도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

다음 실험의 전반적인 목적은 배양된 포유류 세포의 세포질 내로 형광 표지된 소분자 또는 단백질을 도입하고, 마이크로미터에서 멀티 나노미터 해상도까지 유도된 형태학적 변화를 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 격자가 있는 유리 커버슬립 위에 포유류 세포를 배양한 후, 관심 있는 형광 표지 소분자 또는 단백질을 미세 주입합니다. 그다음, 세포를 포름알데히드로 고정하고 형광 현미경을 사용하여 관찰 및 이미징을 수행합니다.

그 다음 세포를 glutaraldehyde로 고정하고, 절편을 제작하여 염색한 후 전자현미경으로 이미징합니다. 마지막으로, 명시야 형광 현미경 및 전자현미경으로 촬영한 이미지들을 결합하고 정렬합니다. 궁극적으로, 이러한 이미지들의 상관관계를 통해 연구자는 관심 있는 저분자 화합물이나 단백질에 의해 유도된 섭동을 고해상도로 이미징할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 댈러스에 위치한 텍사스 사우스웨스턴 의료센터 미생물학과의 Neil Alto 박사 연구실에 소속된 Evan Reddick 박사입니다. 오늘은 M Clem 절차, 즉 미세주입 상관 광학 및 전자 현미경법에 대해 말씀드리고자 합니다. 미세주입이나 현미경 관찰과 같은 단독 기술과 비교했을 때 이 절차의 주요 장점은, 그리드 유리 커버슬립을 사용하여 이 두 가지 기술을 결합하여 수행할 수 있다는 점입니다.

격자 무늬 커버슬립을 사용하면 연구자가 프로토콜의 서로 다른 단계에서 동일한 세포로 다시 돌아갈 수 있습니다. 또한, 이 기술을 통해 연구자는 다양한 주입 가능한 저분자 화합물이나 표적 단백질에 의해 유도되는 세포 내 구조적 변화를 마이크로미터에서 멀티 나노미터 해상도로 관찰할 수 있습니다. 미세주입을 준비하기 위해, 정상 쥐 신장 세포나 불멸화된 자궁경부암 세포와 같은 배양 세포를 라이브 셀 디쉬에 고정된 포토 에칭 유리 격자 커버슬립 위에 접종하고, 37 °C 및 5% CO2 조건에서 배양합니다.

사용할 실험 일정에 따라 세포의 합류도(confluency)를 조절하십시오. 플레이트의 세포가 완전히 합류되면 전자현미경으로 미세주입된 세포를 식별하기가 매우 어렵습니다. 따라서 짧은 실험의 경우 실험 당일에 약 50% 합류도에 도달하도록, 그리고 그 외의 경우에는 약 25% 합류도에 도달하도록 세포를 파종하십시오.

실험 시간이 긴 실험을 진행하는 날에, 형광 표지된 단백질, DNA 또는 저분자 화합물을 적절한 완충액에 넣어 최종 부피가 50 microliters가 되도록 준비하십시오. 선택한 형광체에 따라 Texas red 또는 cascade blue와 같은 추적 염료를 추가하십시오. 이때 0.5 to 1 mg/mL의 농도로 첨가하십시오.

용액을 0.22 micron 원심분리 필터로 여과합니다. 제조사의 지침에 따라 미세주입 바늘을 제작한 후, 바늘 뒷부분에 용액 수 µL를 조심스럽게 피펫으로 분주합니다. 도립 현미경에 장착된 상용 미세주입 장치의 마이크로 매니퓰레이터 암에 바늘을 장착합니다.

배양된 세포가 담긴 디시를 도립 현미경의 디시 홀더에 놓습니다. 포토 에칭 그리드 내에서 성장하고 있는 세포를 찾아 해당 그리드의 알파벳 및 숫자 식별자를 기록합니다. 이 식별자는 이후 모든 단계에서 사용됩니다.

미세주입을 위한 세포를 선택할 때는 커버슬립의 중심부에 가깝게 부착된 세포를 선택하고, 주변부에 있는 세포는 피하는 것이 중요합니다. 이는 나중에 전자현미경 관찰에 사용되는 에폰 수지(epon resin) 중심부로 표적 세포를 효율적으로 옮기기 위해 중요합니다. 주입 암(injection arm)을 커버슬립 위로 수동으로 내린 다음, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝이 세포 표면에 살짝 닿을 때까지 내립니다. 선택한 그리드 내에서 세포를 한 칸씩 건너뛰며 미세주입하십시오. 약 50%의 밀도(confluency)로 배양된 세포의 경우 600 square micrometer 그리드당 약 80개의 세포가 예상되며, 이를 통해 약 30~40개의 실험군 및 대조군 세포라는 N수를 확보할 수 있습니다.

주입 후, 형광 현미경 관찰을 위해 디쉬를 다시 인큐베이터에 넣고 원하는 시간 동안 배양합니다. 성장 배지를 제거하고, 상온에서 PBS에 희석된 formaldehyde로 10분 동안 세포를 고정합니다. 고정액을 XPBS로 교체합니다.

그런 다음, 선택한 그리드를 저배율 및 고배율에서 5~10장의 명시야 이미지로 촬영하여 세포의 배치를 기록합니다. 미세 주입된 세포를 식별하기 위해, 불활성 주입 염료의 들뜸 및 방출 파장에서 형광 이미지를 촬영합니다. 공초점 현미경을 사용하여, 이전에 촬영한 동일한 그리드 내에서 미세 주입된 세포의 고배율 이미지 Z-스택을 수집합니다.

전자현미경을 사용하여 식별할 세포 내 구조와 형광 이미지를 상관시키기 위해서는 고배율 확대가 필요합니다. 공초점 이미지 촬영 후, 커버슬립 제거액을 사용하여 디쉬에서 커버슬립을 분리하고, 세포가 위로 향하게 하여 1 XPBS가 들어 있는 새 배양 디쉬에 놓습니다. 이후 전자현미경 분석을 위한 처리 과정을 진행하십시오.

표준 EM 프로토콜을 따르십시오. 샘플을 고정, 염색 및 탈수하기 위해 epon resin을 준비하고, 커버슬립의 세포 면이 아래로 향하도록 epon resin이 채워진 튜브 위에 놓으십시오. 60 °C에서 24시간 동안 resin을 중합시키십시오.

에폰 수지(epon resin)에서 커버 슬립을 제거하려면, 이를 액체 질소에 빠르게 담급니다. 60 °C에서 -196 °C로 급격한 온도 충격을 줍니다.

레진 튜브에서 커버 슬립을 분리합니다. 5~10분 동안 기다린 후, 커버 슬립이 제거된 튜브를 회수합니다. 해부 현미경 하에서 레진 표면을 검사하여 원하는 그리드의 위치를 찾습니다.

멸균된 면도날이나 메스를 사용하여, 관심 있는 그리드만이 블록의 정점에 위치하도록 epon 블록을 다듬습니다. 울트라 마이크로톰을 사용하여 다듬어진 블록의 연속 절편을 제작하고, 표준 프로토콜에 따라 우라닐 아세테이트와 리드 시트레이트를 사용하여 절편을 염색합니다. 이전에 캡처한 고해상도 형광 이미지를 참고하여, 세포들의 상대적 위치를 가이드 삼아 전자 현미경에서 원하는 세포를 찾습니다.

전자 현미경 사진에서 형광 신호에 해당하는 관심 영역을 식별하십시오. 헤테로크로마틴의 위치와 핵막과 같은 랜드마크를 사용하여 어떤 형광 Zack 이미지가 EM 슬라이스와 일치하는지 결정하십시오. Image J 또는 Adobe Photoshop과 같은 이미징 프로그램을 사용하여 형광 이미지의 불투명도를 50%로 낮춘 다음, 이를 해당 TEM 이미지 위에 겹치십시오.

표시된 배율을 조정하여 이미지를 정렬하십시오. 다음은 미세주입 및 상관 광학-전자 현미경 분석 결과입니다. 이 이미지는 레이저로 식각된 유리 그리드 커버슬립에서 성장하는 NRK 세포의 명시야 현미경 사진을 보여줍니다.

주입된 세포가 포함된 그리드를 식별하는 데 사용된 배경 문자 b와 m를 확인하십시오. 화살표는 전자 현미경으로 식별 및 촬영한 두 개의 세포를 나타냅니다. 여기에는 미세 주입된 세포를 식별하는 데 사용된 불활성 추적 염료인 cascade blue의 형광 이미지가 표시되어 있습니다.

아민으로 라벨링된 저분자 화합물의 명시야 및 형광 신호를 중첩한 이미지입니다. 이 패널은 주입된 세포의 명시야, 형광 및 전자 현미경 이미지 간의 상관관계를 나타냅니다. 화살표는 이 패널에서 더 높은 배율로 촬영된 형광 점(puncta)을 가리킵니다.

이 영상을 시청한 후에는 미세주입법(microinjection)을 통해 관심 단백질을 주입하고, 미세주입 CLEM(correlative light and electron microscopy, 상관 광학 및 전자 현미경법) 절차를 사용하여 해당 단백질이 유도하는 세포 내 형태학적 변화를 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.