Name: 맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 사용한 Mycobacterial DNA 추출 후 NGS 워크플로우 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 배우세요 Mycobacterium tuberculosis에서 비드 박동과 DNA 캡처 비드를 활용한 신속 DNA 추출 방법을. 이 프로토콜은 차세대 서열분석에 적합하며 자원이 제한된 환경에서도 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 기관 생물안전성 위원회(BUA #BU198320-01GBUA/BABB)의 승인(BUA -01GBUA/BABB)에 따라 캘리포니아 샌프란시스코 대학교(UCSF)에서 수행되었으며 UCSF 연구 윤리 지침을 따릅니다. 우리는 IRB가 승인한 동의 포기 프로토콜에 따라 디스커버리 라이프 사이언스(Discovery Life Sciences)가 비결핵 호흡기 질환을 앓고 있는 개인으로부터 수집한 잔류 가래 샘플을 입수했습니다.
1. 완충액의 준비
<ol>
	<li>맞춤형 트리톤 완충액 100mL를 준비하려면 먼저 5M NaCl 2mL, 1M Tris-HCl(pH 8) 1mL, Triton X-100 1mL 및 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 0.2mL를 결합합니다. 초순수를 추가하여 총 부피를 100mL로 만듭니다. 필터는 사용하기 전에 살균하십시오. 최종 버퍼에는 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA 및 1% Triton X-100이 포함됩니다.</li>
	<li>낮은 EDTA TE (표 2) : 100mL의 낮은 EDTA TE 버퍼를 준비하려면 1M Tris-HCl (pH 8) 1ml와 0.02M EDTA 0.5mL를 결합하십시오. 초순수를 추가하여 총 부피를 100mL로 만듭니다. 최종 버퍼에는 10mM Tris-HCl 및 0.1mM EDTA가 포함됩니다.</li>
</ol>
2. 용해 튜브의 준비
<ol>
	<li>메스 칼날을 사용하여 변곡점 바로 아래에 있는 1.5mL 나사 캡 튜브의 바닥을 조심스럽게 잘라냅니다.</li>
	<li>P1000 팁에서 팁을 자르고 끝 부분에 V자형 쐐기를 자른 다음 준비된 나사 캡 튜브의 바닥을 쐐기로 고정합니다. 스쿱의 다이어그램은 그림 1 을 참조하십시오.</li>
	<li>멸균 용기(예: 저장통 또는 페트리 접시)에 0.1mm 지르코니아-실리케이트 비드를 채우고 준비된 스쿱을 사용하여 1스쿱의 비드(~200mg)를 1.5mL 스크류 캡 튜브에 분배합니다.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
그림 1: 사내 비드 분배 스쿠프. 스쿱은 ~200mg의 0.1mm 지르코늄 비드를 가공 튜브로 쉽게 옮길 수 있도록 설계되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 입력 준비
참고: 모든 샘플 준비는 시설의 생물 안전성 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다. 에어로졸 노출 위험을 최소화하기 위해 Class II Biosafety Cabinet(BSC) 내부에서 감염 물질을 취급할 것을 강력히 권장합니다.
<ol>
	<li>박테리아 세포 배양<ol>
		<li>15mL 원추형 원심분리 튜브에서 10분 동안 최대 속도(≥ 3,000 x g)로 5mL의 M. 결핵 배양(MGIT 또는 탁도 액체 배양) ~ 5mL.</li>
		<li>10 mL 혈청 학적 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상등액의 ~ 500 μL를 제외한 모든 것을 조심스럽게 제거하십시오. 펠릿을 방해하지 않고 P1000 피펫으로 남아 있는 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>위아래로 피펫팅하여 350 μL의 맞춤형 Triton 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다. 필요한 경우(즉, BSL-3 외부에서 처리하기 위해 샘플을 제거하려는 경우) 표준 작업 절차에 따라 샘플을 비활성화합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>가래 제제<ol>
		<li>1-5mL의 가래 샘플(자연 또는 유도)을 멸균 50mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DTT 액화<ol>
		<li>가래 샘플에 100mM dithiothreitol 4 부피를 추가합니다 (용량은 다를 수 있음). 상업용 시약을 사용하는 경우 제조업체의 희석 지침을 따르십시오.</li>
		<li>30초 동안 완전히 소용돌이칩니다. 실온(20-25°C)에서 7분 동안 배양합니다. 다시 30초 동안 소용돌이칩니다.</li>
		<li>3.3.1단계를 반복합니다. 및 3.3.2. 1x, 점성이 매우 높은 샘플의 경우 최대 5회의 배양 와류 주기를 수행합니다.</li>
		<li>최대 속도(≥ 3,000 x g)에서 10분 동안 원심분리기. 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 상등액 ~ 500μL를 제외한 모든 것을 조심스럽게 폐기합니다. 펠릿을 방해하지 않고 P1000 피펫으로 남아 있는 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>펠릿을 350μL의 맞춤형 Triton 버퍼에 재현탁합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NALC-NaOH 액화<ol>
		<li>NALC-NaOH 용액을 준비하려면 준비 및 희석에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.</li>
		<li>객담 샘플에 4가지 부피의 NALC-NaOH 용액을 추가합니다(자연 또는 유도, 부피는 다를 수 있음).</li>
		<li>30초 동안 소용돌이. 실온(20-25°C)에서 7분 동안 배양합니다. 3.4.1 및 3.4.2단계를 반복합니다. 1배. 점성이 매우 높은 샘플의 경우 최대 5회의 배양 와류 주기를 수행합니다.</li>
		<li>50mL 표시에 PBS를 추가합니다. 소용돌이를 간단히 섞습니다. 최대 속도(≥ 3,000 x g)에서 10분 동안 원심분리기.</li>
		<li>50mL 혈청학 피펫을 사용하여 상등액 ~ 500μL를 제외한 모든 것을 조심스럽게 폐기합니다. 펠릿을 방해하지 않고 P1000 피펫으로 남아 있는 상층액을 제거합니다.</li>
		<li>펠릿을 350μL의 맞춤형 Triton 버퍼에 재현탁합니다. 필요한 경우(즉, BSL-3 외부에서 처리하기 위해 샘플을 제거하려는 경우) 표준 작업 절차에 따라 샘플을 비활성화합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. DNA 추출
<ol>
	<li>비활성화된 박테리아 현탁액(350 μL, 3단계)을 ~250 μL의 0.1 mm 지르코니아-실리케이트 비드가 들어 있는 잘 라벨링된 새로운 1.5 mL 스크류 캡 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>비드는 6.5m/s에서 45초 동안 용해물을 박동하고 실행 사이에 2분 휴식을 취합니다. 총 세 번의 구슬 치기 주기를 반복합니다.</li>
	<li>최대 속도(≥ 12,000 x g)에서 2분 동안 원심분리기를 진행하고 150μL의 상층액을 잘 라벨링된 새 튜브로 이송합니다. 비드나 세포 파편이 옮겨지지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>세척 마그네틱 비드가 30분 동안 실온과 평형을 이루도록 하고 사용하기 전에 완전히 재부유할 수 있도록 완전히 소용돌이치게 합니다.</li>
	<li>180 μL(1.2배 용량)의 클린업 마그네틱 비드를 추가하고 10배 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다.</li>
	<li>마그네틱 랙에 놓고 용액이 깨끗해질 때까지 ~ 2분 동안 기다립니다. P200 피펫을 사용하여 자성 비드를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 폐기합니다.</li>
	<li>튜브를 마그네틱 랙에 올려 놓은 상태에서 새로 준비한 70%(v/v) 에탄올 500μL를 추가하고 반대쪽 튜브 벽을 따라 마그네틱 비드에 분배합니다. 30초 동안 기다립니다.</li>
	<li>4.5단계를 반복합니다. - 4.7. 총 두 번의 세탁을 위해. 마지막 세척이 끝나면 P10 피펫으로 잔류 에탄올을 제거합니다. 구슬을 ~ 2 분 동안 짧게 말리십시오.</li>
	<li>비드 펠릿이 불투명해진 직후, 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 20 μL의 Low EDTA Tris Buffer에 재현탁합니다. 구슬이 건조하거나 갈라지지 않도록 하십시오.</li>
	<li>피펫팅 또는 볼텍싱으로 혼합하여 모든 비드가 용액에 있는지 확인합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>마그네틱 랙에 놓고 용액이 명확해질 때까지 ~ 2분 동안 기다립니다. 다운스트림 분석을 위해 용리된 DNA를 잘 라벨링된 새 튜브로 옮깁니다. 추출된 DNA의 &lt;20 μL를 흡입하여 마그네틱 비드 캐리오버를 방지합니다.</li>
</ol>
5. 마이코박테리아 DNA의 qPCR 계수
<ol>
	<li>마이코박테리아 atpE (Rv1305)의 뉴클레오티드 99개를 표적으로 하는 정량적 PCR을 사용하여 마이코박테리아 DNA를 정량화하려면 범용 프로브 마스터 믹스(2x) 5μL, 전방 프라이머(5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10μM) 각각 0.4μL, 역방향 프라이머(5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10μM), 0.2μL의 TaqMan 프로브(5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL의 DNA 템플릿 및 2 μL의 뉴클레아제가 없는 물(표 3).</li>
	<li>다음과 같은 열 순환 조건을 사용하여 반응을 실행합니다: 95°C에서 60초 동안 초기 변성, 10초 동안 95°C, 30초 동안 60°C의 35회 사이클(여기에서 캡처, 2.11°C/s의 램프 속도 사용; 표 4). 참고: 이 경우, qPCR은 QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템에서 VIC 표지 프로브가 있는 TaqMan 어세이를 사용하여 수행되었습니다.</li>
	<li>모든 샘플, 표준물질 및 대조군을 기술적 삼중으로 실행합니다. 정제된 M. tuberculosis DNA의 연속 희석을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 상대 정량화 분석을 수행합니다.</li>
	<li>결과 상대 정량화 값을 CSV 형식으로 내보내고 R Studio(버전 2024.09.1+394)를 사용하여 시각화하여 추출 방법 간에 DNA 수율을 비교하는 상자 플롯을 생성합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
<li>Noordhoek, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+Specificity+of+PCR+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis%3A+A+Blind+Comparison+Study+among+Seven+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories.</a> J Clin Microbiol. 32, (1994).</li>
<li>Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+DNA+extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).</li>
<li>Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+preparation+of+DNA+from+pathogenic+and+environmental+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).</li>
<li>De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Different+DNA+Extraction+Methods+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis+by+Means+of+PCR-IS6110%3A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study.</a> BMC Res Notes. 6, 561(2013).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+by+real-time+PCR+and+its+clinical+application+in+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis.</a> J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).</li>
<li>Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly-Cirino%2C+C+%22Maximizing+Mycobacterium+Tuberculosis+DNA+Yield+for+Molecular+Methods+with+PrepIT.MAX%22">Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX</a>. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
<li>Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Bead+Beater+for+Preparation+of+Mycobacterium+Paratuberculosis+Template+DNA+in+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk.</a> Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).</li>
<li>Oh, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Method+of+RNA+Extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).</li>
<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+quality+of+dna+extracted+by+two+techniques+from+mycobacterium+tuberculosis+for+fast+molecular+identification+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping.</a> Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1mm 지르코니아-규산염 비드</td><td>바이오스펙 제품</td><td>11079101z</td><td>마이코박테리아 세포를 용해하기 위한 비드 박동 단계에 사용되는 비드</td></tr><tr><td>AMPure XP 비드</td><td>베크만 쿨터</td><td>A63880</td><td>분해 후 DNA 세척을 위한 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>EDTA(0.5M, pH 8.0)&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>AM9260G</td><td>맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소</td></tr><tr><td>패스트프렙 24</td><td>MPbio, 미국</td><td>116004500</td><td>6.5m/s의 비드 박동 장비</td></tr><tr><td>포워드 프라이머</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>사용자 지정 합성</td><td>프라이머 서열: AATTCCTGGTTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O(물, 분자 생물학 등급)</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>BP2819-1</td><td>맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소</td></tr><tr><td>루나 유니버설 프로브</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M3004</td><td>마이코박테리아 DNA 계수를 위한 qPCR 시약</td></tr><tr><td>MycoPrep 키트</td><td>BD</td><td>SKU/REF 240863</td><td>NALC-NaOH 객담 처리를 위한 BD MycoPrep 검체 분해</td></tr><tr><td>NaCl(염화나트륨, 5M 용액)</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>AM9759</td><td>맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소</td></tr><tr><td>PBS</td><td>밀리포어 시그마</td><td>P2272</td><td>가래 처리</td></tr><tr><td>리버스 프라이머</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>사용자 지정 합성</td><td>프라이머 서열: GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>TaqMan 프로브</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>사용자 지정 합성</td><td>프로브 시퀀스: AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>트리스-HCl (1M, pH 8.0)</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>AM9855G</td><td>맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>28314</td><td>맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소</td></tr></tbody></table>

맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 사용한 mycobacterial dna 추출 후 ngs 워크플로우

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

배양된 M. tuberculosis 와 M. tuberculosis 스파이크 가래 샘플(각 조건에 대해 n = 3) 모두에서 DNA 추출 프로토콜을 테스트했습니다. 배양된 M. tuberculosis H37Rv mc² 7901을 사용하여 입력을 50μL당 8.4 x 106 세포로 표준화했으며, 이는 200GU에서 MGIT 배양 1mL에 해당합니다. 객담 실험을 위해 결핵이 아닌 호흡기 질환이 있는 개인(상업적으로 입수한)의 가래 풀링 1mL를 두 가지 다른 박테리아 농도(50,000, 대략 1+ 가래 도말 등급 및 10,000 간균, 대략 부족한 가래 도말 등급)로 스파이크하여 다양한 박테리아 부하에 걸쳐 방법의 성능을 평가했습니다.
단일 복제 유전자를 표적으로 하는 맞춤형 TaqMan qPCR을 사용하여 DNA 수율을 평가했습니다(그림 2). 순수 배양 및 ...

맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 사용한 Mycobacterial DNA 추출 후 NGS 워크플로우

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

mycobacterial-dna-extraction-using-bead-beating-custom-buffer

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

2 가지 plant organellar DNA 농축 방법의 비교 및 ​​최적화가 제시됩니다 : 전통적인 차동 원심 분리 및 메틸화 상태에 기초한 총 gDNA 분획. 우리는 결과로 나오는 DNA 양과 품질을 평가하고, 짧은 읽기 차세대 시퀀싱에서의 성능을 시연하며, 장시간 읽기 단일 분자 시퀀싱에서의 사용 가능성에 대해 논의합니다.

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Nanopore 시퀀싱 생체에 대 한 기술, 생명 과학, 병원 균, 식품 안전 모니터링, 게놈 분석, metagenomic 환경 모니터링 및 박테리아의 특성의 식별을 포함 하 여 넓은 응용 프로그램에 항 생 저항입니다. 이 문서에서는, metagenomic 토양 DNA 연속 nanopore 시퀀싱 기술을 사용 하 여 종 식별을 위한 절차는 보여 줍니다.

Metagenomic 토양 분석 Nanopore DNA 시퀀싱

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

긴 읽기 시퀀스는 크게 복잡 한 유전자 및 구조 변화의 특성의 어셈블리를 촉진 한다. 연속 nanopore 기반 플랫폼으로 매우 긴 시퀀스를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 접근은 최적화 된 DNA 추출이 수정된 라이브러리 준비 인간 세포에서 kilobase 읽기 적당 한 보도 수백을 생성 하 여 다음을 채택 한다.

전체 게놈 DNA 분석을 위한 매우 긴 읽기 시퀀싱

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations

Mycobacterium tuberculosis의 다운스트림 표적 차세대 염기서열분석을 위해 마그네틱 비드 정제와 결합된 매트릭스 기반 추출 방법을 사용하여 오염이 제거된 객담에서 DNA를 추출하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

오염이 제거된 객담 샘플에 대한 표적 차세대 염기서열분석을 위한 매트릭스 기반 DNA 추출

이 프로토콜은 단단하고 마이콜산이 풍부한 세포벽이 제기하는 도전을 극복하여 마이코박테리아로부터 고품질 DNA를 추출하는 CTAB 방법을 설명합니다. 이 과정은 효소 소화, CTAB를 이용한 세포 용해, 유기 추출과 에탄올 침전을 통한 DNA 정제를 포함합니다. 이 방법은 분자 연구에 적합한 DNA를 생성하며, 균세균 연구에 신뢰할 수 있습니다.

세틸트리메틸암모늄 브로마이드 기법을 이용한 마이코박테리아 종에서 전체 게놈 디옥시리보핵산 추출

여기에서는 표적 농축을 사용하여 임상 샘플에서 박테리아 성병 감염의 전체 게놈 시퀀싱을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 이 새로운 증후군 패널 기반 방법은 풍부한 인간 DNA와 낮은 박테리아 부하의 문제를 극복하여 클라미디아 트라코마티스, 임질균, 팔리듐 트레포네마 및 마이코플라스마 제니탈리움에 대한 게놈 감시를 용이하게 합니다.

표적 농축 워크플로우를 사용하여 임상 샘플에서 전체 박테리아 게놈 생성

본 연구는 염색체 서열이 이미 알려져 있거나 관심 없는 플라스미드의 나노포어 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다. 초기 플라스미드 DNA 풍부화 단계는 최적의 플라스미드 서열 깊이를 보장하고 플로우 셀당 시퀀싱 가능한 샘플 수를 극대화합니다.

나노포어 시퀀싱 기반 워크플로우를 이용한 롱리드 플라스미드 시퀀싱 및 조립

배우세요 Mycobacterium tuberculosis에서 비드 박동과 DNA 캡처 비드를 활용한 신속 DNA 추출 방법을. 이 프로토콜은 차세대 서열분석에 적합하며 자원이 제한된 환경에서도 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 사용한 Mycobacterial DNA 추출 후 NGS 워크플로우

더 많은 동영상 탐색