전반사(Total Internal Reflection) 형광 현미경을 사용한 세포 이미징

완충액에 인간 신경모세포종 세포가 부착된 유리 커버슬립이 포함된 덮개가 있는 덮개가 있는 덮개가 있는 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 설정으로 시작합니다.

이 세포는 시냅스 소포막에 특이적인 형광단을 발현합니다.

epifluorescence 모드에서 이미징할 셀을 선택합니다.

TIRF 모드에서 대물렌즈를 통해 샘플에 레이저를 비추면 덮개에 한 점으로 나타납니다.

굴절률이 높은 유리 커버슬립과 굴절률이 낮은 샘플 사이의 경계면에서 임계각을 초과하도록 각도를 조정하여 가는 선으로 보이는 전체 내부 반사(TIR)를 유발합니다.

TIR은 가장 가까운 막에서 형광단을 여기시키는 소멸파를 생성합니다.

방출된 형광은 대물렌즈에 의해 수집되고 카메라에 의해 캡처됩니다.

커버슬립 근처의 세포막의 고대비 이미지를 위해 미세 조정합니다.

획득 설정을 최적화하여 광표백을 최소화하고 샘플링 주파수를 설정합니다.

융합된 시냅스 소포를 시각화하기 위해 TIRF 이미징을 시작합니다.

epifluorescence 모드에서 커버슬립에 초점을 맞추고 챔버 중앙에 배치된 형질감염된 세포를 선택합니다. 소프트웨어 제어에 따라 라이브 모드에서 잔디 조명으로 전환합니다. 잔디 구성을 설정하려면 샘플 커버의 대물렌즈에서 나오는 빔의 위치를 확인하십시오. 빔이 오브젝티브 렌즈 (objective lens) 의 중앙에 위치하면 잔디 샘플 커버 중앙에 스팟이 보이고 세포는 epifluorescence 모드로 이미지화됩니다.

임계각에 도달하려면 잔디 슬라이더의 각도 조정 나사를 사용하여 초점이 맞춰진 지점을 Y 방향으로 이동합니다. 빔이 임계각보다 큰 각도로 샘플 평면에 수렴하면 스폿이 사라지고 샘플 커버 중앙에 직선적이고 얇고 집중된 선이 분명합니다. 잔디 각도를 미세 조정하려면 셀 샘플을 사용하십시오.

비디오에서 형광 이미지를 시청하십시오. 이 단계에서는 낙후형광과 같은 이미지가 여전히 보입니다. 잔디 상태가 될 때까지 나사를 부드럽게 움직입니다. 여기에서는 셀의 하나의 광학 평면에만 초점이 맞춰져 대비가 높은 평면 이미지를 생성합니다.

샘플 이미징을 수행하려면 단일 채널 타임랩스 실험을 설정합니다. 적절한 노출 시간은 40밀리초에서 80밀리초 사이입니다. 1 또는 2 Hz 샘플링 주파수로 이미지를 획득합니다.