현지화 된 조직 병리학 적 분석을 위해 망막 보철물 이식 처리 눈을위한 기법

이 절차의 전반적인 목표는 망막 보철물의 안전성 평가를 개선하는 것입니다. 이는 먼저 최적으로 고정된 적출된 안구의 표면에 조직 염료를 표시하여 이식된 전극의 위치를 표시함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 전극 배열을 제거하고 안구 조직을 스트립으로 절부합니다.

다음으로, 스트립을 한천에서 안정화 한 다음 파라핀에 내장합니다. 마지막 단계에서는 표시된 관심 영역을 절단하여 염색을 위해 슬라이드에 수집합니다. 궁극적으로 각 전극에 인접한 이식 부위의 건강 상태는 명시야 및 면역형광 현미경으로 평가할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 고정 관련 인공물 및 박리를 최소화할 수 있으며 큰 샘플에서 전극 인접 조직 영역을 정확하게 추적할 수 있다는 것입니다. 또한 다른 안과 질환에 대한 새로운 임플란트의 안전성을 평가하는 데 사용할 수도 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 망막이 박리되기 쉽고 샘플을 다루기 위해 높은 수준의 손재주가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 깨지기 쉬운 조직을 표시하고 다루는 방법을 배우기가 어렵기 때문에 중요합니다. 이 연구에 앞서, 극상 전극 배열을 이식한 후, 눈은 이전에 별이 나타내는 비최적 기술을 사용하여 처리되었습니다. 이 첫 번째 이미지는 전극 어레이 캐비티를 통과하는 대표적인 직교 단면을 보여줍니다.

망막은 바깥쪽 눈 조직에서 분리되어 있습니다. 이것은 화살촉으로 표시된 것처럼 이식된 영역 아래에서 특히 분명합니다. 또한 망막의 어느 부분이 어레이의 각 개별 전극에 인접해 있는지 확인할 수 없다는 점에 유의하십시오.

이 더 높은 배율에서는 화살촉으로 표시된 바와 같이 망막층에 몇 가지 규칙적인 방출 기반 아티팩트가 있을 뿐만 아니라 고양이 눈의 반사층인 어뢰층에서 크게 분리됩니다. 그러나 더 확대하면 광수용체의 바깥쪽 부분과 색소화된 상피는 손상되지 않은 상태로 유지되는 것을 관찰할 수 있으며, 이는 생체 내 외상 또는 병리학에서 비롯된 것과는 대조적으로 이전에 관찰된 분리나 처리의 인공적 부작용을 시사합니다. 따라서, 이러한 고정(fixation)과 관련된 인공물(artifacts) 및 박리(delamination)를 최소화하기 위해 다음과 같은 기술을 구현하였다.

핵을 형성하고 안구를 고정한 후, 에탄올에서 이식된 안구를 제거하고 결막과 힘줄낭을 포함한 여분의 조직을 조심스럽게 잘라내는 것으로 시작합니다. 시신경을 2-3mm 길이로 자릅니다. 전극 어레이는 반반투명 공막을 통해 볼 수 있습니다.

그런 다음 끝이 가는 페인트 브러시를 사용하여 조직에 조직학적 염료를 조심스럽게 바르고 전극에 미리 정의된 색상 코드로 레이블을 지정합니다. 염료가 번지지 않도록 주의하십시오. 관심 지점을 정의하거나 섹션을 정렬하는 데 도움이 되도록 추가 염료 표시를 만들 수 있습니다.

여기서, 최대로 자극된 전극은 녹색으로 표시되어 있습니다. 다른 활성 전극은 빨간색으로 표시되어 있습니다. 더 큰 직경의 리턴 전극은 노란색으로 표시되었으며 추가 가이드 또는 해부학적 표시는 파란색 염료로 표시되었습니다.

5분 동안 공기 중에서 건조시킨 후 글로브를 70% 에탄올로 되돌려 염료를 탈수시킵니다. 그런 다음 방금 시연한 대로 이식되지 않은 대조군 안구에서 여분의 조직을 잘라낸 후 핵 형성 및 고정 단계에서 부착된 8개의 나일론 봉합사를 사용하여 대조군과 이식된 눈을 거울 쌍으로 정렬합니다. 그런 다음 전극 어레이와 동일한 치수의 실리콘 템플릿을 이식된 눈의 어레이 위치에 해당하는 대조군 I의 미러 위치에 놓습니다.

그런 다음 방금 설명한 대로 대조구 표면에 라벨을 붙여서 이식된 각 전극 부위가 해부학적으로 유사한 위치에 대조군 쌍을 갖도록 합니다. 다음으로, 눈에서 임플란트 배열을 제거한 다음 각막, 홍채 및 수정체를 포함한 눈 앞쪽을 제거합니다. 다음으로 남은 아이컵에서 유리체액을 제거합니다.

이제 이식된 눈을 2mm 두께의 여러 스트립으로 절개합니다. 각각은 다이 마킹 영역의 하위 집합을 포함합니다. 스트립의 방향은 임플란트에 대한 조직 반응의 다양한 측면을 평가하는 데 도움이 되도록 선택해야 하며, 나중에 참조할 수 있도록 샘플의 다이 마킹 위치를 주의 깊게 문서화해야 합니다.

다음으로, 절단할 면이 먼저 아래를 향하도록 스트립을 액화 한천의 얕은 웅덩이에 놓습니다. 한천이 굳으면 샘플 주위를 자르고 폼 인서트로 지지되는 조직 카세트에 넣습니다. 대조구를 해부하고 삽입한 후, 카세트를 중성 완충 포르민에 놓고 표준 자동 12시간 파라핀 처리 기술을 통해 밤새 처리합니다.

다음날, 가공된 조직을 파라핀에 먼저 절단할 면이 아래를 향하도록 합니다. 이제 파라핀 블록을 5미크론 섹션으로 자릅니다. 그런 다음 염색된 각 영역의 단면을 슬라이드에 장착합니다.

DY 영역을 찾으려면 현미경으로 슬라이드를 정기적으로 확인하십시오. 공막의 염색된 각 부위에 바로 인접한 영역은 어레이의 해당 전극에 가장 근접한 영역입니다. 마지막으로 원하는 대로 섹션을 염색합니다.

높은 다이내믹 레인지. 제자리에서 프라코로이드상 전극 배열을 가진 적출된 고양이 눈의 매크로 사진은 davidson의 고정제로 고정한 후와 배열을 제거하기 전에 표시됩니다. 반투명 공막을 사용하면 어레이의 개별 전극을 시각화할 수 있습니다.

화살촉으로 표시된 것처럼 전극은 사전 정의된 염료 색 구성표로 표시됩니다. 해부학적 랜드마크에서 일정한 간격으로 배치된 이러한 염료 표시는 실험 전반에 걸쳐 일관성을 유지하는 데 사용됩니다. 전극 어레이를 제거하면 눈을 손으로 샘플 스트립으로 절개합니다.

화살촉은 공막의 인접한 두 개의 전극 위치를 나타냅니다. 점선은 이전 그림에서 샘플을 절단하여 얻은 이 대표 섹션의 단면면을 나타내며, 샘플 스트립의 전체적인 모양은 최소한의 차등 조직 아티팩트로 보존되었습니다. 두 염료 표시 모두 화살촉으로 표시된 것처럼 공막에서 여전히 볼 수 있습니다.

녹색 염료가 빨간색 염료보다 탄력성이 더 높았지만 염료의 위치는 전극의 위치를 나타냅니다. 따라서, 본 확대에서 볼 수 있듯이 전기 자극으로 인한 손상이 있는 경우 인접한 망막 조직을 평가할 수 있으며, 이전 이미지에서 볼 수 있는 녹색 염료에 인접한 망막층은 실제로 분리되지 않았으며, 여기에서 망막 형태가 보존되었습니다. 현재 프로토콜에 따라 처리된 망막 조직 절편의 대표적인 특수 염색 및 면역조직화학이 이 첫 번째 이미지에 나와 있습니다.

헤마틴은 세포핵을 파란색으로 염색한 반면 eoin은 세포 세포질, 콜라겐 및 지지 조직, 다양한 색조의 분홍색을 염색했습니다. 이 이미지에서 luxal fast blue는 미엘린을 파란색으로 염색했습니다. 크레탈 바이올렛 카운터 염색은 페릭 블루 내의 미사일 본체를 염색하고 주변 위성 세포를 강조하여 신경절 세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 석공의 트리온 블루 처리 섹션에서 BRIC 스칼렛 산 융합 용액은 근육 섬유를 빨간색으로 염색하고 린 블루는 콜라겐을 염색했습니다.

이 경우, 주기적인 산 시프에 의해 염색된 이 부분의 공막은 파란색으로 염색되고, 기저막의 당단백질 성분과 결합 조직 성분은 자주색으로 나타나고, 헤마트 토인 counterstain 세포핵은 파란색으로 나타납니다. 이 이미지에 표시된 공막하 절편은 출혈 부위에서 진주의 프러시안 블루로 처리되었습니다. 분해된 적혈구에서 헤모시데린이 형성되고 철 복합체가 방출되어 자주색을 띠게 되었습니다.

이 이미지에서 중성 적색을 첨가하여 리소좀을 빨간색으로 염색하고, 항 글루타민 합성을 염색했습니다. 녹색의 Mueller 세포에서 발견되는 이 신경전달물질 분해 효소는 내부 핵층 내의 Mueller 세포체와 Mueller 세포 말단 공급물과 함께 양방향으로 확장되어 신경필라멘트 단백질의 염색을 위한 내부 제한막을 형성합니다. 이 중쇄 세포골격 단백질은 세포체에서 발견되는 녹색으로 표시되었으며 뉴런의 구조를 유지하기 위해 다른 뉴로필라멘트와 가교하는 뉴로필라멘트 단백질을 처리합니다.

신경절 세포와 그 축삭돌기는 신경절 세포와 신경 섬유층에서 관찰할 수 있으며, 고양이 망막의 내부 핵층의 바깥쪽 경계에 위치한 수평 세포의 축삭돌기는 녹색으로 보입니다. 이 최종 이미지에서 신경교섬유산성 단백질은 이 세포골격 단백질을 빨간색으로 표시하고, 신경교세포가 발생하는 동안 Mueller 세포와 성상세포에서 증식하며, 신경 섬유층을 Mueller 세포로 둘러싸고 있는 것을 볼 수 있습니다. 파란색의 DPI를 사용한 카운터 염색을 통해 망막층을 시각화할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 샘플 워크플로우를 3차원으로 시각화하고 절차 전반에 걸쳐 샘플의 방향을 정기적으로 고려해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 개발 후 추가 안전 관련 질문에 답하기 위해 모든 조직학적 방법을 사용할 수 있습니다. 이 기술은 생체 공학적 안구 개발 연구자들이 시각 장애인 환자를 위한 장기적으로 안전한 자극 수준을 평가할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 생체 공학적 안구 임플란트의 안전성을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.