개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상
April 12th, 2012
실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 배아 신경관 내의 세포 행동을 장기간 고해상도로 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 단일 세포를 표시하기 위해 선택한 형광 단백질의 발현을 유도하는 구조로 초기 신경관을 transection함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 초기 배아의 조각을 만들어 유리 바닥 접시에 장착하는 것입니다.
인큐베이터에서 회복한 후, 배아 절편은 일정한 간격으로 광시야 현미경에서 이미지화됩니다. 궁극적으로 이 기술은 높은 공간 및 시간 해상도로 장기간에 걸쳐 발달 중인 신경 상피 내의 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 살아있는 조직을 이미징하는 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 높은 공간 및 시간 해상도에서 장기간에 걸쳐 개별 세포의 행동을 관찰할 수 있다는 것입니다.
이 방법을 사용하면 황산염 선택에서 유사분열 방추체 방향의 역할 또는 플라스미드를 신경관으로 전기천공하기 전에 신호 역학이 세포 행동을 어떻게 조절할 수 있는지와 같은 발달 신경생물학 분야의 주요 질문을 해결할 수 있습니다. 유리 바늘은 해부 현미경 아래에서 마이크로 모세관 풀러를 사용하여 준비됩니다. 가는 집게를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨립니다.
바늘 끝은 신경관을 뚫을 수 있을 만큼 날카로워야 하며, DNA 용액의 주입을 방해할 정도로 좁아서는 안 됩니다. 이 실험을 위한 X는 약 36시간 동안 섭씨 37도에서 햄버거 해밀턴으로 배양되었습니다. 스테이지 10.
이 절차를 시작하려면 배아의 양쪽에 5mm 간격으로 전극을 넣고 DNA를 신경관에 주입합니다. DNA는 시각화를 위해 소량의 빠른 녹색으로 착색됩니다. 12-17볼트의 전류와 50밀리초 펄스 길이를 펄스 사이에 950밀리초로 세 번 적용합니다.
낮은 농도의 DNA와 낮은 electroporation voltages는 개별 세포를 추적할 수 있도록 모자이크 발현을 달성하는 데 사용됩니다. 마지막으로 달걀 껍질의 창을 지하실 테이프로 덮고 밀봉되었는지 확인합니다. 배아가 3-4시간 동안 또는 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 회복될 때까지 기다립니다.
콜라겐 혼합물과 슬라이스 배양 배지는 배아를 절단하기 약 한 시간 전에 준비해야 합니다. 0.1%acetic 산성 해결책의 100 microlits에 교원질 혼합물을 유형 1 교원질 및 와동의 300 microlit에 완전히 준비하기 위하여는, 5 시간 L 15, 매체 및 와류의 100 microlits를 철저하게 추가하십시오. 다시 말하지만, 용액이 노란색으로 변해야 합니다.
다음으로, 15-20 마이크로 리터의 7.5 % 중탄산 나트륨을 넣고 철저히 와류를 일으킨다. 용액이 약간 분홍색이 되어야 합니다. 얼음 위에 보관하십시오.
이 콜라겐 믹스는 매번 신선하게 준비해야 합니다. 10 밀리리터의 신경 기초 배지, B 27 보충제 글럿 최대 및 겐타마이신 용액에서 슬라이스 배양 배지를 준비하려면 배지를 5 % 이산화탄소로 완충 된 섭씨 37 도의 인큐베이터에 놓습니다. 용기 상단을 느슨하게 하여 최소 한 시간 동안 이산화탄소와 평형을 이룰 수 있도록 합니다.
이 절차를 시작하려면 작은 가위를 사용하여 배아를 잘라냅니다. 핀셋으로 L 15 배지를 세척하여 난자에서 배아를 제거합니다. 배아를 바닥에 실(syl guard) 층이 있는 조직 배양 접시에 넣습니다.
배아를 둘러싼 여분의 배아 막을 통해 배아를 고정하여 막이 팽팽하게 늘어나도록 합니다. 마이크로 나이프를 사용하여 관심 영역을 통해 배아를 가능한 한 똑바로 자릅니다. 척수의 경우, 절편은 배아의 측면 조직에 부착된 1-2개의 솜씨(somites) 두께의 잎 조각이 있어야 다른 배아가 절삭되는 동안 손실되지 않습니다.
척수 조각을 유리 바닥 접시로 옮기기 위해 맞춤형 마이크로 퍼펫 팁이 필요합니다. 이를 준비하려면 P two 또는 P 10 perman에 200 마이크로 리터 팁을 부착하고 팁 끝에서 약 1mm를 자릅니다. 팁 내부를 콜라겐으로 코드화하여 이전에 준비한 콜라겐 믹스 1마이크로리터를 준비합니다.
1-2분 동안 그대로 두었다가 L 15 배지로 헹굽니다. 이렇게 하면 조직이 팁 안쪽에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 이제 마이크로 나이프를 사용하여 배아에서 조각을 분리하고 200 마이크로 리터 팁이 장착 된 P 2 또는 P 10을 사용하여 접시에서 조각을 제거합니다.
가능한 한 적은 매체를 차지하도록 하십시오. 콜라겐 혼합물을 소용돌이치고 커버 슬립을 베이스로 하여 폴리올 라이신으로 코팅된 유리 바닥 접시에 5-8마이크로리터를 떨어뜨리고 즉시 배아 조각을 콜라겐에 넣고 한 쌍의 미세한 집게로 배치합니다. LIC는 이미징할 면이 커버 슬립과 같은 높이가 되도록 배치해야 합니다.
조직은 커버 슬립의 폴리올 라이신 코팅에 부착되어야 합니다. 커버 슬립에 여러 조각이 생길 때까지 이 작업을 반복합니다. 보통 한 접시에 6-9 조각이 놓입니다.
모든 조각이 제자리에 놓이면 2-3 마이크로 리터의 L 15, 중간에서 가장 빠른 위치 콜라겐을 넣고 접시를 덮습니다. 콜라겐이 굳을 때까지 20분 동안 기다립니다. 콜라겐이 조심스럽게 굳어지면 5% 이산화탄소와 섭씨 37도에서 최소 한 시간 동안 평형을 이룬 슬라이스 배양 배지 2ml를 추가합니다.
섭씨 37도의 이산화탄소 5% 인큐베이터의 커버 슬립 장소에서 콜라겐이 제거되지 않도록 주의해야 하며 이미징 전 최소 3시간 동안 슬라이스가 회복될 수 있도록 해야 합니다. 높은 시간 및 공간 해상도에서 장기간 동안 조직 내의 세포 행동을 이미징하는 것은 어려운 일입니다. 최적의 배양 조건과 화이트 필드 현미경 검사의 사용은 좋은 결과를 얻는 데 필수적입니다.
기상 관측소 환경 챔버가 장착된 델타 비전 코어 광시야 현미경을 사용하여 슬라이스를 이미지화합니다. 챔버는 현미경 단계를 5% 이산화탄소 및 95% 공기로 유지하기 위해 이산화탄소 관류 장치로 섭씨 37도에서 지속적으로 유지되며, 이미징은 일반적으로 40배 1.30 NA 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 수행되며 이미지는 CCD 카메라 Z 섹션이라고 하는 코어 스냅 HQ 2개로 캡처되며, Z 섹션은 1.5 미크론에서 45 미크론의 조직 노출까지 매 캡처됩니다. 시간은 가능한 한 낮게 유지해야 합니다(예: 5-50밀리초).
상기 각 섹션에 대해 이미지는 7분마다 캡처됩니다. Delta 비전 시스템을 사용하여 최대 9개의 슬라이스를 방문할 수 있습니다. 여기에 표시된 정확한 점 방문 기능은 GFP 알파 튜불린 이미징을 발현하는 구조체로 형질 주입된 척수 전구 세포의 타임 랩스 시퀀스의 예이며, 2일 된 HH 12기 배아의 척수 절편에서 이미징이 시작되었습니다.
이 초기 단계에서 신경 전구 세포는 주로 전구 전구 모드 분열을 겪으며, 이 동안 세포는 분열하여 두 개의 추가 순환 전구 세포를 생성합니다. 이 그림은 방금 표시된 타임랩스 시퀀스에서 선택한 프레임을 보여줍니다. 2시간 20분이 되면 세포는 정점 표면에 수직인 분열면으로 분열하여 두 개의 딸 세포를 생성합니다.
이 두 세포는 24시간 23분과 25시간 54분에 다시 한 번 분열합니다. 이 다음 타임 랩스 시퀀스는 세포막을 표시하는 G-F-P-G-P-I로 형질 주입된 세포에 대한 것입니다. 이 세포는 기저 과정이 흰색 화살표로 표시된 둘로 분할되는 분열을 거쳐 딸 세포에 의해 동등하게 유전됩니다.
이 타임랩스 시퀀스에서 선택된 프레임은 세포 분열이 0시간 49분에 발생함을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 척수 절편을 준비하고 이미지화하는 방법에 대해 잘 알게 되었을 것입니다. 이 기술을 처음 사용하는 경우 이 기술이 작동하려면 모두 함께 모여야 하는 기술적으로 어려운 단계가 많기 때문에 처음에는 어려움을 겪을 수 있음을 기억하십시오.
개요
이 연구는 닭 척수의 세포 및 아세포 변화를 장기간 고 공간 및 시간 해상도로 영상화하기 위한 새로운 분석법을 제시합니다. 이 기술은 신경계의 다양한 영역과 발달 중인 배아에 적용 가능합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경과학
- 발달 생물학
- 영상 기술
배경
- 배아 조직을 실시간으로 영상화하는 것은 어렵습니다.
- 기존 방법은 상세한 연구에 필요한 해상도나 기간이 부족합니다.
- 높은 해상도의 영상화는 발달 중 세포 행동을 이해하는 데 중요합니다.
- 이 기술은 시간 경과에 따른 개별 세포 행동을 관찰할 수 있게 합니다.
연구 목적
- 배아 신경관의 세포 행동을 장기간 영상화하는 방법을 개발합니다.
- 영상 기술의 공간 및 시간 해상도를 향상시킵니다.
- 발달 신경생물학의 핵심 질문에 답합니다.
사용된 방법
- 형광 단백질 구성물을 사용한 초기 신경관의 단면화.
- 배아 슬라이스의 준비 및 유리 바닥 접시에 장착.
- 일정 간격으로 광역 현미경을 사용한 영상화.
- 영상화 중 조직 생존성을 유지하기 위한 특정 배양 조건의 사용.
주요 결과
- 장기간에 걸쳐 개별 세포 행동의 성공적인 영상화.
- 개발된 기술로 높은 공간 및 시간 해상도를 달성했습니다.
- 발달 중인 신경 상피 내 세포 행동 역학에 대한 통찰력.
- 유사분열 방추 배향 및 신호 역학 연구에 대한 잠재적 응용 가능성.
결론
- 이 방법은 배아 조직의 영상화에 중요한 발전을 제공합니다.
- 발달 신경생물학 연구의 새로운 경로를 엽니다.
- 추가적인 적응은 신경계의 다양한 영역에 적용 가능성을 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding dynamic cell behavior in developing tissues is critical for de-risking target validation in neurodevelopmental disorders. This imaging approach enables high-resolution, longitudinal observation of progenitor cell dynamics, supporting mechanistic insights into signaling pathways that govern cell fate decisions. Such predictive confidence aids in prioritizing targets with stronger translational potential early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how signaling perturbations affect progenitor cell division and differentiation in real time.
- Operational Value: Provides quantitative, sub-cellular resolution data on mitotic dynamics and process inheritance to clarify pathway-specific effects.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular interventions to observable changes in cell behavior over extended periods.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible embryonic tissue preparations suitable for compound or genetic perturbation screening.
- Quantitative Output: Delivers high-spatiotemporal-resolution time-lapse data enabling precise measurement of division orientation, timing, and inheritance patterns.
- Scalability: Supports multi-slice imaging per dish, increasing throughput for comparative condition testing in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Offers a human-relevant embryonic model to study conserved mechanisms of neuroepithelial patterning disrupted in developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by establishing causal links between target modulation and phenotypic outcomes in tissue context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct effects on progenitor behavior versus secondary consequences, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing mechanistic readouts that inform go/no-go decisions before significant investment.
- Discovery Biology: Enables direct testing of how candidate modulators alter progenitor cell division symmetry, orientation, and inheritance in a developing tissue context.
- Screening: Yields standardized, imaging-ready slices with consistent viability, supporting reproducible compound exposure and phenotype detection.
- Analytics: Generates quantitative metrics on division timing, cleavage plane orientation, and cytoplasmic inheritance for objective condition comparison.
- Translational Research: Connects molecular perturbations to emergent tissue-level behaviors, supporting biomarker-aligned phenotypic anchoring in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across multiple neurodevelopmental targets and signaling pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking target engagement to dynamic cellular phenotypes in a physiologically relevant system.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized slice culture and environmental control, minimizing variability in longitudinal imaging.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early elimination of targets lacking desired effects on progenitor behavior dynamics.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of target modulation on disease-relevant cellular processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling, electroporation, and live imaging to ensure slice viability and data quality.
- Dependent on wide-field fluorescence microscopy with environmental control for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Necessitates standardized protocols for collagen-based embedding and medium equilibration to maintain consistent tissue adhesion and physiology.
- Adaptation across model systems may require optimization of slice thickness, culture conditions, and fluorescent reporter expression levels.
- Practical limitations include the technical complexity of embryo preparation and the need for precise environmental control to prevent phototoxicity and drift.
