개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

본 절차의 전반적인 목적은 배아 신경관 내의 세포 행동을 장기간 동안 고해상도로 이미징하는 것입니다. 이를 위해 먼저 선택한 형광 단백질의 발현을 유도하는 컨스트럭트를 사용하여 초기 신경관을 횡단 절단함으로써 개별 세포를 표지합니다. 다음 단계로는 초기 배아의 절편을 제작하여 유리 바닥 배양 접시에 고정합니다.

인큐베이터에서 회복시킨 후, 배아 슬라이스를 광시야 현미경으로 일정 간격마다 촬영합니다. 궁극적으로 이 기술은 높은 공간 및 시간 해상도로 장기간에 걸쳐 발달 중인 신경 상피 내의 세포 행동을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 생체 조직 이미징을 위한 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 높은 공간 및 시간 해상도로 장기간에 걸쳐 개별 세포의 행동을 관찰할 수 있다는 점입니다.

본 방법은 방추사 방향 설정이 설페이트 선택에서 갖는 역할이나, 신경관 내 플라스미드 전기천공법 이전에 신호 전달 역학이 세포 행동을 어떻게 조절하는지와 같이 발달 신경생물학 분야의 핵심 질문들을 다룰 수 있게 해줍니다. 해부 현미경 하에서 마이크로 캐필러리 풀러를 사용하여 유리 니들을 준비합니다. 미세 핀셋을 사용하여 니들의 팁 부분을 부러뜨려 사용하십시오.

바늘의 끝은 신경관을 뚫을 수 있을 만큼 충분히 날카로워야 하며, DNA 용액의 주입을 방해할 정도로 너무 좁아서는 안 됩니다. 본 실험에 사용된 배아는 37 °C에서 약 36시간 동안 배양되어 햄버거-해밀턴(Hamburger-Hamilton) 단계 10에 도달했습니다.

이 절차를 시작하려면, 알에 창을 내고 배아의 양측에 전극을 5 mm 간격으로 배치한 후, 신경관에 DNA를 주입합니다. 시각화를 위해 DNA에 소량의 fast green 색소를 첨가합니다. 12~17 V의 전류를 50 ms 펄스 길이로 3회 가하며, 펄스 사이의 간격은 950 ms로 설정합니다.

개별 세포를 추적할 수 있도록 모자이크 발현을 유도하기 위해 낮은 농도의 DNA와 낮은 전기천공 전압을 사용합니다. 마지막으로, 셀로판 테이프로 달걀껍데기의 창 부분을 덮고 완전히 밀봉되었는지 확인합니다. 배아를 37 °C에서 3~4시간 또는 밤새도록 회복시킵니다.

콜라겐 혼합물과 절편 배양 배지는 배아를 절편화하기 약 한 시간 전에 준비해야 합니다. 0.1% acetic acid 용액 100 µL에 type one collagen 300 µL를 넣고 충분히 볼텍싱하여 콜라겐 혼합물을 준비한 다음, 5배 농축 L 15 배지 100 µL를 추가하고 다시 충분히 볼텍싱합니다. 이때 용액은 노란색으로 변해야 합니다.

다음으로, 7.5% sodium bicarbonate 15~20 µL를 첨가하고 충분히 볼텍싱합니다. 용액이 옅은 분홍색으로 변해야 합니다. 얼음 위에 보관하십시오.

이 콜라겐 혼합물은 매번 새로 준비해야 합니다. 다음과 같이 슬라이스 배양 배지를 준비하려면, Neurobasal medium, B 27 supplement, Glutamax 및 Gentamycin 용액 10 mL를 5% CO2로 버퍼링된 37 °C 인큐베이터에 넣으십시오. 용기 뚜껑을 느슨하게 닫아 최소 1시간 동안 CO2와 평형을 이루도록 둡니다.

이 절차를 시작하려면, 작은 가위를 사용하여 배아를 절단해 냅니다. 핀셋으로 배아를 알에서 꺼낸 후 L 15 배지로 세척하십시오. 배아를 바닥에 syl guard 층이 형성된 조직 배양 접시에 놓습니다.

배아 주변의 배외막을 통해 배아를 고정하여 막이 팽팽하게 당겨지도록 합니다. 마이크로 나이프를 사용하여 관심 영역을 통해 배아를 가능한 한 직선으로 절단합니다. 척수 절편의 경우 두께가 1~2개 체절 사이가 되어야 하며, 다른 배아들을 절단하는 동안 분실되지 않도록 절편을 배아의 측면 조직에 부착해 둡니다.

척수 절편을 유리 바닥 접시에 옮기기 위해 맞춤형 마이크로 피펫 팁이 필요합니다. 이를 준비하려면 P2 또는 P10 피펫에 200 µL 팁을 장착하고 팁 끝부분에서 약 1 mm를 잘라냅니다. 앞서 준비한 콜라겐 혼합액 1 µL를 사용하여 팁 내부를 콜라겐으로 코팅합니다.

1~2분 동안 그대로 둔 다음 L 15 배지로 헹굽니다. 이렇게 하면 조직이 팁 내부 벽에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 이제 마이크로 나이프를 사용하여 배아에서 절편을 떼어내고, 200 µL 팁이 장착된 P 2 또는 P 10 파이펫으로 디쉬에서 절편을 꺼냅니다.

배지를 가능한 한 적게 흡입하십시오. 콜라겐 혼합물을 볼텍싱한 후, 커버슬립이 바닥인 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥 디쉬에 5~8 µL를 떨어뜨립니다. 즉시 배아 절편을 콜라겐 위에 올리고 미세 핀셋으로 위치를 잡습니다. LICs는 이미징할 면이 커버슬립에 밀착되도록 배치해야 합니다.

조직이 커버슬립의 polyol lysine 코팅에 부착되어야 합니다. 커버슬립 위에 여러 개의 절편이 놓일 때까지 이 과정을 반복하십시오. 보통 하나의 디쉬에 6~9개의 절편을 배치합니다.

모든 절편이 배치되면, 콜라겐이 놓인 가장 첫 번째 위치에 L 15 배지 2~3 µL를 추가하고 디쉬의 덮개를 닫습니다. 콜라겐이 굳을 때까지 20분 동안 둡니다. 콜라겐이 굳으면, 5% CO2 및 37 °C에서 최소 1시간 동안 평형화된 절편 배양 배지 2 mL를 조심스럽게 추가합니다.

콜라겐이 커버슬립에서 떨어지지 않도록 주의하며 37 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에 넣고, 이미징 전 최소 3시간 동안 슬라이스가 회복되도록 합니다. 높은 시간적 및 공간적 해상도로 조직 내 세포 행동을 장기간 이미징하는 것은 매우 어렵습니다. 좋은 결과를 얻기 위해서는 최적의 배양 조건과 명시야 현미경(white field microscopy)의 사용이 필수적입니다.

슬라이스 이미징을 위해 기상 관측소 환경 챔버가 장착된 delta vision core 광시야 현미경을 사용합니다. 챔버는 이산화탄소 주입 장치를 통해 37 °C로 일정하게 유지하며, 현미경 스테이지의 환경은 5% carbon dioxide 및 95% Air로 유지합니다. 이미징은 일반적으로 40배 1.30 NA 오일 침수 렌즈를 사용하여 수행하며, 이미지는 core snap HQ two 냉각 CCD 카메라로 캡처합니다. Z-스택 이미지는 45 µm의 조직 노출 범위에 걸쳐 1.5 µm 간격으로 캡처합니다. 노출 시간은 5~50 ms와 같이 가능한 한 짧게 유지해야 합니다.

해당 각 섹션에 대해 7분마다 이미지를 캡처합니다. Delta 비전 시스템을 사용하여 최대 9개의 슬라이스를 방문할 수 있습니다. 여기에 표시된 정밀 지점 방문 기능은 GFP alpha Tubulin을 발현하는 컨스트럭트가 트랜스펙션된 척수 전구 세포의 타임랩스 시퀀스 예시입니다. 이미징은 생후 2일 된 HH stage 12 배아의 척수 슬라이스에서 시작되었습니다.

이 초기 단계 동안, 신경 전구 세포는 주로 전구 세포-전구 세포 모드 분열을 거치며, 이 과정에서 세포가 분열하여 두 개의 추가적인 주기성 전구 세포를 생성합니다. 이 그림은 방금 보여드린 타임랩스 시퀀스의 선택된 프레임들을 보여줍니다. 2시간 20분째에, 세포는 정단 표면에 수직인 분열면을 따라 분열하여 두 개의 딸세포를 생성합니다.

이 두 세포는 24시간 23분과 25시간 54분에 다시 한번 분열합니다. 다음 타임랩스 시퀀스는 세포막을 표시하는 G-F-P-G-P-I가 형질전환된 세포의 모습입니다. 이 세포는 분열 과정을 거치며, 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 기저 돌기가 두 개로 나뉘어 딸세포들에 동일하게 상속됩니다.

이 타임랩스 시퀀스의 선택된 프레임들은 세포 분열이 0시간 49분에 일어남을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 척수 절편을 준비하고 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술이 처음이라면, 성공적인 결과를 위해 여러 기술적으로 까다로운 단계들이 모두 조화를 이루어야 하므로 초기에는 어려움을 겪을 수 있다는 점을 기억하십시오.