Methicillin 내성의 실험 심내막염 모델

이 프로시저의 전체적인 목표는 쥐를 이용한 실험적 감염성 심내막염 모델을 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 aureus를 배양하고 감염용 수술 카테터를 준비합니다. 그 다음, 수술 부위를 준비하고 동물에게 마취를 실시합니다.

동물에게 마취를 실시한 후, 우측 경동맥을 통해 심장 방향으로 카테터를 삽입합니다. 마지막 단계로 꼬리 정맥 주사를 통해 동물에게 aureus를 감염시킵니다. 최종적으로 표적 조직을 적출하여 정량 배양을 위해 준비합니다.

신속 심내막염 모델과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 적색 심내막염 모델을 in vivo 이미징 시스템인 Ivus와 함께 사용할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 항균제의 효능 및 병원성으로 대표되는 구강 발병 기전 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 기술이 처음인 사람은 수술 과정이 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

먼저 냉동 보존된 M SSA 배양액을 루프 가득 덜어 양 혈액 한천 사면배지에 접종합니다. 오염이 없는지 확인한 후, 대두-카제인 소화물 한천(soy auger) 플레이트에서 배양액을 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 플레이트에서 단일 콜로니 하나를 선택하여 15 mL 스냅 캡 튜브에 담긴 5 mL의 try toay soy broth에 접종합니다.

접종물을 진탕 배양기에서 37°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 먼저 카테터를 준비하기 위해 200 RPM으로 설정합니다. 폴리에틸렌 튜브를 10 cm 길이로 자르고, cex 소독액에서 30분 동안 카테터를 멸균합니다.

다음으로, 가열된 멸균 포셉으로 멸균 튜브의 한쪽 끝을 눌러 녹여, 우경동맥에서 좌심실로 진입하여 심장 박동 시 심내막에 손상을 줄 수 있는 카테터를 제작합니다. 그 다음, 마취제가 효과를 나타낼 때까지 이소플루란과 산소 혼합 가스가 1:1 비율로 들어 있는 챔버에 쥐를 넣어 마취시킵니다. 근육이 이완되었는지와 발 반사가 소실되었는지를 확인하여 마취 상태를 검증합니다.

가스 혼합물이 연결된 노즈콘을 사용하여 수술 중에 마취 상태를 유지하십시오. 수술 전 과정 동안 무균법을 사용하여 베타딘과 70% ethanol로 수술 부위를 세척하십시오. 쥐를 등으로 눕힌 자세(dorsal position)로 배치하고, 둔성 박리법을 사용하여 흉골 위쪽의 목 피부층을 수직으로 절개하십시오.

근막을 분리하여 우경동맥을 노출시킵니다. 우경동맥은 쇄골 위쪽 정중선에서 약간 오른쪽에 위치합니다. 경부강에서 동맥을 조심스럽게 끌어올린 후, 노출된 두측단에서 결찰할 수 있도록 10cm 길이의 실크 봉합사 두 가닥을 동맥 아래에 배치합니다.

그 다음, 출혈을 방지하기 위해 동맥에 클립을 고정합니다. 포셉과 카테터 도입기를 사용하여 동맥 상단에 작은 구멍을 냅니다. 카테터의 밀봉되지 않은 끝부분을 동맥의 구멍을 통해 삽입합니다.

클립을 제거하고 카테터를 심장 방향으로 밀어 넣습니다. 저항이 느껴질 때까지 삽입하며, 카테터가 동맥 내부로 4~5 cm 정도 들어가 쥐의 심박동에 따라 맥동해야 적절하게 삽입된 것입니다. 카테터가 제자리에 위치하면, 동맥의 끝부분 주변을 느슨하게 봉합하고 카테터를 고정합니다.

실크 봉합사로 여분의 봉합사와 카테터 끝부분을 잘라낸 후, 끝부분을 목 피부 아래로 밀어 넣습니다. 피부 클립을 사용하여 피부를 봉합합니다. 쥐를 깨끗한 케이지에 넣고 마취에서 회복될 때까지 따뜻한 곳에 둡니다.

회복 기간 및 회복 후에도 쥐에게 먹이와 물을 제공하고 수시로 상태를 확인하십시오. 감염은 수술 후 1일에서 7일 사이에 수행할 수 있으나, 실험 내에서는 이 시점을 일정하게 유지해야 합니다. 쥐의 꼬리를 70% ethanol로 닦아낸 후, 원하는 부위에 MRSA 배양액 0.5 milliliters를 주입하십시오.

미정맥에 주입합니다. 27게이지 0.5인치 바늘을 사용하여, 쥐를 케이지로 돌려보내기 전 출혈이 멈출 때까지 주사 부위를 압박합니다. 쥐를 희생시킨 후, 흉부를 70% ethanol로 닦아내고 흉골 아래 가슴 부위에 V자형 절개를 가합니다.

흉골 양측의 갈비뼈 연골을 절개합니다. 심장을 노출시키기 위해 심장을 조심스럽게 위로 당기고, 대동맥 근처의 조직을 클립으로 집어 위쪽으로 박리하여 심장을 분리합니다. 4x4인치 거즈를 깐 멸균 페트리 접시에 심장을 놓고, 좌심실 내벽을 절개하여 좌측 심실을 엽니다.

카테터가 올바르게 배치되었는지 확인한 후 제거하십시오. 가위와 포셉을 사용하여 판막의 증식물을 검사하고 제거하십시오. 또한 신장과 비장을 적출하고, 조직과 증식물의 무게를 측정한 후 균질화하여 PBS로 연속 희석하여 정량 배양을 수행하십시오.

가장 왼쪽 화살표가 가리키는 곳에 올바르게 배치된 카테터가 보입니다. 카테터는 대동맥판막을 지나 심장의 좌심실까지 뻗어 있으며, 가운데와 오른쪽 화살표가 가리키는 것처럼 대동맥판막 주변에 수많은 증식물(vegetations)이 관찰됩니다. 이 표는 쥐 심내막염 모델에서 ssus 균주의 독성을 보여주는 사례입니다.

10⁵ 및 10⁶ CFU의 접종물을 투여하여 감염시킨 모든 동물은 심장 판막의 증식물뿐만 아니라 신장과 비장에서 높은 ssus 밀도를 보이며 심내막염이 발생했습니다. 숙련된 경우, 본 수술 절차는 적절하게 수행된다면 10분 이내에 완료될 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 수술 중 및 수술 후 동물 상태를 평가된 상태로 유지하는 것이 중요합니다. ivus와 같은 방법은 항균제의 효능을 실시간으로 모니터링하거나, 발달 후의 in vivo 유전자 발현과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니다. 이 기술은 혈관 내 감염에서 병원성 독성 인자를 탐구하려는 stem orus 및 fiction 분야 연구자들에게 유용한 방법이 될 것입니다.

이 영상을 시청한 후에는 쥐에서 실험적 심내막염 모델을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. MRA를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 실험복과 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.