질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

다음 실험의 전반적인 목표는 생물학적 샘플에서 산화질소 대사 산물을 정확하고 구체적으로 검출하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 대사 산물의 손실이나 인공물의 형성을 방지하기 위해 채취 직후 혈액 샘플을 먼저 처리함으로써 달성됩니다. 동시에, 저산소 환경이 산화질소 대사 산물에 미치는 영향을 최소화하기 위해 빠르고 효율적인 조직 수확이 수행됩니다.

대동맥 고리는 내피 기능을 평가하기 위해 채취하여 장기 욕조에 매달아 놓습니다. 또한, 생화학적 분석법은 질산염 수준, 아질산염 수준, 조직 내 니트로 티올 및 기타 니트로 공급 산물의 상대적 수준을 정량화하는 데 사용됩니다. 이러한 분석을 사용하여 실험 동물과 대조 동물을 적절하게 비교하면 산화질소 생성 및 대사에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다.

단일 방법 또는 분석에 비해 이 다중 시스템 접근 방식을 사용하는 주요 이점은 여러 장기 시스템에서 산화질소 생화학에 대한 더 넓은 그림을 그릴 수 있다는 것입니다. 따라서 우리는 이러한 대사 산물 중 어떤 것이 예후 또는 진단적 유용성을 가질 수 있는지, 그리고 산화 질소 대사 산물의 레퍼토리가 어떻게 내피 산화 질소 형성 및 가용성을 반영하는지 이해하기 시작할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 프로세스의 각 단계가 샘플의 무결성을 유지하는 데 중요하기 때문에 매우 중요합니다.

이러한 단계 중 일부는 샘플 수집 및 조직 추출의 세부 사항 때문에 일반적인 저널의 판독 방법 섹션에서 명확하지 않습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Dr.Hong Jing입니다. 내 연구실의 선임 연구원이 이 프로토콜을 위해 혈액 채취를 위해 사람이나 실험 동물을 사용할 수 있도록 실험 동물의 조직도 검사할 수 있습니다.

먼저 하대정맥에 25게이지 바늘을 삽입하여 전혈을 채취합니다. 500-1000 마이크로리터를 채취한 후 좌심실의 정점을 통해 생리학적 완충액을 주입하여 동물에 남아 있는 혈액을 제거하도록 관류하고 혈액과 완충액이 하부 대뇌실을 통해 빠져나갈 때 완전한 혈액 교체를 허용합니다. 정맥혈은 채혈 직후 NEM과 EDTA가 들어 있는 1.5ml 원심분리기 튜브에 채취해야 합니다.

원심분리 후 7분 동안 14, 300 RCF에서 혈액을 회전시킵니다. 피펫으로 RBC 펠릿의 혈장을 흡인하고 별도의 튜브로 옮깁니다. 먼저 50 microlit의 혈장 채취에 1:1 부피의 차가운 메탄올을 첨가하여 HPLC를 위해 분리된 혈장 샘플을 준비합니다.

Vortex, 혼합물이 흐려질 때까지 3-5초 동안 격렬하게 혼합물을 사용합니다. 그런 다음 14, 300 RCF에서 7분 동안 혼합물을 원심분리합니다. 혈장 단백질을 침전시키려면 슈퍼네이트를 별도의 1.5ml 튜브에 모아 분석할 수 있을 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다.

화학발광 분석을 위해 플라즈마를 준비하려면 약 200-400마이크로리터인 나머지 플라즈마 부피를 두 부피로 나눕니다. 10% 부피의 5% 산성화된 황화물을 첨가하고 10분 동안 대기하여 플라즈마의 절반을 준비합니다. 이 샘플은 이제 CLD 분석을 위한 준비가 되었습니다.

5분 후에 10%부피의 2%염화수은을 첨가하여 플라즈마의 다른 절반을 준비합니다. 실온에서 10% 부피의 산성화된 설폰아미드를 첨가합니다. 10분 더 기다렸다가 이 샘플을 혈장과 같이 CLD에 주입합니다.

RBC 펠릿은 두 분석 중 하나를 위해 HPLC 및 CLD에 대해 준비할 수 있습니다. 세포 펠릿 1부와 저장성 용해 용액 4부를 혼합하여 시작합니다. CLD 분석을 위해 혼합물을 철저히 와류로 가열합니다.

세포에 대한 준비는 플라즈마에 대해 수행되는 것과 동일합니다. 동일한 부피의 메탄올을 추가하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 혼합물을 3-5초 동안 격렬하게 소용돌이친 다음 14, 300 RCF에서 7분 동안 회전시킵니다.

이제 상층액을 피펫으로 분리하고 HPLC로 분석하여 산화질소 대사 산물의 조직 수준을 결정할 수 있을 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 실험 동물의 관심 조직에서는 이전 섹션에서 설명한 대로 먼저 혈액을 수확하고 준비해야 하며, 조직이 저산소가 되지 않도록 속도와 효율성에 특별한 주의를 기울여 평소와 같이 조직의 채취를 수행해야 합니다. 일단 수집되면 조직 샘플을 PBS를 포함하는 N-E-M-E-D-T-A의 1 대 5 비율로 균질화했습니다.

그런 다음 적혈구에 대한 이전 섹션에서 설명한 대로 HPLC 및 CLD 분석을 위해 균질화된 조직을 준비합니다. 다틸 에테르로 성체 마우스를 마취하고 발가락 꼬집음에 반응하지 않는 것을 확인한 후 개흉술을 시행합니다. 흉골에서 치골 부위까지 정중선 절개를 하여 흉강과 복강을 노출시킵니다.

다음으로, 산소가 공급된 크렙스 알라이트 완충액으로 동물을 관류합니다. 25게이지 주사기를 사용하여 좌심실 정점에 완충액을 주입합니다. 오른쪽 심방이 열려 혈액이 배출되는 출구를 제공합니다.

관류 후에는 대동맥을 덮을 수 있는 간, 폐 및 기타 조직을 잘라내고 제거하여 복부 대동맥을 분리합니다. 다음으로, 한 쌍의 집게로 심장을 잡고 부드럽게 동물의 후벽에서 대동맥을 잘라냅니다. 얼음을 채운 페트리 접시에 심장과 대동맥을 넣습니다.

접시에 차가운 크렙스 버퍼. 대동맥에서 지방과 외막을 조심스럽게 잘라내고 청소하십시오. 청소하는 동안 혈관 내부의 내피가 손상되지 않도록 하십시오.

저산소증을 예방하기 위해 5분마다 대동맥을 신선한 얼음처럼 차가운 산소가 함유된 완충액으로 옮겨 대동맥 대사를 천천히 유지하십시오. 이제 메스를 사용하여 대동맥을 3mm 길이의 고리 모양 부분으로 자릅니다. 분절을 산소가 공급된 Krebs 완충액이 로드된 4채널 10ml 조직 장기 수조로 옮깁니다.

변환기 손잡이를 사용하여 각 대동맥 고리에 1.5g의 프리텐션을 적용합니다. 경험적 발견에 따르면. 1.5g은 최적의 혈관 운동 기능을 위한 적절한 시작 장력입니다.

마우스 모니터에서 8채널 옥탈 브리지와 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 힘 측정을 기록하고 링이 80분 동안 평형을 이루도록 하고 20분마다 버퍼를 교체한 다음 실험을 진행합니다. 조직 장력이 평형을 이룬 후 최대 이하 수축을 위해 각 고리에 100나노몰 회향 린을 추가합니다. 고리 장력이 안정되고 톤이 일정한 수준으로 유지되면 아세틸콜린과 같은 내피 작용제에 대한 용량 반응 분석을 수행합니다.

이것은 산화질소 생성과 혈관 이완 정도를 결정합니다. 아세틸콜린에 대한 용량 반응 후, 크렙스 완충액으로 수조를 헹구고 각 장기 수조에 100나노몰 회향 린을 첨가하여 혈관을 수축시킵니다. 다시, 그런 다음 용해성 guile cyclase의 억제제인 ODQ가 있거나 없는 nitropress side와 같은 산화질소의 외인성 공급원에 대한 평활근 고리의 반응성을 결정합니다.

이러한 유형의 접근 방식은 혈관에 대한 100% 이완 값을 결정하고 혈관 이완에 대한 산화질소 반응을 매개하는 데 용해성 guile cyclase의 본질적인 특성을 보여줍니다. ODQ는 아세틸콜린에 대한 반응으로 니트로나트륨 IDE로의 이완을 방지하기 때문에 건강한 대조군의 대동맥 고리, 내피 기능 장애가 있는 마우스의 대동맥 고리는 이완된 반면 내피 기능 장애가 있는 마우스의 대동맥 고리는 산화질소 생성 감소로 인해 이완이 감소한 것으로 나타났습니다. Group Specific de nitro sation assay는 또한 아질산염의 화학발광을 대조 동물에 대해 수행되었습니다.

RSNO 및 RNNO는 환원성 de nitros assay를 사용하여 검출되었습니다. 피크 면적을 빼서 아질산염 및 r sno 수준을 측정했습니다. 이 방법은 이러한 산화질소 대사 산물의 순환 수준이 조직 수준을 어떻게 반영하는지, 그리고 다양한 질병 조건에서 질병 대사 산물이 어떻게 변화하는지와 같은 산화질소 및 혈관 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여러 장기 시스템 및 단일 동물의 순환 전반에 걸쳐 이러한 관련 산화질소 대사 산물의 정상 상태 농도 및 반감기를 측정하면 질병 과정의 특정 분자 서명을 식별할 수 있고 임상의가 질병의 중증도 또는 진행에 대한 더 나은 바이오마커로 무장할 수 있도록 하는 새로운 산화질소 기반 치료 방식을 정의하는 데 도움이 됩니다. 일반적으로 질산 분야를 처음 접하는 개인은 생물학적 샘플에서 발견되는 이러한 낮은 수준의 tric acid 대사를 감지하고 정량화할 수 있을 만큼 충분히 민감하게 최소화하기 때문에 많은 사람들이 어려움을 겪을 것입니다. 우선, 예술에 대한 기술이 없는 사람은 샘플 처리 중에 데이터를 잘못하고 데이터를 잘못 해석해야 하는 아티팩트를 생성할 가능성이 높습니다.