미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

본 절차의 전반적인 목표는 세포벽이 있는 미생물의 고품질 전반사 형광 또는 TIRF 이미지를 획득하는 것입니다. 이를 위해 먼저 커버슬립과 세포를 준비합니다. 두 번째 단계는 최적의 이미지 품질을 위해 현미경 설정을 정밀하게 정렬하는 것입니다.

다음으로, 이미지 또는 동영상을 획득하기 위해 적절한 입사각, 각도 및 이미징 조건을 선택합니다. 마지막 단계는 획득한 이미지의 이미징 후 처리 과정입니다. 최종적으로, turf microscopy는 세포 피질에서의 단백질 국소화 역학을 연구하는 데 사용됩니다.

기존의 광학 현미경이나 공초점 현미경과 같은 기술과 비교했을 때 이 기법의 주요 장점은 이미지 대비가 매우 높아 촬영 시간을 단축하고 낮은 광량에서도 관찰이 가능하다는 점입니다. 따라서 이 방법은 단백질의 측면 분리 기전이나 막 단백질의 이동성과 같이 세포막 연구 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. TIRF 현미경용 커버 슬립은 사용 전에 먼지 입자를 깨끗이 제거해야 합니다.

Turf는 오염된 커버슬립의 먼지로 인해 발생하는 배경 신호에 민감합니다. 따라서 커버슬립 세척 절차를 시작하려면 배경 신호가 적은 세척된 커버슬립이 필요합니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 뚜껑이 있는 세라믹 홀더에 넣으십시오.

다음으로, 유리 용기에 1 M 수산화나트륨을 채웁니다. 이 수산화나트륨은 여러 번 재사용할 수 있습니다. 커버슬립이 담긴 세라믹 홀더를 수산화나트륨에 넣고, 천천히 지속적으로 회전시키며 2시간 동안 커버슬립을 배양합니다.

2시간 후부터 커버슬립이 불투명해지므로 8시간 이상 배양하지 마십시오. 느린 속도로 계속 회전시키며 증류수로 5분씩 2회 커버슬립을 세척하고, 세척된 커버슬립은 100% ethanol로 채운 세라믹 홀더에 보관하십시오. turf microscopy를 위한 bacillus subtlest 세포를 준비하려면, 적절한 성장 배지 5 mL에서 OD 600이 0.01~0.05가 되도록 희석한 후 지수 성장기까지 배양하십시오. 합성 배지에서 1.25% aros를 준비하려면, 1.5 mL 플라스틱 튜브에서 aros 분말을 95 °C로 녹인 다음 72 °C의 히팅 블록에 보관하십시오.

슬라이드 중앙에 aros를 한 작은 방울 떨어뜨리고, 다른 슬라이드로 aros를 눌러 평평한 패드 형태로 만든 후 최소 2분이 지나면 슬라이드를 조심스럽게 분리합니다. 마이크로 원심분리기를 사용하여 500 µL의 bacillus subtlest 세포를 12,000 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 50 µL의 배지에 재현탁합니다.

2~4 µL의 세포를 aros 패드 중앙에 추가합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 에탄올이 채워진 용기에서 세척된 커버슬립을 꺼내 압축 공기로 건조시킵니다. 커버슬립을 샘플 위에 조심스럽게 덮습니다.

현미경 관찰 전 세포가 가라앉을 때까지 최소 2분 동안 기다립니다. 장기 이미징의 경우, 가열된 바세린, 라놀린 및 파라핀 혼합물 또는 Val app으로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. Turf 현미경 관찰을 위해 Saccharomyces visi 세포를 준비하려면, 사전 배양액을 희석하고 적절한 배지에서 최소 5시간 동안 배양합니다.

지수 성장기에 도달하면, 에탄올이 채워진 용기에서 커버슬립을 꺼내 피펫 스프레더와 가압 공기를 사용하여 건조시킵니다. 커버슬립 위에 5 µL의 Con A 용액을 떨어뜨린 후 가압 공기로 건조시킵니다. Con A는 효모 세포벽의 탄수화물에 결합하여 효모 세포를 고정시킵니다.

다음으로, 효모 세포 현탁액 4.5 µL를 코팅된 커버슬립의 한쪽으로 옮깁니다. 커버슬립의 샘플 면이 아래로 향하게 하여 현미경 슬라이드 위에 조심스럽게 올리는데, 이때 한쪽 가장자리부터 시작하여 천천히 내려놓습니다. 이렇게 하면 기포 형성을 방지할 수 있습니다.

현미경 관찰 전 세포가 가라앉을 때까지 최소 2분 동안 대기하고, 장기 이미징을 위해 커버슬립의 가장자리를 val app으로 밀봉합니다. 이 비디오에 제시된 모든 실험은 Olympus 100 x 1.45 NA 대물렌즈가 장착된 완전 자동화 IMEX 스탠드 기반의 맞춤형 turf 설정에서 수행되었습니다. 사용된 광원은 488 nanometers 및 561 nanometers 파장의 75 milliwatt 다이오드 펌핑 고체 레이저(DPSS 레이저)입니다.

Turf 각도 및 형광. 광퇴색(photobleaching) 또는 FRAP 위치 이후의 회복은 두 개의 갈바노미터를 통해 즉각적으로 조정할 수 있습니다. 세 번째 갈바노미터는 epi, 형광, FRAP 및 turf 모드 간의 전환에 사용됩니다.

라이브 획득 소프트웨어에서 직접 제어되는 갈바노미터를 통해, EM CCD 카메라와 카메라 전면의 2배 확대 렌즈로 수집된 터프 이미지 내 추적 객체의 국소화 역학을 간단히 측정할 수 있습니다. 획득 과정 또한 라이브 획득 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 레이저를 사용하기 전, 레이저 안전 고글을 착용하고 터프 모드에서 레이저를 천장에 투사한 뒤, 레이저가 직선이 되도록 0도 위치를 보정하십시오.

최적의 조정을 거쳐 레이저 스폿을 최소 크기로 초점을 맞추는 것을 목표로 하며, 레이저 프로파일은 대략적인 원형의 명확한 스폿 형태를 이루어야 합니다. 매 세션 시작 전에 보정을 수행하십시오. 최적의 이미지 품질을 얻기 위해서는 터프 현미경(turf microscope)의 정렬이 이 절차의 성공에 매우 중요합니다.

최적의 이미지 품질을 얻기 위해서는 이미지 획득을 위한 정확한 입사각, 각도 및 파라미터를 세심하게 조정해야 합니다. 이미지 획득을 시작하려면 명시야 조명을 사용하여 세포의 위치를 확인하십시오. 적색 LED는 유의미한 광손상을 유발하지 않으므로 특히 유용합니다.

레이저 조명으로 전환하고 선택한 형광체의 여기(excitation)에 적합한 레이저와 필터 조합을 선택하며, 이때 굴절각이 임계각 미만인지 확인하십시오. 그렇지 않으면 GFP 융합 단백질에서 발생하는 신호가 검출되지 않습니다. 커버슬립을 향하고 있는 세포의 측면인 세포의 상단 부분을 찾으십시오.

레이저 빔의 입사각을 신호가 사라질 때까지 점진적으로 증가시킨 다음, 세포 표면에서 형광이 다시 나타나는 지점까지 각도를 천천히 감소시킵니다. 표면의 최적 위치를 위해 Z 초점을 다시 조정하십시오. 허용 가능한 Turf 각도는 이 효모 단백질 예시에서 보는 바와 같이 세포 가장자리에 흐릿한 헤일로가 생성되지 않는 각도입니다.

왼쪽 상단에서 오른쪽 하단으로 입사각을 줄이며 촬영한 PMA one GFP 이미지입니다. 이미지를 보면 임계각에서 신호가 갑자기 소실되고, 구조 정보와 신호 대 잡음비(signal to noise ratio)가 점진적으로 감소하는 것을 확인할 수 있습니다. 다이내믹 레인지를 최대화하려면 레이저 강도와 카메라 게인을 조정하십시오. 일반적으로 매우 낮은 신호를 높은 신호 대 잡음비로 검출하는 데는 E-M-C-C-D 카메라가 최적입니다.

터프 현미경(Turf microscopy)은 높이의 미세한 차이에 매우 민감합니다. 커버슬립의 높이 차이로 인해 동시에 촬영할 수 있는 세포의 수가 소수로 제한될 수 있습니다. 형광 비드의 고농도 현탁액을 촬영한 이 이미지는 시야의 일부만 초점이 맞는 불균일한 시야의 예시입니다.

따라서 세포 크기가 작은 경우, 획득 영역을 선택한 대상이 포함된 하위 영역으로 줄이는 경우가 많습니다. 이중 색상 터프(turf) 실험의 경우, RFP-GFP 쌍의 형광체 블리드스루(bleed through)를 최소화해야 합니다. RFP는 488 nanometer 광원에 의해 약하게 여기되므로 별도의 방출 필터를 사용하십시오.

블리드 스루(bleed through)와 이중 색상 이미징을 방지하기 위한 전형적인 워크플로우가 여기에 제시되어 있습니다. 서로 다른 필터 세트로 세포를 이미징한 후, 형광 비드를 사용하여 이미지를 디컨볼루션하고 정렬한 다음 병합합니다. 분석 시 이미지 품질에 영향을 미치는 중요한 파라미터는 레이저 정렬과 깨끗한 대물렌즈입니다. 레이저를 정렬하고 터프(turf) 이미징에 사용되는 Z 위치에 초점을 맞춘 후, 시료를 제거하고 대물렌즈의 모든 오일을 닦아내십시오.

잔류 오일은 레이저 광의 회절과 빔 프로파일의 스펙클을 유발할 수 있습니다. 터프 현미경(Turf microscopy)은 박테리아 세포 내 actin 상동체와 세포벽 효소의 분포를 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. 이 대표 결과에서는 actin 상동체 MBL 또는 트랜스펩티다아제(transpeptidase) PBPH의 GFP 융합 단백질을 발현하는 bacillus subtles 세포를 터프 및 일반 에피 형광 현미경으로 촬영하였습니다.

여기의 이미지들은 운동성이 있는 MBL 패치가 차지하는 영역을 나타내기 위해 시계열의 평균 투영물을 표현한 것입니다. 이는 서로 다른 이미징 모드로 모니터링되었습니다. 오버레이 이미지의 파란색 외곽선은 명시야 이미지에서 시각화된 세포 경계를 나타냅니다.

매주 발현되는 트랜스펩티다제 PBPH는 에피 형광(epi fluorescence)으로는 거의 보이지 않지만, turf로는 명확하게 구별되는 피질 패치에 국소화됩니다. 감소된 침투력은 화살표로 표시된 SEPTA에서 P-B-P-H-G-F-P 신호를 통해 가장 잘 관찰할 수 있으며, 이는 에피 형광에서는 선으로 나타나지만 turf에서는 점으로 나타납니다. 다음 이미지 세트는 Saccharomyces visi의 TOR 복합체 구성 요소인 bit 61에 대한 에피 형광과 turf 조명을 비교하여 보여줍니다.

이 단백질은 약하게 발현되며, 패치당 단 몇 개의 단백질 복제본만 포함하는 작은 피질 패치를 형성합니다. epi 형광 이미지에서는 강한 배경 노이즈로 인해 소수의 패치만 보이지만, turf에서는 매우 우수한 신호 대 잡음비로 패치를 촬영할 수 있습니다. 가우시안 또는 미디언 블러 처리된 이미지의 감산과 같은 다양한 이미지 처리 단계를 통해 이미지 대비를 추가로 개선할 수 있으며, 국소 배경 감산을 통해 노이즈를 제거하고 고강도 구조를 선명하게 만들 수 있습니다.

이는 종종 미세 구조의 손실과 고강도 영역의 과도한 증폭이라는 대가를 수반합니다. 화살표로 표시된 바와 같이, 더 우수한 절차는 2D 디컨볼루션(deconvolution)이며, 이는 무료 또는 상용 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행할 수 있습니다. 디컨볼루션 후의 대비 증가 결과는 원본 이미지와 디컨볼루션된 이미지가 교차로 나타나는 GFP RA 2의 타임랩스 영상을 통해 확인할 수 있습니다.

GFP RA2는 빠르게 이동하는 단백질이므로, 그 동적 거동을 분석하기 위해서는 빠른 획득 시간이 중요합니다. 효모 단백질인 FET 3G FP와 PMA 1 RFP의 타임랩스 이색 영상에서 알 수 있듯이, 공국소화 분석에서는 이미지 프로세싱이 특히 중요합니다.

처음 10개 프레임은 원본 이미지를 나타내며 나머지 프레임은 디컨볼루션된(devolved) 이미지입니다. 분석을 가능하게 하려면 대조도를 극대화하고 흐릿한 원본 이미지를 선명하게 하는 것이 매우 중요합니다. Turf와 frap의 결합은 피질 단백질의 역학을 연구하는 데 강력한 수단을 제공합니다. G-F-P-M-B-L을 발현하는 B subtlest 세포에 이 기술을 적용한 결과, MBL 포함 패치의 관찰된 운동성에 대한 메커니즘으로 트레드밀링(treadmilling) 가능성이 배제되었습니다.

이동하는 패치의 chm 그래프와 점선으로 표시된 chm 그래프를 따른 강도 프로필은 효모 세포막의 turf frap과 유사한 방식으로 나타납니다. TPAs PMA one은 효모 세포막 단백질의 느린 재배열을 드러냈으며, 이러한 단백질들은 발달 후 세포 표면 전체를 덮는 네트워크 형태의 도메인으로 분포합니다. 이 기술은 박테리아 세포 생물학 분야의 연구자들이 B. subtilis의 세포벽 합성 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청하고 나면 효모 및 박테리아와 같은 미생물의 turf 이미지를 획득하는 방법과, 이 기술이 피질 단백질의 동적 특성을 연구하는 데 어떻게 도움이 되는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.