현지화 된 조직 병리학 적 분석을 위해 망막 보철물 이식 처리 눈을위한 기법

이 실험 절차의 전반적인 목표는 망막 보철물의 안전성 평가를 개선하는 것입니다. 이는 먼저 최적의 상태로 고정된 적출안의 표면을 조직 염색약으로 염색하여 삽입된 전극의 위치를 표시함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 전극 어레이를 제거하고 안구 조직을 스트립 형태로 절개합니다.

다음으로, 스트립을 한천(agar)에서 안정화한 후 파라핀에 매립합니다. 마지막 단계에서 표시된 관심 영역을 절편화하여 염색을 위해 슬라이드에 수집합니다. 최종적으로, 각 전극에 인접한 이식 부위의 건강 상태를 명시야 및 면역형광 현미경으로 평가할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 고정 관련 아티팩트와 박리를 최소화하면서, 대형 샘플 내 전극 인접 조직 영역을 정확하게 추적할 수 있다는 점입니다. 또한, 다른 안과 질환을 위한 새로운 임플란트의 안전성을 평가하는 데에도 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 망막이 박리되기 쉽고 샘플 취급 시 높은 수준의 숙련도가 요구되기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

취약한 조직을 마킹하고 다루는 법을 익히기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 본 연구 이전에, 초맥락막 전극 어레이를 이식한 후 별표로 표시된 것과 같이 최적화되지 않은 기술을 사용하여 안구를 처리하였습니다. 이 첫 번째 이미지는 전극 어레이 공동을 통과하는 대표적인 직교 단면을 보여줍니다.

망막이 안구 외측 조직으로부터 박리되었음에 유의하십시오. 이는 화살표로 표시된 것처럼 이식된 영역 아래에서 특히 두드러지게 나타납니다. 또한, 망막의 어느 부분이 어레이의 각 개별 전극에 인접했는지는 판단할 수 없다는 점에 유의하십시오.

더 높은 배율에서 보면, 화살표로 표시된 것처럼 망막층에 몇몇 규칙적인 방출 기반 아티팩트가 있으며, 고양이 눈의 반사층인 토페도층(torpedo layer)에서 심한 박리가 관찰됩니다. 더욱 확대하면 광수용체의 외절과 색소 상피는 온전하게 유지되고 있음을 확인할 수 있으며, 이는 이전에 관찰된 박리가 생체 내 외상이나 병리적 결과가 아니라 전처리 과정에서 발생한 아티팩트성 부작용임을 시사합니다. 따라서 이러한 고정 관련 아티팩트와 층분리를 최소화하기 위해 다음과 같은 기술이 적용되었습니다.

핵 형성 및 고정 후, 에탄올에서 이식된 안구를 꺼내어 결막과 건낭을 포함한 과잉 조직을 조심스럽게 제거합니다. 시신경을 2~3 mm 길이로 다듬습니다. 전극 어레이는 반투명한 공막을 통해 확인할 수 있습니다.

그 후 세밀한 붓을 사용하여 조직에 조직학적 염색약을 조심스럽게 도포하여, 미리 정의된 색상 코드로 전극을 표시합니다. 이때 염색약이 번지지 않도록 주의하십시오. 관심 지점을 정의하거나 절편의 정렬을 돕기 위해 추가적인 염색 표시를 할 수 있습니다.

여기서 최대 자극을 준 전극은 녹색으로 표시되었습니다. 그 외의 활성 전극은 적색으로 표시되었습니다. 직경이 더 큰 귀환 전극은 황색으로 색칠되었으며, 추가적인 가이드나 해부학적 표식은 청색 염료로 표시되었습니다.

5분 동안 공기 건조시킨 후, 안구를 다시 70% ethanol에 넣어 염료를 탈수시킵니다. 그런 다음 방금 시연한 것과 같이 대조군 안구에서 과도한 조직을 다듬고, 핵 제거 및 고정 단계에서 부착한 8개의 나일론 봉합사를 사용하여 대조군 안구와 이식 안구가 거울상 쌍으로 정렬되도록 맞춥니다. 이어서 전극 어레이와 동일한 크기의 실리콘 템플릿을 이식 안구의 어레이 위치에 대응하는 대조군 안구의 대칭 위치에 배치합니다.

그런 다음, 각 이식 전극 부위가 해부학적으로 비교 가능한 위치에 대조군 쌍을 가질 수 있도록 방금 시연한 방식대로 대조군 안구를 라벨링합니다. 다음으로, 안구에서 임플란트 어레이를 제거한 후 각막, 홍채, 수정체를 포함한 안구 전면부를 제거합니다. 이어서, 남아 있는 안구 컵에서 유리체를 제거합니다.

이제 이식된 안구를 2mm 두께의 여러 조각으로 절개합니다. 각 조각에는 다이(die)로 표시된 영역의 일부가 포함되어야 합니다. 조각의 방향은 임플란트에 대한 조직 반응의 다양한 측면을 평가하는 데 도움이 되도록 선택해야 하며, 향후 참조를 위해 샘플 내 다이 표시의 위치를 세심하게 기록하십시오.

다음으로, 먼저 절단할 면이 아래로 향하도록 하여 액상 한천(agar)의 얕은 웅덩이에 스트립을 놓습니다. 한천이 굳으면 샘플 주변을 절단하고, 폼 삽입물로 지지되는 조직 카세트에 넣습니다. 대조군 안구를 박절 및 포매한 후, 카세트를 중성 완충 포르말린에 넣고 표준 자동 12시간 파라핀 처리 기술을 통해 밤새 처리합니다.

다음 날, 절단면이 될 부분이 아래로 향하도록 처리된 조직을 파라핀에 매립합니다. 그런 다음, 파라핀 블록을 5 µm 두께로 절편합니다. 이후 염색된 각 영역의 절편을 슬라이드에 부착합니다.

DY 영역의 위치를 확인하기 위해 현미경으로 슬라이드를 정기적으로 관찰하십시오. 공막의 각 염색된 지점에 인접한 영역이 어레이의 해당 전극과 가장 가까웠던 부위입니다. 마지막으로, 원하는 대로 절편을 염색하십시오.

고다이나믹 레인지(High dynamic range). Davidson 고정액으로 고정한 후, 전극 어레이를 제거하기 전 상태의 초맥락막 전극 어레이가 삽입된 고양이 안구 적출 표본의 매크로 사진입니다. 반투명한 공막을 통해 어레이 내의 개별 전극들을 시각화할 수 있습니다.

화살표로 표시된 바와 같이, 전극에는 미리 정의된 염료 색상 체계로 표시가 되어 있습니다. 해부학적 지표로부터 일정 간격으로 배치된 이러한 염료 표식은 실험 간의 일관성을 유지하는 데 사용됩니다. 전극 어레이를 제거한 후, 안구를 수작업으로 절개하여 샘플 스트립으로 분리합니다.

화살표 머리는 공막 상의 전극 인접 부위 두 곳을 나타냅니다. 점선은 이전 그림의 샘플을 절단하여 얻은 이 대표 단면의 절단면을 나타내며, 샘플 스트립의 전체적인 형태는 조직 간의 최소한의 인위적 변형(artifact)과 함께 보존되었습니다. 화살표 머리가 가리키는 것과 같이 두 개의 염색 표시가 공막에 여전히 보입니다.

녹색 염료가 적색 염료보다 더 내성이 강했지만, 염료의 위치는 전극의 위치를 나타냅니다. 따라서 인접한 망막 조직에서 전기 자극으로 인해 발생했을 수 있는 손상 여부를 평가할 수 있으며, 본 배율에서 확인한 결과 이전 이미지에서 보였던 녹색 염료 인접 망막층은 실제로 박리되지 않았으며 망막의 형태가 이곳에서 보존되었습니다. 본 프로토콜에 따라 처리된 망막 조직 절편의 대표적인 특수 염색 및 면역조직화학 분석 결과가 이 첫 번째 이미지에 제시되어 있습니다.

헤마틴은 세포핵을 청색으로 염색하고, 에오신은 세포질, 콜라겐 및 지지 조직을 다양한 색조의 분홍색으로 염색했습니다. 이 이미지에서 룩살 패스트 블루는 수초를 청색으로 염색했습니다. 크레설 바이올렛 대조 염색은 페리블루 내의 미사일 소체를 염색하고 주변 위성 세포를 강조함으로써 신경절 세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 메이슨 트라이온 블루 처리 단면에서 BRIC 스칼렛 산 융합 용액은 근섬유를 적색으로 염색한 반면, 린 블루는 콜라겐을 청색으로 염색했습니다.

이 사례의 경우, 해당 절편의 공막은 periodic acid schiff 염색을 통해 기저막의 당단백질 성분과 결합 조직 성분은 보라색으로 나타나며, hematoxylin 대조염색된 세포 핵은 파란색으로 나타납니다. 이 이미지에 표시된 공막 하 절편은 출혈 부위에 대해 pearl's Prussian blue 처리가 되었습니다. 분해된 적혈구로부터 헤모시데린이 형성되고 철 복합체가 방출되면서 보라색이 나타났습니다.

이 이미지에서 뉴트럴 레드의 첨가는 리소좀을 붉은색으로 염색하였으며, anti glutamine Synthes가 염색되었습니다. 뮐러 세포에서 발견되는 이 신경전달물질 분해 효소는 녹색으로 염색되어, 내핵층 내의 뮐러 세포체와 내경계막을 형성하는 뮐러 세포의 말단부까지 양방향으로 뻗어 있습니다. 신경필라멘트 단백질의 염색의 경우, 세포체와 돌기에서 발견되는 이 중쇄 세포골격 단백질이 녹색으로 표지되었습니다. 신경필라멘트 단백질은 다른 신경필라멘트와 교차 결합하여 뉴런의 구조를 유지합니다.

신경절 세포와 그 축삭은 신경절 세포층 및 신경섬유층에서 관찰할 수 있으며, 고양이 망막의 내핵층 외곽 경계에 위치한 수평 세포의 축삭은 녹색으로 나타납니다. 마지막 이미지에서는 세포골격 단백질인 glial fibrillary acidic protein이 빨간색으로 표시되어 있는데, 이 단백질은 글리아-시스(gliosis) 동안 뮐러 세포와 성상교세포에서 증식하며, 뮐러 세포가 망막 내층에서 외층까지 가느다란 돌기를 형성하여 신경섬유층을 따라 배열된 모습을 확인할 수 있습니다. 파란색 DPI로 대조 염색하여 망막 층을 시각화하였습니다.

이 절차를 수행하는 동안, 샘플 워크플로우를 3차원으로 시각화하고 절차 전반에 걸쳐 샘플의 방향을 정기적으로 고려하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 개발 후의 추가적인 안전 관련 질문에 답하기 위해 모든 조직학적 방법을 사용할 수 있습니다. 이 기술은 인공 망막 개발 연구자들이 시각 장애 환자를 위한 장기적인 안전 자극 수준을 평가할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 바이오닉 안구 임플란트의 안전성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.