의 정의 Aspergillus 니제르 형태론

이 방법은 사상균(filamentous fungus, aspergillus, Niger)의 미세입자 의존적 형태학적 구조를 생성하고 특성화하여 진균 형태학을 생산성과 연관시킵니다. 3리터 교반 탱크, 생물 반응기에서 72시간 동안 미세 입자가 있거나 없는 8개의 니제르를 배양하여 특정 생산성을 계산합니다. 정의된 시점에 샘플을 채취하여 바이오매스, 건조 중량 및 거부 프럭토 sase 활성을 측정합니다.

72시간 후 현미경으로 곰팡이 형태를 검사하고 디지털 이미지 분석으로 특성화합니다. 그런 다음 이미지 분석의 관련 매개변수를 특정 생산성과 수학적으로 상관관계가 있는 형태 번호에 결합합니다. 궁극적으로 이 방법은 사상체 미생물의 형태 형성에 대한 더 나은 이해를 위해 aspergillus Niger의 형태를 정확하게 생성하고 종합적으로 특성화할 수 있습니다.

Aspergillus Nigel은 수십 년 동안 생명 공학 분야에서 중요한 산업 작업마입니다. 아스퍼, 나이젤 및 관련 종의 가장 흥미롭고 종종 통제할 수 없는 특성 중 하나는 배양 조건에 따라 조밀한 구형 펠릿에서 점성 균사체에 이르기까지 복잡한 형태가 있다는 것입니다. 우리 절차의 주요 장점은 미립자를 추가함으로써 이제 공정 요구 사항에 맞게 특별히 곰팡이 형태를 조정할 수 있다는 것입니다.

지금까지, 진균 형태학의 이러한 맞춤화를 위한 다른 방법은 설명되지 않았습니다. 이 방법은 사상 미생물 배양에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 산업 응용 분야의 경우 곰팡이 형태를 제어하고 우물과 제대로 생성되지 않는 곰팡이 형태를 구별하는 것이 중요하기 때문입니다.

당사의 프로토콜은 진균 형태학의 바람직한 맞춤화 및 특성화를 위한 수단을 제공합니다. 이 방법은 aspergillus Nigel 형태에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 페니실리움 또는 스트렙토 균주와 같은 다른 필라멘트 미생물에도 적용할 수 있습니다. 동봉된 프로토콜에 자세히 설명된 대로 멸균 배양을 위한 4개의 바이오리액터를 설정합니다.

마이크로입자 첨가를 기반으로 한 텍스트, 다양한 형태로 aspergillus 니제르를 재배합니다. 72시간 후 50밀리리터를 옮깁니다. Falcon 튜브에 담긴 배양 육수 샘플.

바이오매스 샘플은 건조제에서 건조시킨 후 최소한 중복으로 채취하고 마이크로 스케일로 셀룰로오스 필터의 무게를 측정합니다. 워터젯 진공 펌프가 연결된 buchner 깔때기에 필터를 놓고 10ml의 샘플을 필터링한 다음 10ml를 필터링합니다. 바이오매스에서 매체 화합물을 제거하기 위한 탈이온수는 필터를 중간에 한 번 주름을 만듭니다.

유리 페트리 접시에 넣고 무게가 일정해질 때까지 구획 건조기에 넣습니다. 필터를 건조제로 옮기고 식히십시오. 그런 다음 무게를 측정하십시오.

포도당 산화효소 분석에 대한 중량, 필터의 차이 및 시료 부피에 따른 후속 분할을 계산하여 리터당 바이오매스 건조 중량을 계산합니다. 주사기 패스(1.5ml)를 사용하여 얼음에 샘플을 보관하십시오. 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 반응 튜브로 배양 현탁액 베타 프럭토 SASE 분석을 수행합니다.

세심하게 통계적 견고성을 위해 두 개의 삼중 샘플로 성공을 보장합니다. 분석을 시작하려면 20마이크로리터 샘플을 테스트 튜브에 추가하여 자당과 포도당의 pH 및 온도 의존적 절단을 제어하고 20마이크로리터 샘플 대신 20마이크로리터 탈이온수를 사용합니다. 또한 각 샘플에 대해 분석을 통해 배양 배지의 잔류 포도당에 대한 음성 대조군을 준비합니다.

20 마이크로 리터의 열 비활성화 샘플은 자당에서 포도당으로의 반응을 시작하려면 200 마이크로 리터의 1.65 몰 자당 용액을 첨가하십시오. pH 5.4 - 20 마이크로리터 샘플에서 모든 반응 튜브를 섭씨 40도의 가열 블록에서 20분 동안 배양합니다. 얼음 위에서 튜브를 냉각시킨 후 섭씨 95도에서 10분 동안 가열하여 반응을 멈춥니다.

필요한 경우 원심분리기 샘플, 측정된 흡수가 보정된 값 범위에 있도록 분석을 위한 샘플을 희석합니다. 이제 각 반응에 대해 2마이크로리터의 샘플을 마이크로타이터 플레이트에 추가합니다. 샘플 측정을 3회에 걸쳐 잘 수행합니다.

또한 1밀리몰에서 15밀리몰에 이르는 10개의 포도당 용액에 대한 표준 곡선을 준비합니다. 영점 보정을 위해 2마이크로리터의 탈이온수를 사용하십시오. 다음으로, 각각에 200마이크로리터의 시약 용액을 추가합니다.

실온에서 10분 동안 잘 배양합니다. 96웰 일출 마이크로플레이트 리더와 Magellan 데이터 검색 소프트웨어를 사용하여 450나노미터에서 흡수를 측정합니다. 스프레드시트로 결과 차트를 열고 표준 곡선 보정 선을 구성합니다.

각 샘플에 대한 활동을 계산합니다. 그런 다음 표본 활성에서 적절한 음성 대조 물질의 값을 빼서 베타 프럭토 tase 활성을 계산합니다. 마지막으로, 바이오매스 건조 중량과 베타 프럭토 sase 활성을 고려분해하여 특정 생산성을 계산합니다.

플라스틱 페트리 접시에 3ml의 배양 현탁액을 놓고 생리학적 염화나트륨 용액으로 희석하여 형태학적 구조를 분리합니다. 현미경 사진의 품질은 매우 중요합니다. 후속 이미지 분석의 경우 희석 단계에서 생성에 주의를 기울여야 합니다.

통합 카메라가 있는 현미경 아래에 페트리 접시를 놓습니다. 샘플당 약 100개의 형태학적 구조 이미지를 획득하고 저장하여 각 이미지에 하나 이상의 물체가 완전히 그려지도록 합니다. 다른 반응기의 샘플이 포함된 접시로 동일한 방식으로 계속하여 매번 새로운 이미지를 획득합니다.

서로 다른 양의 첨가된 활석 분말로 성장한 서로 다른 반응기에서 나온 샘플의 다양한 형태학적 성장 형태에 주목하십시오. 그런 다음 이미지 처리 프로그램에서 동일한 샘플의 모든 이미지를 엽니다. 이미지 J.프로세스 도구를 사용하여 바이너리를 만듭니다.

전체 이미지 시리즈에 명령을 적용하기 위해 이미지를 흑백으로 변환합니다. 매크로 코드를 사용하여 배율 막대가 포함된 그림 중 하나를 엽니다. 축척 막대를 가로지르는 직선을 구성하여 2000미크론에 해당하는 픽셀 수를 결정합니다.

분석 도구를 선택하고 측정을 설정한 다음 형상 계수, 페럿, 지름 면적 및 둘레를 선택합니다. 매크로 코드를 사용하여 일련의 이미지를 처리합니다. 이제 형상 계수 값의 결과를 차트로 표시하는 스프레드시트를 엽니다.

각 이미지에 대해 한 샘플의 모든 이미지를 사용하여 각 이미지의 형태학 번호를 계산합니다. 형태소 번호의 평균값을 계산합니다. 그래프 작성 및 데이터 분석 프로그램을 사용하여 특정 생산성과 함께 형태학 수를 플롯합니다.

활석 미량 입자의 농도 증가를 통한 수학적 회귀로 수학적 관계를 결정합니다. 여덟 니제르 SKAN 10 15. 형태학은 실제 펠릿 형태학에서 분산 또는 내 형태학으로 변경되며, 예상대로 펠릿 형태학은 표준 조건에서 나타납니다.

흥미롭게도, 균사체 형태학은 활석 미립자 1리터당 10g을 배지에 보충하여 만들어집니다. 동시에 Beto Fructo tase의 활성이 약 3배 증가하면 활석 분말 1리터당 1g 또는 3g을 보충하면 자동 이미지 분석에 의해 결정된 매개변수를 사용하여 과당 활성이 두 배로 증가한 분산된 형태가 생성됩니다. 미립자 의존적 형태학은 형태학에 의해 종합적으로 설명될 수 있습니다.

번호 노트, 매끄러운 펠릿의 완벽하게 둥근 것은 현미경 이미지에서 그러한 입자에 대해 완벽한 원으로 나타납니다. 형태 번호는 표준 조건에서 1에 가까운 값을 갖습니다. 반응기 1의 형태는 약 0.8의 형태 수를 나타냅니다.

반응기 4의 형태는 리터당 10g입니다. 활석 분말은 약 0.1의 형태 수를 특징으로합니다. 활석 분말 농도가 리터당 1g과 3g인 반응기 2와 3의 형태 번호는 이러한 극단 사이에 있으며 분산된 형태를 보여줍니다.

미립자 의존성 형태학은 베타 과당 세포의 생산성과 밀접한 관련이 있기 때문에 발달 후 형태, 수 및 생산성에 대한 양호한 수학적 상관관계가 있습니다. 이 기술은 생명 공학 분야의 연구자들이 곰팡이 형태학, 특히 생산성과의 관계를 더 깊이 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 특정 형태학적, 곰팡이 교차 유형의 상세한 생성 절차에 따라 사상 미생물 배양의 다른 중요한 측면을 탐구 할 수 있습니다.

예를 들어, 균사체 형태학은 구개 형태학보다 훨씬 더 점성이 있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 프로세스의 전반적인 생산성은 원하는 제품의 문제와 정제를 통해 손상됩니다. 우리의 형태학 번호는 문화, 프로 신학, 그리고 일반적으로 곰팡이 형태학에 대한 우리의 이해를 발전시키는 모델에 관한 모델을 확립하는 데 도움이 될 것입니다.