커버슬립을 사용하면 연구자가 프로토콜의 서로 다른 단계에서 동일한 세포로 다시 돌아갈 수 있습니다. 또한, 이 기술을 통해 연구자는 다양한 주입 가능한 저분자 화합물이나 표적 단백질에 의해 유도되는 세포 내 구조적 변화를 마이크로미터에서 멀티 나노미터 해상도로 관찰할 수 있습니다. 미세주입을 준비하기 위해, 정상 쥐 신장 세포나 불멸화된 자궁경부암 세포와 같은 배양 세포를 라이브 셀 디쉬에 고정된 포토 에칭 유리 격자 커버슬립 위에 접종하고, 37 °C 및 5% CO2 조건에서 배양합니다.사용할 실험 일정에 따라 세포의 합류도(confluency)를 조절하십시오. 플레이트의 세포가 완전히 합류되면 전자현미경으로 미세주입된 세포를 식별하기가 매우 어렵습니다. 따라서 짧은 실험의 경우 실험 당일에 약 50% 합류도에 도달하도록, 그리고 그 외의 경우에는 약 25% 합류도에 도달하도록 세포를 파종하십시오.실험 시간이 긴 실험을 진행하는 날에, 형광 표지된 단백질, DNA 또는 저분자 화합물을 적절한 완충액에 넣어 최종 부피가 50 microliters가 되도록 준비하십시오. 선택한 형광체에 따라 Texas red 또는 cascade blue와 같은 추적 염료를 추가하십시오. 이때 0.5 to 1 mg/mL의 농도로 첨가하십시오.용액을 0.22 micron 원심분리 필터로 여과합니다. 제조사의 지침에 따라 미세주입 바늘을 제작한 후, 바늘 뒷부분에 용액 수 µL를 조심스럽게 피펫으로 분주합니다. 도립 현미경에 장착된 상용 미세주입 장치의 마이크로 매니퓰레이터 암에 바늘을 장착합니다.배양된 세포가 담긴 디시를 도립 현미경의 디시 홀더에 놓습니다. 포토 에칭 그리드 내에서 성장하고 있는 세포를 찾아 해당 그리드의 알파벳 및 숫자 식별자를 기록합니다. 이 식별자는 이후 모든 단계에서 사용됩니다.미세주입을 위한 세포를 선택할 때는 커버슬립의 중심부에 가깝게 부착된 세포를 선택하고, 주변부에 있는 세포는 피하는 것이 중요합니다. 이는 나중에 전자현미경 관찰에 사용되는 에폰 수지(epon resin) 중심부로 표적 세포를 효율적으로 옮기기 위해 중요합니다. 주입 암(injection arm)을 커버슬립 위로 수동으로 내린 다음, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝이 세포 표면에 살짝 닿을 때까지 내립니다. 선택한 그리드 내에서 세포를 한 칸씩 건너뛰며 미세주입하십시오. 약 50%의 밀도(confluency)로 배양된 세포의 경우 600 square micrometer 그리드당 약 80개의 세포가 예상되며, 이를 통해 약 30~40개의 실험군 및 대조군 세포라는 N수를 확보할 수 있습니다.주입 후, 형광 현미경 관찰을 위해 디쉬를 다시 인큐베이터에 넣고 원하는 시간 동안 배양합니다. 성장 배지를 제거하고, 상온에서 PBS에 희석된 formaldehyde로 10분 동안 세포를 고정합니다. 고정액을 XPBS로 교체합니다.그런 다음, 선택한 그리드를 저배율 및 고배율에서 5~10장의 명시야 이미지로 촬영하여 세포의 배치를 기록합니다. 미세 주입된 세포를 식별하기 위해, 불활성 주입 염료의 들뜸 및 방출 파장에서 형광 이미지를 촬영합니다. 공초점 현미경을 사용하여, 이전에 촬영한 동일한 그리드 내에서 미세 주입된 세포의 고배율 이미지 Z-스택을 수집합니다.전자현미경을 사용하여 식별할 세포 내 구조와 형광 이미지를 상관시키기 위해서는 고배율 확대가 필요합니다. 공초점 이미지 촬영 후, 커버슬립 제거액을 사용하여 디쉬에서 커버슬립을 분리하고, 세포가 위로 향하게 하여 1 XPBS가 들어 있는 새 배양 디쉬에 놓습니다. 이후 전자현미경 분석을 위한 처리 과정을 진행하십시오.표준 EM 프로토콜을 따르십시오. 샘플을 고정, 염색 및 탈수하기 위해 epon resin을 준비하고, 커버슬립의 세포 면이 아래로 향하도록 epon resin이 채워진 튜브 위에 놓으십시오. 60 °C에서 24시간 동안 resin을 중합시키십시오.에폰 수지(epon resin)에서 커버 슬립을 제거하려면, 이를 액체 질소에 빠르게 담급니다. 60 °C에서 -196 °C로 급격한 온도 충격을 줍니다.레진 튜브에서 커버 슬립을 분리합니다. 5~10분 동안 기다린 후, 커버 슬립이 제거된 튜브를 회수합니다. 해부 현미경 하에서 레진 표면을 검사하여 원하는 그리드의 위치를 찾습니다.멸균된 면도날이나 메스를 사용하여, 관심 있는 그리드만이 블록의 정점에 위치하도록 epon 블록을 다듬습니다. 울트라 마이크로톰을 사용하여 다듬어진 블록의 연속 절편을 제작하고, 표준 프로토콜에 따라 우라닐 아세테이트와 리드 시트레이트를 사용하여 절편을 염색합니다. 이전에 캡처한 고해상도 형광 이미지를 참고하여, 세포들의 상대적 위치를 가이드 삼아 전자 현미경에서 원하는 세포를 찾습니다.전자 현미경 사진에서 형광 신호에 해당하는 관심 영역을 식별하십시오. 헤테로크로마틴의 위치와 핵막과 같은 랜드마크를 사용하여 어떤 형광 Zack 이미지가 EM 슬라이스와 일치하는지 결정하십시오. Image J 또는 Adobe Photoshop과 같은 이미징 프로그램을 사용하여 형광 이미지의 불투명도를 50%로 낮춘 다음, 이를 해당 TEM 이미지 위에 겹치십시오.표시된 배율을 조정하여 이미지를 정렬하십시오. 다음은 미세주입 및 상관 광학-전자 현미경 분석 결과입니다. 이 이미지는 레이저로 식각된 유리 그리드 커버슬립에서 성장하는 NRK 세포의 명시야 현미경 사진을 보여줍니다.주입된 세포가 포함된 그리드를 식별하는 데 사용된 배경 문자 b와 m를 확인하십시오. 화살표는 전자 현미경으로 식별 및 촬영한 두 개의 세포를 나타냅니다. 여기에는 미세 주입된 세포를 식별하는 데 사용된 불활성 추적 염료인 cascade blue의 형광 이미지가 표시되어 있습니다.아민으로 라벨링된 저분자 화합물의 명시야 및 형광 신호를 중첩한 이미지입니다. 이 패널은 주입된 세포의 명시야, 형광 및 전자 현미경 이미지 간의 상관관계를 나타냅니다. 화살표는 이 패널에서 더 높은 배율로 촬영된 형광 점(puncta)을 가리킵니다.이 영상을 시청한 후에는 미세주입법(microinjection)을 통해 관심 단백질을 주입하고, 미세주입 CLEM(correlative light and electron microscopy, 상관 광학 및 전자 현미경법) 절차를 사용하여 해당 단백질이 유도하는 세포 내 형태학적 변화를 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

양자점(QD) 나노입자를 에폭시 포매 인간 병리학 조직의 상관 면역세포화학적 연구에 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 당사는 광시야 형광 현미경 및 투과 전자 현미경으로 시각화되는 상용 항체 단편 접합 QD를 사용합니다.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

우리는 MS 시간적 해상도 막 역학의 시각화를 가능하게 전자 현미경, "플래시와 동결"에서 새로운 기술을 개발했다. 이 기술은 고압 동결 optogenetic 뉴런의 자극을 결합한다. 여기서 우리는 절차를 설명하고 상세하게 프로토콜을 설명합니다.

플래시 및 동결 : 전자 현미경으로 막 역학을 캡처하는 소설 기법

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 메서드는 이전 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에 의해 선택 된 셀에 전자 현미경 (EM)를 통해 바이러스-유도 된 세포내 구조 이미지에 적용 됩니다. LM 및 EM 바이러스-호스트 상호 작용의 통합된 보기를 달성 하기 위해 하이브리드 이미징 접근으로 결합 됩니다.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

우리는 mScarlet이라는 형광 단백질을 사용하여 Epon post-embedding correlative light and electron microscopy에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 형광과 미세구조를 동시에 유지할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생물학적 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

성인 배꼽 orangeworm의 electrophysiological 응답 (측정하여 빠르게 화면 호스트 식물의 휘발성 물질에 대한...

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

배우세요 CLEM 기법을 통해 진핵 세포에 미세주입된 분자의 아형태학적 변화를 나노미터 해상도로 관찰하는 방법을. 이 기술은 형광현미경과 전자현미경을 결합하여 세포 소기관의 초고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

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