Name: 미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-01T12:03:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 배우세요 총내부반사형광현미경을 사용하여 세포벽을 가진 미생물의 단백질 역학을 연구하는 방법을. 이 기술은 세포피질에서 단백질 위치 변화를 고해상도로 관찰하여 미생물 세포생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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<ol><li>Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+inflection+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Total internal inflection fluorescent microscopy.</a> J. Microsc. 129, 19-28 (1983).</li>
<li>Axelrod, D., Omann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microscopy.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Dominguez-Escobar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+movement+of+MreB-associated+cell+wall+biosynthetic+complexes+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria.</a> Science. 333, 225-228 (2011).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+it%2C+switch+it%2C+bounce+it%2C+pull+it%3A+using+lasers+to+reveal+plant+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics.</a> J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).</li>
<li>Uchida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+and+absolute+configuration+of+avenolide%2C+extracellular+factor+in+Streptomyces+avermitilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis.</a> J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).</li>
<li>Yu, H., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics%3A+Generating+randomness+by+formin%28g%29+and+moving%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving.</a> Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).</li>
<li>Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+driven+by+formins+and+myosin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V.</a> J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).</li>
<li>Berchtold, D., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TORC2+plasma+membrane+localization+is+essential+for+cell+viability+and+restricted+to+a+distinct+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).</li>
<li>Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+single-molecule+imaging+of+plant+fluorescent+proteins+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+%28TIRFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

TIRF 현미경 이미지 주변 단백질에 대한 선택의 기술입니다. 지극히 미미한 필드의 낮은 침투 깊이 노이즈 비율 매우 좋은 신호로 연결 및 높은 프레임 속도, 또는 아주 약하게 표현 단백질의 영상과 데이터 수집을 허용 초점 광의 밖으로 최소화합니다. 높은 콘트라스트와 높은 프레임 속도의 결합 TIRF 현미경 cortically화된 단백질 이미징 spatio-시간적 역학을위한 완벽한 도구가 있습니다. 흥미롭게도 많은 미생물을 둘러싼 두꺼운 세포 벽이 TIRF에 의해 주변 단백질의 이미징을 방해하지 않습니다. 사실, 지극히 미미한의 실제 생성은 매우 가능성이 세포 벽 및 플라즈마 막 5,10 사이의 인터페이스에서 발생합니다. 비상구가 세포에도 8 효모 세포에서 몇 군데 수있는 넓은 표면적을 설명할 수있는 세포 벽, 함께 빛의 전파으로 이어질 수있는 빛의 반사. TIRF IM의 최적의 품질에 대한나이는 잘 보정된 현미경 시스템을 가질 중요한 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 도구 / 시약의 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 궤도 흔드는 </td><td> 도구 </td><td> UniEquip </td><td> UNITWIST 3 차원 로커 흔드는 </td></tr><tr><td> TIRF 현미경 </td><td> 까지 </td><td></td><td> 사용자 정의 설치 </td></tr><tr><td> 유리 용기 </td><td> 도구 </td><td> Vitlab </td><td> 340-232880353 </td></tr><tr><td> 세라믹 염색법 걸이 </td><td> 도구 </td><td> 토마스 문화. </td><td> 8542E40 </td></tr><tr><td> Concanavalin </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> L7647 </td></tr><tr><td> Coverslips # 1 (18 X 18mm) </td><td> 현미경 </td><td> Menzel Gläser </td><td> BB018018A1 </td></tr><tr><td> 현미경 슬라이드 </td><td> 현미경 </td><td> Menzel G레이저 </td><td> AA00000102E </td></tr><tr><td> 집중 훈련 오일 </td><td> 현미경 </td><td> 자이스 혈구 </td><td> Immersol 518F </td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td></tr><tr><td> FluoSpheres </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> F8795 </td></tr></tbody></table>

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF 현미경은 체외에서 형광 분자의 spatio-현세의 역학을 연구하는 강력한 이미징 기술로와 세포에게 1 생활에서 등장했다. 빛이 특성 중요한 각도 (즉 가까이 경계와 평행하게있는 위하여)보다 큰 각도로 낮은 굴절률을 가진 중간에 높은 굴절률을 가진 매체에서 전달했을 때 총 내부 반사의 광학 현상이 발생합니다. 모든 표시등이 같은 상황에서 다시 반사되어 있지만, 지극히 미미한 파도가 만들어지고 그 전체 거리와 함께 기하 급수적으로 붕괴하고, 전용 인터페이스를이 근처 100-200 nm의있는 샘플 영역을 침투 경계를 따라 전파합니다. 우수 축 해상도를 제공하는 이외에 초점 fluorophores의 밖으로의 감소 여기는 잡음 비율로 매우 높은 신호를 생성하고 2,3을 photobleaching의 유해한 영향을 최소화합니다. widefield 기술이기 때문에, TIRF 또한 빠르게 이미지를 교류 할 수 있습니다기반 공촛점 설정을 스캔 가장 이상 quisition. 언뜻 TIRF의 낮은 침투 깊이는 종종 두꺼운 세포 벽에 둘러싸인 세균과 곰팡이 세포의 이미징과 호환되지 않는 것 같습니다. 반대로, 우리는 효모와 박테리아 세포의 세포 벽 실제로 TIRF의 가용성을 개선하고 관찰할 수있는 구조 4-8의 범위를 늘릴 것으로 나타났습니다. 많은 세포 과정에 따라서 직접적으로 종종 강력한 유전자 조작 기술을 제공하고 소규모, 단일 셀 미생물에 TIRF 액세스할 수 있습니다. 이것은 우리가 단백질 상호 작용과 활동의 속도론 직접 살아있는 세포에서 평가 수있는 생체내 생화학 실험에서 수행할 수 있습니다. 우리는 여기서 Saccharomyces cerevisiae의 또는 바실러스 subtilis 세포에 대한 고품질의 TIRF 이미지를 얻기 위해 필요한 각 단계를 설명합니다. 우리는 affe 수있는 다양한 문제점을 지적중부 표준시 TIRF 세포의 형광 프로브의 시각화와 여러 응용 예제와 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 TIRF 이미지가 더욱 안정적인 영상 복원 기법을 사용하여 향상시킬 수있는 방법을 보여줍니다.

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

TIRF 현미경 분석법은 인비트로(in vitro) 및 살아있는 세포 내에서 형광 분자의 시공간적 역학을 연구하는 강력한 이미징 기술로 부상했습니다1. ...

본 절차의 전반적인 목표는 세포벽이 있는 미생물의 고품질 전반사 형광 또는 TIRF 이미지를 획득하는 것입니다. 이를 위해 먼저 커버슬립과 세포를 준비합니다. 두 번째 단계는 최적의 이미지 품질을 위해 현미경 설정을 정밀하게 정렬하는 것입니다.다음으로, 이미지 또는 동영상을 획득하기 위해 적절한 입사각, 각도 및 이미징 조건을 선택합니다. 마지막 단계는 획득한 이미지의 이미징 후 처리 과정입니다. 최종적으로, turf microscopy는 세포 피질에서의 단백질 국소화 역학을 연구하는 데 사용됩니다.기존의 광학 현미경이나 공초점 현미경과 같은 기술과 비교했을 때 이 기법의 주요 장점은 이미지 대비가 매우 높아 촬영 시간을 단축하고 낮은 광량에서도 관찰이 가능하다는 점입니다. 따라서 이 방법은 단백질의 측면 분리 기전이나 막 단백질의 이동성과 같이 세포막 연구 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. TIRF 현미경용 커버 슬립은 사용 전에 먼지 입자를 깨끗이 제거해야 합니다.Turf는 오염된 커버슬립의 먼지로 인해 발생하는 배경 신호에 민감합니다. 따라서 커버슬립 세척 절차를 시작하려면 배경 신호가 적은 세척된 커버슬립이 필요합니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 뚜껑이 있는 세라믹 홀더에 넣으십시오.다음으로, 유리 용기에 1 M 수산화나트륨을 채웁니다. 이 수산화나트륨은 여러 번 재사용할 수 있습니다. 커버슬립이 담긴 세라믹 홀더를 수산화나트륨에 넣고, 천천히 지속적으로 회전시키며 2시간 동안 커버슬립을 배양합니다.2시간 후부터 커버슬립이 불투명해지므로 8시간 이상 배양하지 마십시오. 느린 속도로 계속 회전시키며 증류수로 5분씩 2회 커버슬립을 세척하고, 세척된 커버슬립은 100% ethanol로 채운 세라믹 홀더에 보관하십시오. turf microscopy를 위한 bacillus subtlest 세포를 준비하려면, 적절한 성장 배지 5 mL에서 OD 600이 0.01~0.05가 되도록 희석한 후 지수 성장기까지 배양하십시오. 합성 배지에서 1.25% aros를 준비하려면, 1.5 mL 플라스틱 튜브에서 aros 분말을 95 °C로 녹인 다음 72 °C의 히팅 블록에 보관하십시오.슬라이드 중앙에 aros를 한 작은 방울 떨어뜨리고, 다른 슬라이드로 aros를 눌러 평평한 패드 형태로 만든 후 최소 2분이 지나면 슬라이드를 조심스럽게 분리합니다. 마이크로 원심분리기를 사용하여 500 µ

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여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

출처: Daniele, F., et. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 평가하기 위한 al TIRFM 및 pH 민감성 GFP 프로브: 세포 이미징 및 데이터 분석. J. Vis. 특급. (2015). 이 동영상은 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 형광단 태그가 지정된 시냅스 소포를 시각화하는 인간 신경모세포종 세포의 이미징을 보여줍니다. 세포는 먼저 형광 모드에서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 내부 전반사를 달성하기 위해 조정이 이루어지며, 멤브레인 근처의 형광단을 선택적으로 여기시키는 소멸파를 생성합니다. TIRF 이미징 전에 획득 매개변수가 구성되고 샘플링 주파수가 설정됩니다.

전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 피질 뉴런의 엑소 사이크 이벤트를 시각화하기 위한 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 보여줍니다. pH에 민감한 녹색 형광 단백질(GFP) 마커는 소포 융합 시 형광을 발하며, 선택적 TIRF 여기는 타임랩스 이미징에서 막-근위 엑소사이토시스를 포착합니다.

엑소 세포 사건의 시각화를 위한 전반사 형광 현미경 

T 세포 면역학적 시냅스에서 필라멘트 액틴의 유속과 방향성을 조사하기 위해 라이브 셀 초해상도 이미징을 내부 전반사 형광과 결합하고 시공간 이미지 상관 분광법으로 정량화합니다.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

이 프로토콜은 시험관 내 표면 분석법을 사용하여 미세 소관의 무, 고대비, 고속 이미징을 위한 표준 형광 현미경에 간섭 반사 현미경 을 구현하기 위한 가이드입니다.

마이크로소관의 라벨이 없는 고속 이미징을 위한 간섭 반사 현미경 검사법 구현

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

배우세요 총내부반사형광현미경을 사용하여 세포벽을 가진 미생물의 단백질 역학을 연구하는 방법을. 이 기술은 세포피질에서 단백질 위치 변화를 고해상도로 관찰하여 미생물 세포생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

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