미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 미생물을 함유한 세포벽의 고품질, 내부 전반사, 형광 또는 잔디 이미지를 획득하는 것입니다. 이것은 먼저 커버 슬립과 셀을 준비하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 최적의 이미지 품질을 위해 현미경 설정을 정밀하게 정렬하는 것입니다.

다음으로, 이미지 또는 동영상을 획득하기 위해 올바른 입사, 각도 및 이미징 조건이 선택됩니다. 마지막 단계는 획득된 이미지의 사후 이미징 처리입니다. 궁극적으로, 잔디 현미경 검사는 세포 피질에서 단백질 국소화의 역학을 연구하는 데 사용됩니다.

현미경 검사를위한 기존 또는 공 초점과 같은 금속을 능가하는 것에 비해이 기술의 주요 장점은 현미경 검사에서 이미지 대비가 매우 높아 빠른 시간과 낮은 빛을 허용한다는 것입니다. 따라서 이 방법은 측면 단백질 분리 메커니즘 또는 막 단백질의 이동성과 같은 막 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 잔디 현미경 검사용 커버 슬립은 사용하기 전에 먼지 입자를 청소해야 합니다.

잔디는 더러운 커버 슬립의 먼지로 인해 발생하는 배경 신호에 민감하기 때문입니다. 커버 슬립 청소 절차를 시작하려면 배경이 적은 청소된 커버 슬립이 필요합니다. 집게를 사용하여 뚜껑이 있는 세라믹 홀더에 커버 슬립을 놓습니다.

다음으로, 유리 용기에 1 몰의 수산화 나트륨을 채 웁니다. 이 수산화나트륨은 여러 번 재사용할 수 있습니다. 커버 슬립이 들어 있는 세라믹 홀더를 수산화나트륨에 넣고 천천히 연속 회전하면서 커버 슬립을 2시간 동안 배양합니다.

2시간 후에 불투명한 커버 슬립이 생성되므로 8시간 이상 배양하지 말고, 천천히 연속 회전할 때마다 5분 동안 증류수로 커버 슬립을 두 번 세척하고, 청소한 커버 슬립을 100% 에탄올로 덮인 세라믹 홀더에 보관하십시오. 잔디 현미경 검사를 위해 가장 미묘한 간균 세포를 준비하려면 5ml의 적절한 성장 배지에서 0.01 - 0.05의 OD 600으로 희석하고 지수 단계로 성장합니다. 합성 매체에 1.25 % aros를 준비하고 섭씨 95 도의 1.5 밀리리터 플라스틱 튜브에 aros 분말을 녹인 다음 섭씨 72도의 가열 블록에 보관하십시오.

슬라이드 중간에 아로스를 한 방울 떨어뜨리고 두 번째 슬라이드를 사용하면 최소 2분 후에 아로스를 평평한 패드에 누르고 슬라이드를 조심스럽게 분리합니다. 1분 동안 12, 000RPM의 마이크로 원심분리기에서 500마이크로리터의 간균 미묘한 세포를 스핀다운합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 50마이크로리터 배지에 재현탁합니다.

2-4마이크로리터의 세포를 aros 패드의 중앙에 추가합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 에탄올로 채워진 용기에서 청소된 커버 슬립을 제거하고 압축 공기로 건조시킵니다. 커버 슬립을 샘플에 조심스럽게 놓습니다.

현미경 검사 전에 최소 2분 동안 세포가 안정되도록 합니다. 장기 이미징을 위해 커버 슬립의 가장자리를 바셀린, 라놀린, 파라핀의 가열된 혼합물 또는 Val 앱으로 밀봉합니다. 잔디 현미경 검사를 위해 Saccharomyces visi 세포를 준비하려면 사전 배양을 희석하고 최소 5시간 동안 적절한 배지에서 성장시킵니다.

지수 단계로 에탄올이 채워진 용기에서 커버 슬립을 꺼내 피펫 스프레드로 압축 공기로 건조시킵니다. 5 마이크로 리터, conval 및 a 또는 con 덮개에 용액. 가압된 공기로 미끄러지고 말리십시오 con A는 효모 세포벽의 탄수화물에 결합하여 효모 세포를 고정시킵니다.

다음으로, 4.5 마이크로 리터의 효모 세포 현탁액을 코팅된 커버 슬립인 콘의 한쪽으로 옮깁니다. 덮개를 미끄러지게 하십시오.amp한쪽 가장자리에서 시작하여 천천히 떨어뜨리도록 현미경 슬라이드에 면이 아래로 향하게 합니다. 이렇게 하면 기포 형성을 방지할 수 있습니다.

현미경 검사 전에 최소 2분 동안 세포가 안정되도록 하고, 장기 이미징을 위해 val 앱으로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 이 비디오에 표시된 모든 실험은 Olympus 100 x 1.45 NA 대물렌즈가 있는 완전 자동화된 IMEX 스탠드를 기반으로 하는 맞춤형 잔디 설정에서 수행되었습니다. 사용되는 광원은 488나노미터 및 561나노미터의 75밀리와트 다이오드, 펌핑된 고체 상태 또는 DPSS 레이저입니다.

잔디 각도와 형광. 광표백 또는 프랫 위치 후 회복은 두 개의 검류계를 통해 즉시 조정할 수 있습니다. 세 번째 검류계는 epi, fluorescence, frap 및 turf 사이를 전환하는 데 사용됩니다.

실시간 수집 소프트웨어에서 직접 제어되는 검류계를 사용하면 EM CCD 카메라와 카메라 앞의 2배 확대 렌즈로 잔디에서 추적된 물체에 대한 위치 파악 역학을 간단하게 측정할 수 있습니다. 획득은 또한 실시간 수집 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 레이저로 작업하기 전에 레이저 보안경을 착용하고 잔디 모드에서 레이저를 천장에 투사하고 레이저가 직선이 되도록 0도 위치를 보정합니다.

대물렌즈를 사용하여 최적의 조정 후 레이저 스폿을 최소 크기로 초점을 맞추면 레이저 프로파일이 대략 둥근 모양으로 잘 정의된 스폿을 형성해야 합니다. 모든 세션 전에 보정을 수행합니다. 최적의 이미지 품질을 얻으려면 잔디 현미경의 정렬이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다.

최적의 이미지 품질을 위해 이미지 획득을 위한 올바른 입사각, 각도 및 매개변수를 신중하게 조정해야 합니다. 이미지 획득을 시작하려면 명시야 조명을 사용하여 세포의 위치를 식별합니다. 적색 LED는 심각한 사진 손상을 일으키지 않기 때문에 특히 좋습니다.

레이저 조명으로 전환하고 적절한 레이저와 필터 조합을 선택하여 선택한 형광단을 여기시키고 잔디 각도가 임계 이하인지 확인하십시오. 그렇지 않으면 GFP 융합 단백질에서 발생하는 신호가 감지되지 않습니다. 커버 슬립을 향하는 셀의 측면인 셀의 상단 부분을 찾습니다.

신호가 사라질 때까지 레이저 빔의 입사각을 점차적으로 증가시킨 다음 세포 표면의 형광이 다시 나타날 때까지 각도를 천천히 줄입니다. 표면에서 최적의 위치를 위해 Z 초점을 다시 조정합니다. 허용 가능한 잔디 각도는 효모 단백질의 이 예에서 볼 수 있듯이 세포 가장자리에 흐릿한 후광을 생성하지 않습니다.

PMA one GFP는 왼쪽 상단에서 오른쪽 하단으로 감소하는 입사각으로 이미징되었습니다. 이미지는 임계 각도에서 갑작스러운 신호 손실과 구조 정보 및 신호 대 잡음비의 점진적인 감소를 보여주며, 레이저 강도 및 카메라 게인을 조정하여 다이내믹 레인지를 최대화합니다. 일반적으로 E-M-C-C-D 카메라는 높은 신호 대 잡음비에서 매우 낮은 신호를 감지하는 데 최적입니다.

잔디 현미경은 작은 높이에 매우 민감합니다. 커버 슬립의 차이로 인해 동시에 이미징할 수 있는 세포가 몇 개만 생성됩니다. 형광 구슬의 조밀한 현탁액에 대한 이 이미지는 시야의 일부에만 초점이 맞춰지는 고르지 않은 시야의 예입니다.

그러므로, 스몰 셀의 경우, 획득 영역은 종종 선택되는 객체를 포함하는 하위 영역으로 감소될 수 있습니다. 이중 색상 잔디 실험의 경우 R-F-P-G-F-P 쌍에 대해 형광단의 블리드를 최소화해야 합니다. RFP는 매주 488나노미터 빛에 의해 여기되므로 별도의 방출 필터를 사용하십시오.

블리드 스루(bleed through) 및 이중 색상 이미징을 방지하기 위한 일반적인 워크플로우가 여기에 나와 있습니다. 별도의 필터 세트로 세포를 이미징한 후, 병합하기 전에 형광 비드를 사용하여 이미지를 단련하고 정렬합니다.분석을 위해 이미지 품질에 영향을 미치는 중요한 매개변수는 레이저 정렬과 깨끗한 대물렌즈입니다. 레이저를 정렬하고 잔디 이미징에 사용되는 Z 위치에 초점을 맞춘 후 샘플을 제거하고 모든 오일의 대물렌즈를 청소합니다.

잔류 오일은 레이저 광의 회절과 빔 프로파일의 스페클을 유발합니다. 잔디 현미경 검사는 박테리아 세포에서 액틴 상동체 및 세포벽 효소의 분포를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 대표적인 결과에서, actin hoog MBL 또는 트랜스펩티다아제 PBPH의 GFP 융합을 발현하는 바실러스 미묘한 세포를 잔디와 일반 에피 형광에 의해 이미지화했습니다.

여기에 있는 이미지는 운동성으로 덮인 영역을 나타내기 위해 시계열의 평균 투영을 나타냅니다. 다양한 이미징 모드로 모니터링되는 MBL 패치. 오버레이 이미지의 파란색 윤곽선은 명시야 이미지 이미지에서 시각화된 셀 경계를 나타냅니다.

매주 발현되는 트랜스펩티다아제 PBPH는 에피 형광으로는 거의 보이지 않지만 잔디로 명확하게 구별할 수 있는 피질 패치에 국한됩니다. 감소된 침투는 화살표로 표시된 SEPTA에서 P-B-P-H-G-F-P 신호에 대해 가장 잘 관찰될 수 있으며, 이는 에피 형광에서는 선으로 나타나지만 잔디에서는 점으로 나타납니다. 이 다음 이미지 세트는 Saccharomyces visi의 TOR 복합 구성 요소인 비트 61의 에피 형광과 잔디 조명을 비교한 것을 보여줍니다.

이 단백질은 매주 발현되며 패치당 몇 개의 단백질 사본만 있는 작은 피질 패치를 형성합니다. epi 형광에서는 강한 배경 위에 몇 개의 패치만 보이는 반면 패치는 잔디에서 매우 우수한 신호 대 잡음비로 이미지화할 수 있습니다. 가우스 또는 중앙값 흐릿한 이미지의 빼기와 같은 다양한 이미지 처리 단계를 통해 이미지 대비를 추가로 개선할 수 있으며, 로컬 배경 빼기는 노이즈를 제거하고 고강도 구조를 선명하게 합니다.

이것은 종종 미세한 구조의 손실과 고강도 영역의 과장된 증폭의 대가로 발생합니다. 화살표에서 볼 수 있듯이 우수한 절차는 무료 또는 상용 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행할 수 있는 2D 디콘볼루션입니다. 디콘볼루션 후 대비의 증가는 원시 및 양도된 잔디 이미지가 번갈아 나타나는 GFP RA 2의 이 타임랩스 동영상으로 설명됩니다.

GFP RAs 2는 빠르게 움직이는 단백질이기 때문에 빠른 획득 시간이 중요합니다. 그것의 역동적 인 행동. 이미지 처리는 효모 단백질, FET 3G FP 및 PMA one RFP의 타임 랩스 더블 컬러 동영상에서 볼 수 있듯이 공동 국소화 분석에 특히 중요합니다.

처음 10개의 프레임은 원시 이미지를 나타내고 나머지 프레임은 이진화된 이미지입니다.분석을 가능하게 하려면 대비를 최대화하고 흐릿한 원시 이미지를 선명하게 하는 것이 중요합니다. 잔디와 프라프는 피질 단백질의 역학을 연구하기 위한 강력한 조합을 제공합니다. 이 기술을 B에서 사용하면 G-F-P-M-B-L을 발현하는 가장 미묘한 세포는 패치를 포함하는 MBL의 관찰된 운동성에 대한 메커니즘에서 트레드밀링을 배제했습니다.

점선으로 표시된 chm 그래프를 따라 움직이는 패치의 chm 그래프와 강도 프로파일은 효모 원형질막의 유사한 방식으로 잔디 프랩으로 표시됩니다. TPAs PMA 1은 효모 원형질막 단백질의 느린 재배열을 밝혔으며, 이는 발달 후 전체 세포 표면을 덮는 도메인과 같은 네트워크로 분포합니다. 이 기술은 박테리아 세포 생물학 분야의 연구에서 BA subtilis의 세포벽 합성 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 효모 및 박테리아와 같은 미생물의 잔디 이미지를 획득하는 방법과 이 기술이 피질 단백질의 동적 특성을 연구하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 잘 이해하게 될 것입니다.