상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조
2018년 9월 7일
상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 메서드는 이전 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에 의해 선택 된 셀에 전자 현미경 (EM)를 통해 바이러스-유도 된 세포내 구조 이미지에 적용 됩니다. LM 및 EM 바이러스-호스트 상호 작용의 통합된 보기를 달성 하기 위해 하이브리드 이미징 접근으로 결합 됩니다.
이 방법은 세포막에 있는 생물 단백질이 어떻게 생물 복제 및 조립을 선호하는 환경을 조성하는지에 대한 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 여기에 결합된 두 가지 기술적 초석은 첫 번째는 라이브 셀 이미징과 전자 현미경 간의 상관 관계이고 두 번째는 고압 동결입니다. 이 방법은 바이러스 소스 상호 작용을 해결하기 위해 설계되고 성공적으로 활용되었지만 세포 생물학의 다양한 응용 분야로 쉽게 일반화할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 성공에 대한 실제 경험이 필요한 많은 단계, 특히 고압 동결에 의한 극저온 고정 및 후속 단계가 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 먼저 영숫자 패턴이 새겨진 패턴이 있는 사파이어 디스크를 15ml 원추형 원심분리 튜브에 넣고 디스크를 에탄올로 철저히 세척합니다. 세척된 사파이어 디스크를 건조를 위해 여과지가 깐 페트리 접시에 넣고 길고 얇은 핀셋을 사용하여 건조된 사파이어 디스크를 유리 슬라이드로 옮깁니다. 4배 배율에서 도립 현미경을 사용하여 모든 사파이어 디스크의 좌표 패턴을 읽을 수 있는지 확인합니다. 그런 다음 자외선 가교제로 5분 동안 디스크를 소독합니다. 생물 안전 캐비닛에서 세포 배양 배지의 절반을 세포 배양 접시에 넣고 긴 핀셋을 사용하여 사파이어 디스크를 조심스럽게 접시에 옮깁니다. 그런 다음 1x10 씨를 뿌립니다.
개요
본 논문은 바이러스로 인해 유도된 세포 내 구조를 시각화하기 위한 상관 광학 전자 현미경(CLEM) 방법을 제시합니다. 광학 현미경(LM)과 전자 현미경(EM)을 통합함으로써 연구자들은 바이러스와 숙주 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 현미경 기술
- 바이러스-숙주 상호작용
배경
- 이 방법은 살아있는 세포 이미징과 전자 현미경법을 결합한 것입니다.
- 고압 동결(High pressure freezing)은 이 기술의 핵심 요소입니다.
- 이 방법은 바이러스 상호작용 연구에 성공적으로 적용되었습니다.
- 이 방법은 세포 생물학의 다양한 응용 분야로 일반화하여 적용할 수 있습니다.
연구 목적
- 세포 내 바이러스 유도 구조를 시각화하기 위함입니다.
- 세포막 내 생체 단백질 상호작용에 대한 이해를 높이기 위함입니다.
- 본 방법을 사용하는 연구자들에게 실질적인 가이드를 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 이미징을 위한 패턴화된 사파이어 디스크 준비.
- 패턴 확인을 위한 도립 현미경 사용.
- 자외선 가교를 이용한 디스크 멸균.
- 사파이어 디스크에 세포를 파종하기 위한 세포 배양 기술.
주요 결과
- 바이러스로 인해 유도된 세포 내 구조의 성공적인 시각화.
- 바이러스-숙주 상호작용 연구에서 CLEM의 효과 입증.
- 해당 방법의 구현을 위해 설명된 실무 단계.
- 더 넓은 세포 생물학적 맥락에서의 잠재적 응용 가능성.
결론
- CLEM 방법은 바이러스 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
- 이 방법은 광학 현미경과 전자 현미경 사이의 간극을 메워줍니다.
- 세포 생물학 분야에서의 추가적인 응용이 권장됩니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
상관 광전자현미경(CLEM)은 드문 전이 세포 또는 감염 세포 집단을 표적 분석할 수 있게 함으로써 바이러스학 연구의 결정적인 병목 현상을 해결합니다. 형광 기반의 살아있는 세포 이미징과 고압 동결을 통한 고해상도 초미세구조 보존 기술을 결합함으로써, 이 방법은 바이러스-숙주 상호작용의 기전 연구에서 예측 신뢰도를 높여줍니다. 또한, 기능적 표현형과 세포 내 하부 구조를 연결하는 상관 데이터를 제공하여 초기 단계의 표적 검증 및 분석법 개발을 지원하며, 항바이러스제 발굴 파이프라인의 진행 여부 결정에 중요한 정보를 제공합니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 형광 표지된 바이러스 단백질 발현을 저온 고정된 세포의 초미세 구조 변화와 연결함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 광학 현미경을 통한 사전 스크리닝을 통해 효율이 낮은 형질전환 또는 감염 사건의 연구 효율성을 높입니다.
- 예측적 가치: 복제 복합체와 관련된 바이러스 유도 막 변형 및 조립 부위를 시각화함으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 바이러스 단백질의 국소화 및 구조적 섭동의 정량적 평가를 가능하게 하는 상관 관계 형광 및 전자 밀도 판독값을 생성합니다.
- 운영적 가치: 패턴화된 사파이어 디스크를 사용하여 시료 준비를 표준화함으로써, 실험 및 사용자 간의 재현 가능한 상관 관계 분석을 용이하게 합니다.
- 어세이 준비도: 스크리닝 캠페인의 후속 이미징 및 형태 분석에 적합하도록 초미세 구조가 보존된 시료를 제작합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 생세포 이미징부터 전자현미경 분석까지 구조적 충실도를 유지하여, 질병 관련 시스템에서 바이오마커와 일치하는 표현형 스크리닝을 지원합니다.
- 전임상 모델링: 거의 천연 상태에 가까운 조건에서 바이러스 유도 세포병성 효과의 상세한 특성 분석을 가능하게 하여, 중개적 외삽의 신뢰도를 높입니다.
- 리스크 조정 기반의 진전: 항바이러스 후보 물질의 작용 기전을 뒷받침하거나 반증할 수 있는 초미세 구조적 근거를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
CLEM은 초기 바이러스학의 가설 생성부터 리드 최적화의 기전 검증에 이르기까지의 발견 연속체 내에 적합하며, 특히 단백질 기능의 구조적 상관관계가 필요할 때 유용합니다.
- 발견 생물학: 정의된 세포 하위 집단에서 바이러스 단백질 관련 구조의 직접적인 시각화를 가능하게 하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 세포 국소화 및 초저온 보존을 통해 분석 신뢰도를 높여 구조적 판독 값의 변동성을 줄입니다.
- 분석: 형광 강도와 초미세 구조적 특징을 기반으로 조건 간 정량적 비교가 가능한 상관 관계 광학 및 전자 현미경 데이터 세트를 제공합니다.
- 중개 연구: 기능적 이미지와 고해상도 구조 데이터 간의 가교 역할을 하여 세포 기반 분석에서 기전 검증까지의 연속성을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 여러 표적과 바이러스 과(family)에 적용 가능한 바이러스-숙주 상호작용 연구를 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 바이러스 단백질의 위치 및 유도된 구조적 변화에 대한 직접적인 상관 관계 증거를 제공하여 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 패턴 기판의 표준화된 사용과 고압 동결을 통해 재현성을 향상시키며, 화학적 고정으로 인한 아티팩트를 최소화합니다.
- 전략적 가치: 초미세구조 수준에서 표적 결합을 검증함으로써 더 나은 go/no-go 결정을 내릴 수 있게 하며, 후기 단계의 실패 위험을 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 바이러스 복제 구획 또는 조립 부위에 확인된 효과를 바탕으로 항바이러스 후보 물질의 위험 조정 우선순위 설정이 가능해집니다.
구현 시 고려 사항
- 생세포 형광 이미징, 고압 동결, 동결 치환 및 투과 전자 현미경 분야의 전문 지식이 필요합니다.
- 고압 동결기, 울트라 마이크로톰 및 상관 광학-전자 현미경 이미징 시스템의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 팀 간의 기준 마커(예: 패턴화된 사파이어 디스크) 및 좌표 매핑 프로토콜의 표준화가 필수적입니다.
- 다른 세포 유형이나 바이러스 시스템에 적용할 경우, 형질전환 효율, 형광 표지 및 동결 파라미터의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 출처 자료에 명시된 바와 같이, 특수 장비 사용으로 인한 낮은 처리량과 상관 소프트웨어 정렬의 필요성이 실질적인 제한 사항입니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
