집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

이 절차의 전반적인 목표는 극저온 동결 벌크 샘플에서 집속 이온 빔 라멜라를 추출하여 cryo TEM용 샘플을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 플런지하여 시료를 액체 질소로 동결하고 극저온 집속 이온 빔 SEM 내부에 장착하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 이온 빔으로 얇은 LA Melo를 잘라내고 냉각된 나노 매니퓰레이터를 사용하여 TEM 그리드로 전송하는 것입니다.

다음으로, TEM 그리드는 전송 스테이션에서 SEM 홀더에서 TEM 홀더로 전송됩니다. 마지막 단계는 추가 분석을 위해 TEM 홀더를 극저온 TEM으로 옮기는 것입니다. 궁극적으로 cryo TEM은 추출된 라멜라의 고해상도 이미지, tomo Grahams 또는 X-ray 맵을 표시하는 데 사용됩니다.

이 기술을 사용하면 광학 현미경 또는 주사 전기 현미경과 같은 다른 현미경으로 분석 장소를 미리 선택하여 투과 전자 현미경에서 최고의 해상도로 연질 물질을 분석할 수 있습니다. Mac cryo Microtomy와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 샘플의 압축 및 def 형성과 같은 준비 아티팩트를 피할 수 있다는 것입니다. 먼저 집속 이온 빔 시료를 위한 두 개의 TEM 그리드를 장착합니다.

SEM 전사 홀더에서 드라이버로 해당 나사를 조여 그리드를 고정하고 셔터를 닫고 표본에 적합한 샘플 스텁을 장착하고 표본의 일부를 추가합니다. 예를 들어, 피펫을 사용하여 평평한 스터브에 물방울을 침전합니다. 그런 다음 SEM 전사 홀더를 진공 전사 장치 또는 VTD에 장착합니다.

슬러싱 스테이션에 액체 질소를 추가하고 펌핑한 후 스테이션을 열고 끓임이 완료되고 슬러시가 다시 얻어질 때까지 SEM 전사 홀더 펌프를 다시 급습하여 동결합니다. 그런 다음 SEM 전사 홀더를 VTD의 진공 챔버로 집어넣고 밀봉합니다. 슬러싱 스테이션과 극저온 준비실을 환기시키십시오 에어록은 외부 에어록을 배출합니다.

그런 다음 VTD 씰을 극저온 준비 챔버 및 펌프의 에어록과 일치시킵니다. 적절한 진공 수준에 도달하면 에어록 핀을 측정하여 VTD와 외부 에어록의 씰을 엽니다. 그런 다음 SEM 전송 홀더를 삽입합니다.

그런 다음 차가운 칼을 사용하여 TEM 그리드 슬롯의 보호 뚜껑을 엽니다. 집속 이온 빔 SEM의 고압을 끄고 내부 에어록을 엽니다. 그런 다음 VTD를 사용하여 SEM 홀더를 시료 챔버로 옮깁니다.

SEM 홀더가 콜드 스테이지에 있으면 밀고 돌려서 VTD를 해제합니다. VTD 로드를 VTD 진공 챔버로 완전히 집어넣고 내부 에어록, 외부 에어록 및 VTD 씰을 닫습니다. 이 시점에서 전구체 가스를 섭씨 24-26도로 가열하고 가스 주입 시스템 또는 GIS 니들을 샘플 표면에서 약 1mm 높이로 배치합니다.

전자빔으로 이미징하는 동안 몇 초 동안 가스 밸브를 엽니다. 그런 다음 저배율에서 1000 피코 암페어 이온 빔을 사용하여 관심 영역 또는 ROI에 대한 침전물을 경화합니다. 경화 후 샘플이 52도로 기울여 표면이 이온 빔에 수직이 되도록 합니다.

밀링. 두 개의 테러리스트 참호. ROI의 양쪽에서 샘플을 다시 0도로 기울이고 이온 빔을 사용하여 라멜라의 측면과 아래쪽을 잘라내고 절단 표시가 전체 라멜라를 통과하도록 합니다.

GIS 바늘이 삽입되면 나노 매니퓰레이터의 끝이 라멜라와 물리적으로 접촉할 때까지, 가급적이면 측면이 될 때까지 조작합니다. GIS 밸브를 몇 초 동안 열고 전자빔으로 연속 이미징하여 극저온 증착을 모니터링합니다. 추가로 1-2 마이크로 미터의 백금 층이 극저온 증착 된 경우, 나노 매니퓰레이터가 라멜라와 접촉하는 지점 주위의 몇 마이크로 미터에서만 백금을 경화 한 후 밸브를 닫으십시오.

그런 다음 높은 이온 빔 전류를 사용하여 라멜라를 제거합니다. 나노 매니퓰레이터를 조심스럽게 움직여 트렌치에서 라멜라를 추출하고 샘플 표면에서 최소 500마이크로미터 위로 이동합니다. 바늘을 집어넣은 후 샘플 스테이지를 몇 밀리미터 낮추고 TEM 그리드 중 하나가 보일 때까지 이동합니다.

그리드의 부착 영역을 작업 위치로 이동하고 GIS 바늘을 삽입합니다. 다음으로, 나노 매니퓰레이터를 조심스럽게 움직여 부착된 라멜라를 TEM 그리드의 부착 영역과 물리적으로 접촉시키고, 가스 밸브를 몇 초 동안 연 다음 추가로 1-2마이크로미터의 백금 층을 극저온 증착하여 라멜라와 TEM 그리드 사이의 접촉 지점 주위 몇 마이크로미터에서만 백금을 경화시킵니다. 그런 다음 높은 이온 빔 전류를 사용하여 나노 매니퓰레이터에서 라멜라를 자릅니다.

샘플을 52도로 기울이고 이온 빔을 사용하여 전자 투명도를 낮추십시오. 건조 질소 가스로 극저온 이송 스테이션을 세척한 후 극저온 이송 TEM 홀더를 극저온 이송 스테이션의 해당 슬롯에 삽입하고 액체 질소를 채웁니다. 그런 다음 스크루 드라이버, TEM 샘플 클램핑 도구 및 핀셋을 액체 질소로 채워진 극저온 컵에 담그고 팁을 원하는 온도로 냉각합니다.

VTD가 외부 에어록과 일치하면 콜드 스테이지를 16mm의 이송 높이로 가져옵니다. 고압을 끈 후 VTD 씰, 외부 에어록, 내부 에어록을 엽니다. 그런 다음 VTD 로드를 사용하여 시계 방향으로 밀고 돌려 SEM 전송 홀더에 고정합니다.

이 시점에서 SEM 전사 홀더를 극저온 준비 챔버로 집어넣습니다. 콜드 나이프를 사용하여 TEM 그리드의 보호 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 VTD 로드를 사용하여 샘플을 VTD close의 진공 챔버로 이동하고 에어록을 밀봉합니다.

그런 다음 외부 에어록을 환기시키고 VTD를 분리합니다. VTD를 극저온 전송 스테이션의 SEM 포트와 일치시킵니다. 건조 질소로 세척하는 동안 스테이션의 핀을 사용하여 VTD의 씰을 열고 SEM 전사 홀더를 극저온 이송 스테이션의 작업자에 밀어 넣습니다.

냉각된 드라이버를 사용하여 뚜껑 중 하나를 열고 해당 나사를 풀어 TEM 그리드를 제자리에 유지합니다. 그런 다음 TEM 그리드를 선택하고 냉각된 핀셋을 사용하여 TEM 홀더에 넣습니다. 그런 다음 TEM 그리드를 TEM 홀더에 고정합니다.

냉각된 육각 링을 사용하여 극저온 이송 TEM 홀더의 셔터를 닫고 펌핑 시스템에서 극저온 이송 스테이션을 분리합니다. TEM 홀더의 스테이션과 히터 컨트롤러를 TEM 근처로 운반하고 다시 연결하십시오. TEM 샘플 스테이지를 음의 70도 기울기로 설정합니다.

다음으로, 건조 질소 가스로 퍼지를 한 번만 하면 에어록의 가장 짧은 펌핑 시간을 설정합니다. 극저온 이송 스테이션에서 TEM 홀더를 제거하고 기울어진 측각계의 첫 번째 단계에 삽입하면 펌핑 주기가 시작됩니다. 사이클이 완료되면 고니오미터와 함께 회전하지 않도록 TEM 홀더를 잡고 고니오미터를 다시 0도로 기울이도록 설정합니다.

그런 다음 측각계를 통해 홀더를 TEM 내부에 완전히 삽입합니다. 마지막으로 극저온 전사 TEM 홀더 도어를 액체 질소로 다시 채웁니다. 이 방법에서는 aspergillus 니제르 포자를 먼저 SEM으로 이미지화하여 추출 부위를 식별합니다.

모든 포자의 단면만으로도 충분하지만, 세포막에서 특정 거리에 있는 특정 세포를 절단하기 위해 마이크로미터 미만의 정밀도로 추출을 위한 ROI를 배치할 수 있습니다. 관심 특징이 확인되면 이온 밀링 중 빔 손상으로부터 샘플을 보호하기 위해 극저온 증착의 첫 번째 단계가 구현되며, 샘플을 52도로 기울인 다음 멜라의 양쪽에 있는 두 개의 트렌치를 스퍼터링합니다. 그런 다음 샘플을 뒤로 기울여 더 밀링하여 벌크에 연결하는 두 개의 작은 브리지만 남깁니다.

냉각된 나노 매니퓰레이터는 멜라와 접촉하고 백금의 또 다른 극저온 증착은 이를 함께 납땜합니다. 작은 연결 브리지는 밀링되고 나노 매니퓰레이터는 라멜라를 TEM 등급 부착 영역 근처로 이동하여 백금의 최종 극저온 증착으로 납땜합니다. 그런 다음 나노 매니퓰레이터는 전자 투명도까지 얇아지는 라멜라에서 분리됩니다.

이온 빔을 통해 라멜라는 고해상도 이미징 분광법, 단층 촬영 및 기타 기술을 사용할 수 있는 TEM으로 전달됩니다. 이 방법은 신경 프로브 또는 뼈 임플란트와 같은 시스템에서 심장 연질 물질 인터페이스를 이해하는 데 기여할 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 아티팩트 3인 cryo TM 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 마이크로미터 미만의 정밀도로 버그 샘플의 특정 영역에서 추출할 수 있습니다.