Name: 개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 학습하세요 발달 중인 신경상피의 세포 행동을 고해상도 라이브 영상으로 관찰하는 방법을. 형광 단백질을 이용한 병아리 배아 신경관 절편 준비와 장시간 현미경 촬영 기술을 익혀보세요.

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1. 음식 준비 <ol><li> 슬라이스 배양에 사용되는 요리 (WillCo 요리) (거점으로 coverslip에) 유리 바닥입니다. 이러한 유리 바닥을 더럽히지 않으 6cm 조직 배양 접시에 렌즈 티슈에 표시됩니다. </li><li> 실험 전날, 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥에 수 있도록 상온에서 5 분 용 유리 바닥 접시와 부화 두 ML 0.1 % 폴리-L-라이신 솔루션을 추가합니다. </li><li> 폴리-L-라이신 솔루션을 제거하고 deionised 물에 세 번 헹굼 후 한때 70 % 에탄올 인치 </li><li> 하룻밤 건조 둡니다. 요리도 부드럽게 30~45초위한 낮은 전력에서 전자 레인지에 가열하여 건조하실 수 있습니다. </li></ol> 2. 배아 Electroporation <ol><li> 37 알을 품어 ° C에서 햄버거 - 해밀턴 (HH) 10 단계 (~ 36시간) (또는 다른 원하는 단계)로 변경합니다. </li><li> 시작은 유리 바늘을 (우리가 불타는 / 브라운 모델 p87 microcapillary 풀러 사용) 준비 needl의 팁을 끊다 전에전자 해부 현미경 미세 집게를 사용하여. 그것이 DNA 솔루션의 주입을 막는 정도로 좁은 신중하지 못한 상태에서 바늘의 끝이 배아 피어스에 충분한 날카로운 있어야합니다. </li><li> 배아의 양쪽에 윈도우 계란과 장소 전극 (5mm 간격) </li><li> 신경 튜브로 - DNA를 (빠른 녹색의 소량으로 물들고 deionised 물에 0.5 μg / μl ~ 0.025) 주사. </li><li> 현재 적용 - 펄스 사이의 950 MS와 12-17 V를 세 번, 50ms 펄스 길이를. </li><li> 우리는 각각의 세포를 추적할 수 있도록 모자이크 표현을 달성하기 위해 DNA의 낮은 농도와 낮은 electroporation 전압을 사용합니다. </li><li> cellotape과 달걀 껍질에 창문을 커버하고는 밀폐되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 배아는 37 3~4시간 또는 하룻​​밤 동안 복구할 수 있도록 허용 ° C. </li></ol> 3. 콜라겐과 슬라이스 문화 매체 준비 <ol><li> 깔끔히 전에 시간 정도 콜라겐 믹스와 슬라이스 문화 매체를 준비합니다. </li><li> 300 μl t까지ype 한 콜라겐 100 μl 0.1 % 초산 용액 100 μl 5 X L15 매체를 추가하십시오. 각 또한 후에 철저하게 소용돌이. 솔루션은 노란색 켜야합니다. </li><li> 지금 15-20 μl 7.5 % 나트륨 중탄산염 철저히 와동를 추가합니다. 솔루션은 약간 분홍색이 되었 을텐데이 필요한 중탄산 볼륨이 다를 수 있습니다. 빙판에 유지하고 매번 신선하다. </li><li> 10 ML neurobasal 매체는 1 X 최종 농도와 10 μl Gentamicin 솔루션으로, B-27 보충 및 Glutamax을 추가하려면. </li><li> 37 ° C 배양기에서 개최 매체 5 % CO 2와 버퍼. 그것은 CO 2와 평형 수 있도록하는 컨테이너의 상단은 자유롭게 둡니다. </li></ol> 4. 슬라이스 문화 <ol><li> 난자에서 배아를 제거하고 L15 중간에 씻는다. </li><li> 하단 sylgard의 레이어와 그들이 긴장 뻗어되도록 주변 엑스트라 배아 세포막을 통해 그들을 핀으로 조직 배양 접시에있는 장소. </li><li> 마이크 사용roknife, 관심 영역을 통해 슬라이스 배아 더할 나위없이 가능한. 척수의 경우 조각은 두께 1-2 somites 사이 여야합니다. 당신이 그들을 손실되지 않도록 다른 배아를 썰어 동안 배아에 붙어 슬라이스를 남겨주세요. </li><li> 팁 중 ~ 1mm를 잘라와 P2 또는 p10 이것을 장착하여 200 μl micropipette 팁을 준비합니다. 이 단서는 유리 바닥 접시에 척수의 조각을 전송하는 데 사용됩니다. 10 μl 팁은 조각을 데리러만큼 광범위하지 않습니다. </li><li> 코트 이전 준비 1 μl 콜라겐 믹스를 pipetting하여 콜라겐과 팁의 내부. L15 매체와 헹굼 후 1-2 분 동안 둡니다합니다. 이 팁 내부를 지키는로부터 조직을 방지할 수 있습니다. </li><li> microknife를 사용하는 배아에서 슬라이스를 분리하고 200 μl 제보를 들으며 1 μl로 설정 P2 또는 p10를 사용하여 요리에서 제거합니다. 가능한 한 작은 매체로 소요될보십시오. </li><li> 폴리-L-라이신 코팅 요리에 대한이의 소용돌이 콜라겐 믹스와 드롭 5-8 μl. </li><li> Immediately 벌금 포셉 한 켤레와 장소에 콜라겐과 위치로 배아 슬라이스를 넣어. 조각이 몇 군데되는 측면이 coverslip으로 플러시되도록 배치해야합니다. 조직 coverslip에 폴리-L-라이신 코팅을 준수해야합니다. </li><li> 당신 coverslip에 몇 조각을 가지고 때까지이 단계를 반복합니다. 우리는 대개 한 접시에 6-9 조각을 넣을 수 있습니다. </li><li> 모든 조각이 제자리에있는되면 접시를 커버하고 콜라겐 20 분 동안 설정할 수 있습니다. 초기 배치 콜라겐의 일부는 이미 건조하기 시작했을 수 있습니다. 이것이 취재 전에 L15 소량을 추가 방지합니다. </li><li> 한번 설정 조심스럽게 적어도 한 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2에서 equilibrated되었습니다 2ml 슬라이스 문화 매체를 추가하십시오. 케어는 coverslip에서 콜라겐을 이동시키다하지 않도록 촬영해야합니다. </li><li> 37 ° / 5% CO 2 배양기에서 장소와 조각은 이미징 전에 적어도 3 시간 동안 복구할 수 있습니다. perspex 상자 재치에는 습도, 장소 요리가없는 경우한 구석에 젖은 티슈 중 하 비트. </li></ol> 5. 이미징 배아 조각 <ol><li> 우리는 이미지 조각으로 WeatherStation 환경 챔버를 들으며 DeltaVision 코어 와이드 필드 현미경을 사용합니다. 챔버는 지속적으로 5 % CO 95분의 2 %의 공기에서 현미경 스테이지를 유지하는 CO 2 관류 장치와 37 ° C,에서 관리하고 있습니다. </li><li> 이미징은 보통 40 X / 1.30 NA 기름 침지 렌즈를 사용하고 영상이 CCD 카메라를 냉각 CoolSnap HQ2으로 캡처되어 수행됩니다. </li><li> Z-섹션 45 μm의 조직을 통해 매년 1.5 μm의를 점령하고 있습니다. 노출 시간은 가능한 한 낮은 보관해야합니다. 우리는 일반적으로 각각의 Z-섹션에 5-50 MS에 대해 쉽게받을 수 있습니다. 이미지는 매 7 분 캡처되어 최대 9 조각이 함수를 방문 DeltaVision 시스템의 정확한 지점을 이용하여 방문하실 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 척수의 전구 세포의 예를 촬영된 시퀀스는그림. 2A와 해당 영화 1. 이미징은 이틀짜리 (HH 단계 12)​​ 배아에서 척수의 단면에서 시작되었습니다. 이 세포는 GFP-αTubulin을 표현 구조로 transfected되었다. 이러한 초기 개발 단계 동안, 신경 전구 세포는 주로 세포가 두 개의 추가 사이클링 전구 세포를 생성하기 위해 분할하는 동안 시조 - 시조 모드 부문을 받고있다. 그림. 2B와 해당 동영상 2 세포막을 마킹, GFP-GPI (GPI는 GFP를 정박)로 transfected 세포를 보여줍니다. 이 세포는 기초 과정을 둘로 분할하고 똑같이 딸 세포에 의해 상속되는 동안 부서를 겪습. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> 1 그림. 촬영된 영상을위한 슬라이스 문화 프로토콜. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> 그림 2. 세포 B정상 척수 개발 중에 ehavior. 영화 1 () 선택된 프레임. GFP-tubulin을 표현 세포는 다시한번 (24 H 23 분 25 H 54 분) 나누어 두 딸 세포를 생성, 혀끝의 표면 (2 H 20 분)에 수직이다 절단 비행기로 나눕니다. (b)는 영화 2 선택된 프레임. GFP-GPI로 transfected 세포는 기저 과정이 분할 (흰색 화살표)와 동등 딸 세포에 의해 상속되는 동안 세포 분열을 거쳐. 영화 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 영화 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 닭 배아 슬라이스 문화 셀 동작을 모니터링하려면 여기를 소설 촬영된 영상 분석을 제시. 24-48시간 사이의 시간을 프레임 캡처하여 쉽게 있지만, 이러한 분석은 70 시간 동안 살아있는 조직의 고해상도 이미징을 가능하게합니다. 높은 NA 오일 객관적이고 시간 지점 사이에 상대적으로 짧은 간격의 사용은 물론 우리가 흔히 빠르게 발생 셀 동작을 모니터링할 수 있도록로서, 높은 해상도 이미지 획득을 가능하게하고, 쉽게 공촛점를 사용하여 기존 촬영된 영상 중에 놓친 수 현미경. 이 분석의 주요한 이점은 오랜 기간 동안 이미지 셀에 대한 능력입니다. 7 현미경을 스캔 공촛점 레이저 대신 넓은 필드 6의 사용은 이것에 대한 중요합니다. 공촛점 현미경은 전통적으로 광학 부분을 직접 초점 정보를 밖으로 제거하는 기능을 포함하여 넓은 필드 현미경을 통해 몇 가지 장점을 제공하고있다 <sup&gt; 7지만, 핀홀의 사용은 정보의 상당한 금액을 제외하고, 긴 노출 시간을 necessitating, 검출기 8 빛의 손실이 생깁니다. 와이드 필드 현미경는 반면에, 전체 현장 조명을 사용하고 객관적 통해 모든 빛을 전달은 검출기로 전송됩니다. 높은 양자 효율이 결합은 결합 소자 (CCD) 카메라 매우 빠른 노출 시간으로 공촛점 현미경 9에 비해 노이즈 비율 높은 신호 이미징을 보장을 냉각. 우리의 애플 리케이션에서 우리는 오랜 기간, 기록 3D 스택 궁극적으로 작은 거의 회절 제한적인 구조를 해결하기위한 이미지해야합니다. 공촛점 현미경 적 검출기에 도달 밖 포커스 라이트를 방지하기 때문에 상당히 두께, 밀도-라벨 샘플 7, 8의 배경을 줄일 수 있지만, 그것은 단지보다 훨씬 더 큰 빛을 입력으로 사용할 신호 대 잡음 비율을 달성 와이드 필드 현미경 10. 매우 가벼운 민감한 sparsel위한우리 electroporated 척수의 조각 같은 당 - 라벨 샘플 따라서 와이드 필드 현미경은 공촛점 현미경보다 더 수행합니다. deconvolution하여 이미지 복원과 결합하면, 어느 초점 정보를 밖으로 제거하고 개선 명암, 넓은 필드 작고 희미한 물체 11 탐지에 특히 좋은 나서입니다.에게 모든 조직 이미징 실험에 적합하지 않지만, 이러한 방식은 우리의 라이브 세포 이미징 애플 리케이션을위한 매우 효과있다. 형광 단백질의 선택은 세포 생존에 영향을 미칠 수있는 중요한 요소이다. 우리는 최상의 결과를 마커로 녹색 형광 단백질 (GFP) 12를 사용하는 구조에서 얻을다는 것을 찾을 수 있습니다. 현재 효과적으로 듀얼 채널 건너 뛰자위한 GFP와 함께 사용할 수있는 적색 형광 단백질의 범위를 평가하고 있습니다. 13 사용 가능한 이러한 단백질의 여러 가지가 있습니다. 많은 단백질은 형광 단백질로 fusions로 안정 있지만일부 단백질은 감소 세포 생존 능력의 결과로, 융합에 의한 불안 정한 렌더링할 수 있습니다. 그러한 경우에는 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES)을 포함하는 구성 요소의 사용은 형광 단백질로부터 관심 단백질을 분리하는 데 유용합니다. 언제 이미징 척수의 조각,주의가 형광등에 노출을 최소화하기 위해 이동해야합니다. 현미경의 eyepieces는 조각을 찾아 입장하는 전송 빛 (brightfield)에서만 사용해야합니다. 형광 이미지는 항상 최소한의 노출 시간을 이용한 현미경 소프트웨어를 사용 취득해야합니다. 이들은 5-50 MS의 범위에 보관해야하며 중성 밀도 필터의 사용으로 실험한다. 긴 노출 시간이 처음 선명한 이미지를 생산할 수 있지만, 형광등 노출 phototoxic 효과는 세포 사망을 초래할 수 있습니다. 이 지역 중에 손상되었을 수 있습니다 티슈가 들어 있으므로 coverslip에 가장 가까운 조직의 첫 번째 5-10 μm의가 몇 군데하지 말아야깔끔히. 여기에 제시된 예제는 HH 단계 10과 나중에 몇 군데 6~7시간에서 electroporated 배아으로하지만,이 방법은 스테이지 18 HH하는 배아에 사용할 수 있습니다. 나중 단계에서 척수 조직이 훨씬 더 크네요 그래서 손으로 썰어하기 어렵습니다. 이러한 경우, 낮은 용융 점 아가로 오스의 배아를 내장하고 vibratome와 sectioning하면 더 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 우리가 개발 척수의 영상 전지 방법으로 이러한 분석을 제시하더라도,이 접근법은 또한 감각 placodes 3를 포함해 이미지를 다른 배아 조직에 수정되었습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> WillCo 요리 </td><td> WillCo 웰스 </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P8970 </td><td> 트리스의 0.1 % </td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 모세관 </td><td> 하버드 인 스트 루먼트 </td><td> GC100-10 </td><td> 1.0mm 외경, 0.58mm 내경 </td></tr><tr><td> 전극 (Genetrodes, 비켜에서, L 모양의 </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5mm 금은 도금 </td></tr><tr><td> ECM 830 평방 펄스 발생기 </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> 비켜 electroopration에 대한 </td></tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> 시그마 </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> 나는 쥐의 콜라겐을 입력 </td><td> 시그마 </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15 배지 (분말) </td><td> 시그마 </td><td></td><td> 2.76 G / 증류수에 패 5 배 솔루션을위한 </td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> 시그마 </td><td> S8761 </td><td> 7.5 % 용액 </td></tr><tr><td> Neurobasal 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> 페놀 레드 않고 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> 100x 솔루션 </td></tr><tr><td> B-27 보충제 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 MG / ML </td></tr><tr><td> L15 매체 (액체 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </tD&gt; <td> 15도 경사 </td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 헤드리스 핀 </td><td> 왓킨스과 Doncaster </td><td> E6871 </td><td> A1 사이즈 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 엘라스토머 </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision 코어 현미경 시스템 </td><td> 응용 정밀 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCD 카메라 </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

개발 neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

태아의 척수가 중추 신경계 (CNS)의의 연결과 glial 세포의 큰 백분율을 야기할 신경 전구 세포를 사이클링으로 구성되어 있습니다. 많이는 분자 메커니즘을 그 모양과 척수를 대해 알려진의 연결을 차별화 1, 2을 유도되지만, 우리는 세포 행동의 수준에서 이러한 초기 이벤트의 깊은 이해가 부족합니다. 그들은 neurogenesis를 받아야하는대로 실시간으로 신경 progenitors의 동작을 연구하기 때문에 중요합니다. 초기 배아 조직의 과거, 실시간 영상으로 세포 / 조직 문화의 생존뿐만​​ 아니라 형광 이미징의 phototoxic 효과에 의해 제한되었습니다. 여기 소설 전직의 생체내 슬라이스 문화 프로토콜과 넓은 필드 형광 현미경 (그림 1)를 이용, 오랜 기간에 대한 이미지와 같은 조직에 대한 소설 분석을 제시. 이 접근법은 병아리 배아 s의 장기간 시간이 경과 모니터링 구현높은 공간과 시간적 해상도 pinal 코드 전구 세포. 이 분석은 유전자 활동을위한 세포 및 서브 셀룰러 행동, 소설의 개발과 고도로 민감한 기자의 관찰 이외에 이미지 배아 조직 3, 4의 범위에 수정할 수 있습니다 (예 : 노치 신호 5)이 분석을하게 신호 방법을 이해하기위한 강력한 도구는 배아 발달 동안 세포의 행동을 규정합니다.

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

배아 척수는 중추신경계의 많은 비율의 뉴런 및 글리아 세포를 생성하는 주기성 신경 전구세포로 구성되어 있습니다.

본 절차의 전반적인 목적은 배아 신경관 내의 세포 행동을 장기간 동안 고해상도로 이미징하는 것입니다. 이를 위해 먼저 선택한 형광 단백질의 발현을 유도하는 컨스트럭트를 사용하여 초기 신경관을 횡단 절단함으로써 개별 세포를 표지합니다. 다음 단계로는 초기 배아의 절편을 제작하여 유리 바닥 배양 접시에 고정합니다.인큐베이터에서 회복시킨 후, 배아 슬라이스를 광시야 현미경으로 일정 간격마다 촬영합니다. 궁극적으로 이 기술은 높은 공간 및 시간 해상도로 장기간에 걸쳐 발달 중인 신경 상피 내의 세포 행동을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 생체 조직 이미징을 위한 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 높은 공간 및 시간 해상도로 장기간에 걸쳐 개별 세포의 행동을 관찰할 수 있다는 점입니다.본 방법은 방추사 방향 설정이 설페이트 선택에서 갖는 역할이나, 신경관 내 플라스미드 전기천공법 이전에 신호 전달 역학이 세포 행동을 어떻게 조절하는지와 같이 발달 신경생물학 분야의 핵심 질문들을 다룰 수 있게 해줍니다. 해부 현미경 하에서 마이크로 캐필러리 풀러를 사용하여 유리 니들을 준비합니다. 미세 핀셋을 사용하여 니들의 팁 부분을 부러뜨려 사용하십시오.바늘의 끝은 신경관을 뚫을 수 있을 만큼 충분히 날카로워야 하며, DNA 용액의 주입을 방해할 정도로 너무 좁아서는 안 됩니다. 본 실험에 사용된 배아는 37 °C에서 약 36시간 동안 배양되어 햄버거-해밀턴(Hamburger-Hamilton) 단계 10에 도달했습니다.이 절차를 시작하려면, 알에 창을 내고 배아의 양측에 전극을 5 mm 간격으로 배치한 후, 신경관에 DNA를 주입합니다. 시각화를 위해 DNA에 소량의 fast green 색소를 첨가합니다. 12~17 V의 전류를 50 ms 펄스 길이로 3회 가하며, 펄스 사이의 간격은 950 ms로 설정합니다.개별 세포를 추적할 수 있도록 모자이크 발현을 유도하기 위해 낮은 농도의 DNA와 낮은 전기천공 전압을 사용합니다. 마지막으로, 셀로판 테이프로 달걀껍데기의 창 부분을 덮고 완전히 밀봉되었는지 확인합니다. 배아를 37 °C에서 3~4시간 또는 밤새도록 회복시킵니다.콜라겐 혼합물과 절편 배양 배지는 배아를 절편화하기 약 한 시간 전에 준비해야 합니다. 0.1% acetic acid 용액 100 µL에 type one collagen 300 µL를 넣고 충분히 볼텍싱하여 콜라겐 혼합물을 준비한 다음, 5배 농축 L 15 배지 100 µL를 추가하고 다시 충분히 볼텍싱합니다. 이때 용액은 노란색으로 변해야 합니다.다음으로, 7.5% sodium bicarbonate 15~20 µL를 첨가하고 충분히 볼텍싱합니다. 용액이 옅은 분홍색으로 변해야 합니다. 얼음 위에 보관하십시오.이 콜라겐 혼합물은 매번 새로 준비해야 합니다. 다음과 같이 슬라이스 배양 배지를 준비하려면, Neurobasal medium, B 27 supplement, Glutamax 및 Gentamycin 용액 10 mL를 5% CO2로 버퍼링된 37 °C 인큐베이터에 넣으십시오. 용기 뚜껑을 느슨하게 닫아 최소 1시간 동안 CO2와 평형을 이루도록 둡니다.이 절차를 시작하려면, 작은 가위를 사용하여 배아를 절단해 냅니다. 핀셋으로 배아를 알에서 꺼낸 후 L 15 배지로 세척하십시오. 배아를 바닥에 syl guard 층이 형성된 조직 배양 접시에 놓습니다.배아 주변의 배외막을 통해 배아를 고정하여 막이 팽팽하게 당겨지도록 합니다. 마이크로 나이프를 사용하여 관심 영역을 통해 배아를 가능한 한 직선으로 절단합니다. 척수 절편의 경우 두께가 1~2개 체절 사이가 되어야 하며, 다른 배아들을 절단하는 동안 분실되지 않도록 절편을 배아의 측면 조직에 부착해 둡니다.척수 절편을 유리 바닥 접시에 옮기기 위해 맞춤형 마이크로 피펫 팁이 필요합니다. 이를 준비하려면 P2 또는 P10 피펫에 200 µL 팁을 장착하고 팁 끝부분에서 약 1 mm를 잘라냅니다. 앞서 준비한 콜라겐 혼합액 1 µL를 사용하여 팁 내부를 콜라겐으로 코팅합니다.1~2분 동안 그대로 둔 다음 L 15 배지로 헹굽니다. 이렇게 하면 조직이 팁 내부 벽에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 이제 마이크로 나이프를 사용하여 배아에서 절편을 떼어내고, 200 µL 팁이 장착된 P 2 또는 P 10 파이펫으로 디쉬에서 절편을 꺼냅니다.배지를 가능한 한 적게 흡입하십시오. 콜라겐 혼합물을 볼텍싱한 후, 커버슬립이 바닥인 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥 디쉬에 5~8 µL를 떨어뜨립니다. 즉시 배아 절편을 콜라겐 위에 올리고 미세 핀셋으로 위치를 잡습니다. LICs는 이미징할 면이 커버슬립에 밀착되도록 배치해야 합니다.조직이 커버슬립의 polyol lysine 코팅에 부착되어야 합니다. 커버슬립 위에 여러 개의 절편이 놓일 때까지 이 과정을 반복하십시오. 보통 하나의 디쉬에 6~9개의 절편을 배치합니다.모든 절편이 배치되면, 콜라겐이 놓인 가장 첫 번째 위치에 L 15 배지 2~3 µL를 추가하고 디쉬의 덮개를 닫습니다. 콜라겐이 굳을 때까지 20분 동안 둡니다. 콜라겐이 굳으면, 5% CO2 및 37 °C에서 최소 1시간 동안 평형화된 절편 배양 배지 2 mL를 조심스럽게 추가합니다.콜라겐이 커버슬립에서 떨어지지 않도록 주의하며 37 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에 넣고, 이미징 전 최소 3시간 동안 슬라이스가 회복되도록 합니다. 높은 시간적 및 공간적 해상도로 조직 내 세포 행동을 장기간 이미징하는 것은 매우 어렵습니다. 좋은 결과를 얻기 위해서는 최적의 배양 조건과 명시야 현미경(white field microscopy)의 사용이 필수적입니다.슬라이스 이미징을 위해 기상 관측소 환경 챔버가 장착된 delta vision core 광시야 현미경을 사용합니다. 챔버는 이산화탄소 주입 장치를 통해 37 °C로 일정하게 유지하며, 현미경 스테이지의 환경은 5% carbon dioxide 및 95% Air로 유지합니다. 이미징은 일반적으로 40배 1.30 NA 오일 침수 렌즈를 사용하여 수행하며, 이미지는 core snap HQ two 냉각 CCD 카메라로 캡처합니다. Z-스택 이미지는 45 µm의 조직 노출 범위에 걸쳐 1.5 µm 간격으로 캡처합니다. 노출 시간은 5~50 ms와 같이 가능한 한 짧게 유지해야 합니다.해당 각 섹션에 대해 7분마다 이미지를 캡처합니다. Delta 비전 시스템을 사용하여 최대 9개의 슬라이스를 방문할 수 있습니다. 여기에 표시된 정밀 지점 방문 기능은 GFP alpha Tubulin을 발현하는 컨스트럭트가 트랜스펙션된 척수 전구 세포의 타임랩스 시퀀스 예시입니다. 이미징은 생후 2일 된 HH stage 12 배아의 척수 슬라이스에서 시작되었습니다.이 초기 단계 동안, 신경 전구 세포는 주로 전구 세포-전구 세포 모드 분열을 거치며, 이 과정에서 세포가 분열하여 두 개의 추가적인 주기성 전구 세포를 생성합니다. 이 그림은 방금 보여드린 타임랩스 시퀀스의 선택된 프레임들을 보여줍니다. 2시간 20분째에, 세포는 정단 표면에 수직인 분열면을 따라 분열하여 두 개의 딸세포를 생성합니다.이 두 세포는 24시간 23분과 25시간 54분에 다시 한번 분열합니다. 다음 타임랩스 시퀀스는 세포막을 표시하는 G-F-P-G-P-I가 형질전환된 세포의 모습입니다. 이 세포는 분열 과정을 거치며, 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 기저 돌기가 두 개로 나뉘어 딸세포들에 동일하게 상속됩니다.이 타임랩스 시퀀스의 선택된 프레임들은 세포 분열이 0시간 49분에 일어남을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 척수 절편을 준비하고 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술이 처음이라면, 성공적인 결과를 위해 여러 기술적으로 까다로운 단계들이 모두 조화를 이루어야 하므로 초기에는 어려움을 겪을 수 있다는 점을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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