맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 사용한 Mycobacterial DNA 추출 후 NGS 워크플로우

우리의 진단 연구는 속도와 실용주의에 중점을 두고 제한된 자원 환경에서 결핵의 약물 내성 검출을 개선하는 데 중점을 둡니다. 결핵 진단에는 보다 포괄적인 유전자형 분석과 수많은 새로운 신속 표현형 분석이 있으며 이러한 검사를 진료 시점에 더 가깝게 만들기 위한 지속적인 노력이 있습니다. 그러나 여전히 존재하는 실용적인 장벽이 많이 있습니다.

시약에서 인프라, 물류에 이르기까지 자원 문제는 계속해서 중요한 장벽이 되고 있습니다. Cepheid Xpert 분석의 기술적 정교함을 넘어서는 모든 것은 다양한 환경에서 프로토콜 표준화가 어렵습니다. 따라서 여기 이 작업에서 자세히 설명한 MTB DNA 추출이 그 대표적인 예입니다.

염기서열 분석 기반 결핵 진단을 확장해야 할 필요성이 절실히 필요하지만 많은 실험실에는 여전히 고품질 DNA를 추출할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법이 부족합니다. 우리의 목표는 간단하고 실용적이며 자원이 부족한 현장 진료 환경에 적합한 방법을 공유하는 것입니다. 여기에서는 리소스가 제한된 환경에서 사용하도록 설계된 간단한 저비용 프로토콜을 제시합니다.

NGS 응용 분야에 대해 검증되었으며 자동 액체 처리 시스템과 호환됩니다. 시작하려면 염화나트륨 용액 Tris 염산염 완충액, Triton X 100 및 EDTA를 결합하여 Triton 완충액을 만듭니다. 저어주면서 혼합하고 초순수를 첨가하여 최종 부피 100밀리리터에 도달합니다.

사용하기 전에 필터 버퍼를 멸균하십시오. 다음으로, 1몰 Tris-HCl 1밀리리터와 0.5몰 EDTA 20마이크로리터를 결합하여 100밀리리터의 저-EDTA Tris-EDTA 완충액을 준비합니다. 초순수를 섞고 채워 최종 부피 100밀리리터에 도달합니다.

그런 다음 완충액을 필터로 멸균합니다. 용해 튜브를 준비하려면 메스 칼날을 사용하여 변곡점 바로 아래에 있는 1.5밀리리터 나사 캡 튜브의 바닥을 조심스럽게 잘라냅니다. P1000 피펫 팁에서 팁을 자르고 끝 부분에 V자형 쐐기를 만듭니다.

스크류 캡 튜브의 절단된 바닥을 V자형 피펫 팁에 끼워 스쿱을 만듭니다. 멸균 용기에 0.1mm 지르코니아 규산염 구슬을 채웁니다. 준비된 스쿱을 사용하여 약 200mg의 비드를 1.5밀리리터 스크류 캡 튜브에 옮깁니다.

박테리아 세포 배양의 준비를 위해 결핵균 배양액 5밀리리터를 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 최대 속도로 10분 동안 원심분리합니다. 이제 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 약 500마이크로리터를 제외한 모든 상청액을 조심스럽게 제거합니다.

P1000 피펫을 사용하여 남은 상층액을 제거합니다. 펠릿을 350마이크로리터의 맞춤형 트리톤 완충액에 재현탁한 다음 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 시료를 섭씨 95도에서 30분 동안 건열조에서 가열합니다.

가래를 준비하려면 1-5밀리리터의 가래 샘플을 멸균 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 디티오스레이톨 액화를 수행하려면 가래 샘플에 4부피의 10밀리몰 디티오스레이톨을 첨가한 다음 30초 동안 완전히 소용돌이치게 합니다. 샘플을 최대 속도로 10분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 500마이크로리터를 제외한 모든 상청액을 버립니다. 펠릿을 방해하지 않고 P1000 피펫으로 나머지 상층액을 제거합니다. 펠릿을 350마이크로리터의 맞춤형 트리톤 완충액에 재현탁합니다.

NALC 수산화나트륨 액화를 수행하려면 4부피의 NALC 수산화나트륨 용액을 객담 샘플에 추가합니다. 혼합물을 30초 동안 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 7분 동안 배양합니다.

이제 PBS를 최대 50밀리리터 표시까지 추가합니다. 튜브의 내용물을 소용돌이치게 하여 잘 섞은 다음 튜브를 최대 속도로 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 50밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 앞서 설명한 대로 상청액을 버립니다.

그런 다음 펠릿을 350마이크로리터의 맞춤형 트리톤 완충액에 재현탁합니다. 먼저, 350마이크로리터의 비활성화된 샘플을 250마이크로리터의 0.1밀리미터 지르코니아 규산염 비드가 들어 있는 라벨이 부착된 1.5밀리리터 스크류 캡 튜브로 옮깁니다. 비드는 사이클 사이에 2분의 휴식을 취하면서 45초 동안 초당 6.5미터의 속도로 용해물을 이겼습니다.

샘플을 최대 속도로 2분 동안 원심분리한 다음 150마이크로리터의 상청액을 표지된 새 튜브로 옮깁니다. 다음으로 실온에서 30분 동안 동일시된 마그네틱 비드를 와류로 청소하여 재현탁합니다. 180마이크로리터의 마그네틱 비드를 DNA 샘플로 옮깁니다.

위아래로 10번 피펫팅하여 혼합합니다. 실온에서 2분 동안 배양한 후 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 용액이 맑아질 때까지 2분 동안 기다립니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.

튜브를 마그네틱 랙에 놓은 상태에서 반대쪽 벽을 따라 갓 준비한 70% 에탄올 500마이크로리터를 넣고 30초 동안 기다립니다. 마지막 세척이 끝나면 10마이크로리터 피펫으로 잔여 에탄올을 제거하고 2분 동안 자연 건조시킵니다. 비드가 불투명해지면 마그네틱 선반에서 튜브를 제거합니다.

20마이크로리터의 낮은 EDTA Tris 완충액에 재현탁합니다. 실온에서 5분 동안 배양하기 전에 모든 비드가 용액에 있는지 확인하기 위해 피펫팅 또는 와류를 통해 혼합합니다. 그런 다음 튜브가 투명해질 때까지 2분 동안 마그네틱 랙에 놓습니다.

그런 다음 20마이크로리터 미만의 용출된 DNA를 새로운 표지 튜브로 옮겨 비드 캐리오버를 방지합니다. 마이코박테리아 atpE의 99개 뉴클레오티드를 표적으로 하는 정량적 PCR을 사용하여 마이코박테리아 DNA를 정량화하려면 얼음 위에 QPCR 마스터 믹스를 조립합니다. 피펫팅 손실을 고려하기 위해 10% 초과를 포함하여 샘플 및 표준의 양에 따라 마스터 믹스를 조정합니다.

섭씨 95도에서 60초 동안 열 순환기를 실행한 다음 섭씨 95도에서 10초 동안 35회, 섭씨 60도에서 초당 2.11도의 램프 속도로 30초 동안 30회 실행합니다. 모든 샘플, 표준물질 및 대조군을 세 번으로 실행합니다. 여기에서 결핵균 배양은 모든 테스트 조건 중에서 가장 높은 DNA 농도를 산출했습니다.

스파이크 가래 샘플은 점진적으로 낮은 DNA 수율을 보였고, 특히 10, 000 박테리아 그룹에서 박테리아 투입 감소에 따라 변이가 증가했습니다.