Name: 집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 학습하세요 집중 이온 빔을 활용한 극저온 투과 전자 현미경 표본 준비 방법으로 연질 생물학적 시료의 고해상도 이미징을 수행하는 기술입니다. 이 기법은 시료 준비 과정에서 발생하는 왜곡을 최소화하여 정확한 분석 결과를 제공합니다.

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이 연구는 FP7 용량 계획 (부여 번호 INFRA-2010-262163)에서 유럽 공동체 연구 인프라에 의해 자금을 조달 QNano 프로젝트 http://www.qnano-ri.eu의 지원을 받았다. 우리는 또한 금융 지원을위한 연구위원회 Formas 감사합니다.

참고 :이 프로토콜에 주어진 모든 매개 변수가 여기에 표시되는 악기와 모델에 대한 유효합니다. 다른 제조업체 나 모델을 사용하는 경우 (텍스트에서 *로 표시) 이러한 매개 변수 중 일부는 다를 수 있습니다. FIB / SEM의 1. 시동 <ol><li> anticontaminator (AC)에 구리 머리 띠를 연결하지 않고도 맞춤형 차가운 nanomanipulator (NM) 팁을 장착합니다. 대신 띠가 선명 단계 (1.2) 동안 충전을 방지하기 위해 절연 포인트 이상 NM의 나머지 부분에 연결되어 있는지 확인하십시오. <ol><li> 높은 진공 및 이미지 NM 팁에 펌프, SEM 실을 닫습니다. </li><li> 끝이 뭉툭한 각부 또는 이전 사용에 의해 오염 된 경우, 이온빔에 의해 깎아 : 팁의 측면을 따라 다각형 밀링 패턴을 선택 밀링 후에, 팁은 1 ㎛ 이하로 내려 테이퍼되도록. </li><li> 팁의 측면이 떨어져 가공되고 나면 수동으로 전체 NM로드 ° (90)에 의해 회전SEM 챔버 외부에서. </li><li> 회전 팁에 적응하고 다른 각도에서 밀링을 반복하는 다각형 밀링 패턴을 조정합니다. </li></ol></li><li> 팁은 1보다 μM로 날카롭게되면 NM 후퇴 및 가스 주입 시스템 (GIS)의 바늘을 삽입; (대신에 보통 175 ㎛ 인) 작동 거리 위의 약 1mm에있을 바늘의 위치를​​ 변경. </li><li> 백금 전구체를 사용하는 경우 (대신 보통 40 ° C의) 24 ~ 26 ° C에서의 작동 온도를 변경합니다. 이 단계는 백금의 크라이 증착 (13)이 필요합니다. </li><li> SEM 챔버를 열고 크라이 샘플 단계와 AC를 장착하여 극저온 모드 FIB / SEM을 준비합니다. </li><li> 삽입 위치에 NM 스위치 및 AC로의 구리 머리 띠를 연결합니다. 실수로 NM 팁을 만지지해야합니다. 이 시스템은 극저온에서의 구리 끈목의 유연성의 손실이 뉴 멕시코의 이동을 방해하지 않도록하기 위해 삽입 된 뉴 멕시코와 냉각MENT. </li><li> 몇 분 동안 건조 질소 가스로 냉각 파이프를 제거. </li><li> 크라이 조정실 및 고진공 메인 샘플 챔버 펌프. </li><li> 두 챔버를 냉각 Dewars에 액체 질소를 추가합니다. 원하는 온도에 도달 할 때까지 기다립니다. </li></ol> 2. 샘플 냉동 <ol><li><ol><li> SEM 전송 홀더 FIB 샘플 두 TEM 격자를 장착합니다. 드라이버로 해당 나사를 조여을 고정합니다. </li><li> 시편의 샘플 스텁 적절한 마운트 표본의 일부를 추가합니다. 시료의 유형에 따라, 시편은 극저온 접착제 또는 클램프로 고정 할 수있다. 최적의 냉동을 보장하기 위해 가능한 한 적은 양을 사용한다. </li><li> 진공 이송 장치 (VTD)에 SEM 전송 홀더를 장착합니다. </li></ol></li><li><ol><li> slushing 스테이션에 액체 질소를 추가하고 질소 비자금을 얻기 위해 펌프 다운. </li><li> SL을 엽니 다ushing 스테이션과 SEM 전송 홀더 플 런지 동결. 다시 끓는가 완료되고 비자금을 얻을 때까지 다시 펌프 다운. 이는 에탄 또는 프로판 슬러시 또는 고압 냉동 샘플의 유리화를 얻기 위해 더 적합한 기법임을 주목해야한다. </li></ol></li><li><ol><li> VTD의 진공 챔버 SEM 전사 홀더를 후퇴 해 밀봉. </li><li> slushing 역 크라이 준비 실 출입구를 환기. </li><li> 크라이 준비 챔버와 펌프의 에어 록으로 VTD 씰을 일치시킵니다. </li><li> 양호한 진공 레벨에 도달하면, VTD 및 외측 출입구의 봉을 열고 에어 록 핀 결합; SEM 전송 홀더를 삽입합니다. 스퍼터링 및 골절에 대한 샘플 위치를 나타내는 제조 챔버의 슬라이딩 접촉에 표식이있다. </li></ol></li><li> 필요한 경우, 샘플 수 : 감기 칼 골절; 높은 온도 (보통 -100을 설정하여 승화6, C); 추위 sputterer에 의해 금 / 팔라듐 또는 백금으로 코팅 (300 V, 10mA, 2 ~ 3 nm의 금 / 팔라듐 캡 60 초) *. 승화는 재결정을 피하도록 유리화 샘플에 사용되어서는 안된다. </li><li><ol><li> TEM 그리드 슬롯의 보호 뚜껑을 열고 차가운 칼을 사용합니다. </li><li> 수신 높이 (16mm의 *)에 샘플 챔버에 찬 단계를 가져온다. </li><li> FIB / SEM에서 HT를 끄고 내부 출입구를 엽니 다. </li><li> 샘플 챔버 내로 SEM 홀더를 전송할 VTD를 사용한다. 방에 조명을 흐리게하는 것은이 단계에서 도움이 될 수 있습니다. </li><li> SEM 홀더 추위 단계가되면, 밀고 회전하여 VTD를 분리합니다. </li><li> VTD 진공 챔버로 VTD로드를 끝까지 후퇴와 내부 출입구, 외부 출입구와 VTD 씰을 닫습니다. 외부 출입구는 이제 VTD 씰을 제거하기 위해 배출 될 수 있습니다. 이 마지막 단계는 필요하지 않지만 VTD로드 쉽게 사고로 빠질 수있는 바와 같이 그것이 손상 될 수있는 추천VTD 또는 출입구에. </li></ol></li></ol> 3. 이온 밀링 <ol><li> 두 열에서 높은 긴장의 전원을 켜고 적절한 이미징 매개 변수 (가속 전압 설정 : 전자 빔 10 kV의, 이온 빔 30 kV의, 반점의 크기 : 3, 작동 거리 : 5mm, 이온 빔 전류 : 10 ~ 100을 이미징을위한 PA, 밀링 1-3 NA) *. </li><li> 그 기능을 찾을 수 및 라멜라의 추출하기 전에 샘플의 상태를 문서화하는 이미지를 얻기위한 전자 빔을 사용합니다. </li><li> 추출에 대한 관심 (ROI)의 영역이 확인되면 시료 자체의 지형에도 백금 증착 후 투자 수익 (ROI)의 용이 한 식별을 허용하지 않는 한, 이온 빔 패턴으로 표시합니다. 정밀도가 향상된 경우, 표시가, 깊은 폭 비 SEL 인 크라이 백금 증착 (에 포함 된 후 계속 볼 수 있도록 충분히해야한다 Pettersson의 등. (14)에 의해 기술 된 방법을 사용)를 사실상 시료 표면의 몇 mm 2를 다룰 것입니다. </li><li> 24-26 ° C의 전구체 기체를 가열하고 샘플 표면 위 대략 1 mm의 높이로 GIS 바늘을 삽입 (또한 단계 1.3 참조). </li><li> 전자선 묘화 있지만, 몇 초 동안 가스 밸브를 연다. 극저온의 Pt의 증착 속도는 GIS 니들, 샘플 거칠기 및 사용자 시스템의 거리에 따라, 100 ~ 500 ㎚ / 초 이상이다. 그것은 최적의 매개 변수를 결정하기 위해 몇 가지 테스트 선서를 실행하는 것이 좋습니다. </li><li> 원시 크라이 백금 증착은 매우 거칠고 불 균질하다. 낮은 배율 (예 : 2,000 X)에서 1000 펜실바니아 이온 빔을 사용하여 투자 수익 (ROI)을 통해 예금을 치료. 크라이 증착과는 달리,이 경화성 사이트는 선택적 사항이며 ROI을 수행하여야한다. 이 제 극저온 증착의 목적은 이온빔 손상으로부터 샘플의 표면을 보호하고, 이온 씨닝 13 중에 curtaining을 감소시키는 것이다. </li><li> 에 샘플을 기울52 °면이 이온 빔에 수직이되도록. 투자 수익 (ROI)의 양쪽에 밀 멀리 두 개의 계단식 트렌치. 참호에 대한 일반적인 차원이 추출되는 얇은 판, 수직 방향 (Y) 및 변수를 10 ~ 15 μm의 방향 (X) 병렬로 20 ~ 30 μm의 수 있습니다, 가장 깊은 지점으로, 깊이 (Z)을 경 투자 수익 (ROI)을 닫습니다. 기울기는 45 ~ 55 °이어야한다. 일부 기기에서는 계단식 트렌치는 상단에있는 가장 깊은 지점으로 가공 할 수있다. 이 경우, 투자 수익 (ROI)에서 밀 한 다음 이미지 180 ° 공장 반대편에 두 번째 회전. 재료의 스퍼터 레이트가 알려진 경우 밀링의 깊이가 선택 될 수있다. 대부분의 냉동 수화 샘플은 얼음의 스퍼터링 속도는 7 사용될 수있다. </li><li> 다시 0 °로 샘플을 기울이고 있는지 컷 마크 (그들은 계단식 경사면 공장에 밀링 자국을 남길해야 전체를 얇은 판을 통해 이동하고, 얇은 판의 측면과 밑면을 버려야하는 이온 빔을 사용하여) 이전 단계에서 에드. 샘플의 나머지 부분에 얇은 판을 연결하는 두 개의 작은 다리를 둡니다. </li><li> (이것은 약간의 샘플을 이동 할 수 있습니다) GIS 바늘을 삽입합니다. 그 첨단이 바람직 측에 라멜라와 물리적으로 접촉 할 때까지 NM 책략. 뉴 멕시코는 두 개의 작은 연결하는 교량의 이온 빔보기를 방해하지되어 있는지 확인합니다. </li><li><ol><li> 몇 초간 GIS 밸브를 열고 전자선 연속 촬상하여 크라이 증착을 모니터링한다. </li><li> 백금의 추가적인 1-2 μM 층 크라이 증착되었을 때, 밸브를 닫는다. </li><li> 만 NM은 얇은 판과 접촉하는 점을 중심으로 몇 μm의에서 백금 (단계 2.6 참조) 치료. </li><li> 무료 얇은 판을 잘라 높은 이온 빔 전류를 사용합니다. 이 연결 교량 멀리 분쇄뿐만 아니라 라멜라 및 샘플의 나머지 부분 사이의 새로운 접촉점을 형성 할 수있는 백금의 초과한다. 아직 GIS 바늘을 철회하지 마십시오. </li></ol></lI&gt; <li> 조심스럽게 참호에서 얇은 판을 추출하고 최소 500 μm의 샘플 표면 위를 이동 NM 기동. 만이 단계 후, GIS 바늘을 철회. </li><li> 샘플 단계 몇 mm를 내리고 TEM 그리드 중 하나가 될 때까지 이동은보기에 있습니다. 작업 위치에 격자에 부착 영역을 이동하고 GIS 바늘을 삽입합니다. </li><li><ol><li> 조심스럽게 TEM 그리드에 부착 영역과 물리적 인 접촉에 부착 된 얇은 판을 가지고 NM 기동. 얇은 판, TEM 그리드와 멕시코 사이의 압력 또는 긴장이 없어야합니다. </li><li> 몇 초 크라이 예금 백금의 추가 1 ~ 2 μm의 계층에 대한 가스 밸브를 엽니 다. </li><li> 만 얇은 판과 TEM 격자 사이의 접촉의 점을 중심으로 몇 μm의에서 백금 (단계 2.6 참조) 치료. </li></ol></li><li> 뉴 멕시코의 무료 얇은 판을 잘라 높은 이온 빔 전류를 사용합니다. 이는 NM 팁이나 샘플의 양쪽을 얻어 분쇄함으로써 달성 될 수있다. t에서그 첫 번째 경우, 팁은 단계 1.2에서 설명한대로 다음 사용 전에 다시 날카롭게해야 할 것이다. </li><li> OPTIONAL :이 단계는 SEM 전사 홀더를 가지고, 액체 질소로 채워진 듀어에서 O / N을 저장하는 VTD를 사용하는 것이 가능하다. 이 전송 및 O / N 스토리지는 라멜라의 표면 상에 얼음 형성이 발생할 가능성이 액체 질소는 습한 공기에 노출되는 경우에 얼음 결정이 이미 존재 및 / 또는 경우에; 그러나 이러한 오염은 비교적 짧은 시간에 다음 단계에서 제거 될 것이다. 이전 단계를 완료하는 데 몇 시간을 촬영 할 수 있습니다으로 다음과 같은 단계 이후에 같은 저장 O / N 권장되지 않기 때문에 (승화 제외 얼음 오염을 제거 할 수있는 방법이 없을 것 같은, 그것은 그렇게하는 것이 적절 될 수있는 샘플의 유리화가 유지 될 경우)를 수행 할 수 없다. </li><li> 52 °에 샘플을 기울여 투명성 7 전자 얇은에 이온 빔을 사용합니다. 그것은 높은 roug로 시작하는 것이 좋습니다그녀 빔 전류는 부피를 제거하고, 결국 또한 가속 전압을 감소시키는 낮은 빔 전류로 표면을 연마 미세 진행한다. 얇은 판의 최종 두께는 시료의 조성에 따라, 100 ~ 200 kV의 TEM의 미세 구조 분석을위한 100 ~ 200 nm 이하 또는 300 kV의 TEM의 단층 촬영을 위해 최대 500 나노해야한다. 엷게하는 동안, 시료의 내부 응력은 라멜라가 컬 또는 굴곡 될 수 있습니다. 그러한 경우에, 박형화 영역이 제한되어야한다. 이것은도 11 및도 12에 예를 들어 일어났다. </li></ol> TEM 4. 알아내는 전송 <ol><li><ol><li> 몇 분 동안 건조 질소 가스 크라이 환승역 플러시. </li><li> TEM AC의 듀어와 크라이 전송 스테이션에 액체 질소를 추가합니다. </li><li> 크라이 전송 스테이션의 해당 슬롯에 크라이 전송 TEM 홀더를 삽입뿐만 아니라 그것의 듀어를 입력합니다. 각로드 될 때까지 기다립니다onent가 원하는 온도 (약 15 분)에 도달했습니다. 가능하면, 크라이 전사 TEM 홀더의 제어기는 전송하는 동안 온도를 모니터에 연결되어야한다. 그것은 (온도 센서가 위치한) TEM 홀더의 선단이 크라이 환승역에 접촉되며, 따라서 TEM 홀더의 나머지보다 훨씬 빠르게 식혀 것을 인식하는 것이 중요하다. 그것은 따라서 냉각하는 전체 크라이 전송 TEM 홀더에 필요한 시간을 미리 측정하고, 시스템이 시간의 최소 금액에 대한 thermalize 할 수 있다는 것을 권장합니다. </li><li> 액체 질소 극저온 잔을 채우고 그 안에 담가 : 원하는 온도에 자신의 팁을 냉각하기 위해 TEM 샘플 클램핑 툴, 드라이버 및 핀셋. 조작자의 손에 감기 화상을하지 않도록하고 모든 공구가 제대로 타단에 절연되어야한다. </li></ol></li><li> 외부 출입구에 VTD 일치합니다. 추위 사슴을 가지고전송 높이 (16mm의 *)에 전자. 하이 텐션을 끕니다. </li><li><ol><li> VTD 씰, 외부 출입구와 내부 출입구를 엽니 다. </li><li> 시계 방향으로 밀고 회전하여 SEM 전송 홀더에 고정합니다 VTD로드를 사용합니다. </li><li> 크라이 프렙 챔버에 SEM 전사 홀더를 후퇴. </li><li> TEM 그리드의 보호 뚜껑을 닫습니다 차가운 칼을 사용합니다. 이는 전송 중에 가능한 얼음 오염을 감소시킬 필요가있다. </li><li> VTD의 진공 챔버에 샘플을 이동 VTD로드를 사용합니다. </li><li> airlocks 및 인감을 닫습니다. </li></ol></li><li> 외부 출입구를 배출하고 VTD를 분리합니다. 크라이 전송 스테이션의 SEM 포트에 VTD 일치합니다. 건조 질소로 세척하는 동안, VTD의 씰을 열고 크라이 환승역 듀어에 SEM 전송 홀더를 밀어 스테이션의 핀을 사용합니다. </li><li><ol><li> 크라이 전송 스테이션의 수준이 충분히 높지 않도록 충분한 액체 질소 추가다만 견본 잠수함합니다. </li><li> 뚜껑을 열고 자리에 TEM 그리드를 유지하고 해당 나사를 느슨하게 이전에 냉각 된 드라이버를 사용합니다. </li><li> TEM 그리드를 선택하고 TEM 홀더에 배치하기 이전에 냉각 핀셋을 사용합니다. </li><li> TEM 홀더에 TEM 그리드를 고정 냉각 hexring를 사용합니다. </li><li> 크라이 전송 TEM 홀더의 셔터를 닫습니다. 샘플 전사 공정은 매우 중요하고 작은 TEM 샘플의 가시성을 감소시키는 질소 가스에 의해 방해 될 수있다. </li><li> 펌핑 시스템에서 크라이 전송 스테이션을 분리하고 함께 크라이 전송 TEM 홀더의 히터 컨트롤러, TEM 근처에 수송한다. </li><li> TEM의 출입구에 백업 라인을 펌프에 TEM의 터보 분자 펌프를 시작합니다. </li><li> -70 °의 틸트 *에 TEM 샘플 단계를 설정합니다. </li><li> 건조 질소 가스에 의해 퍼지 하나만 사이클, 기밀실 (30-60 초)에 대한 펌핑 최단 시간을 설정한다. </리&gt; </ol></li><li> 크라이 전송 TEM 홀더에 보호 셔터가 닫혀 있는지 확인합니다. 크라이 전송 역에서 TEM 홀더를 제거하고 (액체 질소는 TEM 홀더 듀어 밖으로 유출 할 것이다) 기울어 진 고니 오 미터에 삽입합니다. 펌핑 사이클이 시작됩니다. 사이클이 완료되면, 0 °로 다시 기울일 측각기를 설정하고, 그것을 측각기로 회전하지 않도록 동시에, T​​EM 홀더를 잡아. TEM 내부에 완전히 삽입합니다. 이 단계 동안, 크라이 전사 TEM 홀더의 온도를 모니터링하기 위해 히터 제어기에 연결되어야한다. TEM에 샘플 홀더를 삽입하는 절차는 다른있는 TEM 사이에 차이가있을 수 있습니다. 그것은 따라서 적절한 절차를 얻기 위해 TEM 제조업체에 문의하는 것이 좋습니다. </li><li> 크라이 전송 TEM 홀더 듀어 리필. 수용 가능한 수준에 도달하기 위해 TEM의 진공 기다립니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 실온에서 재료 과학에서 사용되는 표준 FIB / TEM 샘플 준비의 극저온에 오히려 간단 적응이다. 샘플 표면이 불균일 한 경우 curtaining가 발생할 수 있지만,이 방법은, 기계적인 변형과 칼 마크 (microtomy의 주요 단점)의 자유 TEM 샘플을 생성한다. 그것은 매끄럽고 특색이 13이 될 때까지이 경화 캡핑 층 (이 작업 편에 사용 하였다), 극저온의 증착에 의해 감소 될 수있다. 매우 경도가 다른 구성 요소와 샘플들이 제조 동안 스트레스 하에서 분해 할 위험없이도 제조 할 수있다. 내부 응력은 여전히​​ 얇은 라멜라이 섹션의 크기가 감소되어야하는 경우, 구부러 지거나 휘지 발생할 수있다. 다른 방식에 비해 단점으로 인해 이온 빔과 샘플의 이온의 주입을 가능에 노출 생물학적 구조를 변경하는 가능성이다. 이러한 단점은 또한 샘플 prepar 대한 RT에서 발생할재료 과학 15 ATION. 이들은 이온 (500 ~ 1,000 V)에 대한 낮은 가속 전압에서 최종 폴리싱 단계와 씨닝을 완료하여 감소 될 수있다. 이 매우 부드러운 연마 단계는 얇은 판의 손상 층을 제거합니다. 때문에 극저온 증착 (3.5, 3.10 및 3.13 단계)의 특성, 샘플의 큰 부분이되어 원래의 표면의보기를 방해, 적용됩니다. 이 단계 3.3에서 제시된대로 여러 마킹이 사용되지 않는 것이 곤란, ROI를 추적하도록 할 수있다. 단계 공기와 접촉하는 4.5 및 4.7 얇은 라멜라 위험 중. 이것은 아마도 중요한 기능을 왜곡의 시점, 샘플의 표면 상에 얼음 결정을 형성하기 위해 공기에 수분을 야기으로 피해야한다. 그 단계는 가능한 한 빨리 수행되어야하지만, 동시에 전송 중에 부주의는 시료의 손실이 발생할 가능성이 그것을자기. 그것은 사용자가 실제 샘플에 대한 시도가 이루어지기 전에 빈 TEM 격자를 사용하여 이러한 단계를 연습하는 것이 좋습니다. 재료 과학, FIB 악기 상용화 10 년 내 TEM 샘플 준비의 주요 방법이되었다. 그것은 거의 모든 시료에 사용될 수 있기 때문에, 시료의 종류에 제조 기술을 조정할 필요성을 제거한다. 우리는 강력하게 같은이, 극저온의 온도에서 분석 절차 덕분에 일어날 수 있으리라 생각합니다. 큰 샘플에의 응용은 아직도 알아내는 보존 유리화 된 상태에서 그들을 할 수있는 능력에 따라, 그러나 3,5 동결 등의 플 런지 동결 또는 고압 등의 기술은이 문제에 대한 최적의 솔루션이 될 증명할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 cryo-FIB/SEM 기계 SEM 분석에 의해 높은 정밀도로 식별 된 샘플의 특정 영역에서 TEM 샘플을 생성하기 위해 사용된다. 생물학적 시료의 전자 현미경 (스캔 또는 전송) 분석 연구 및 진단에 사용되는 일상적인 기술이다. SEM 오히려 빠르고 고용하고 해석하기 쉽지만, 정보는 샘플 표면에서 및 1.5 nm의 범위의 해상도를 얻을 수있다. TEM은 더 높은 해상도를 가지고 있지만, 구현하기가 더욱 어렵고, 이미지 분석은 이하 간단하며 대량 정보가 획득되는 반면, 샘플 (약 500 nm 두께 이하의) 투명도 전자 얇아 져야한다. 또 다른 문제는 그 악기의 진공 요구 사항이 거의 수분을 함유 한 시료에 의해 허용되지 않는 것입니다. 대부분의 경우, 생물학적 시료는 화학적으로 (중합체, 예를 들어, 물을 대체) 고정 또는 건조 할 수도있다. 에 두 경우 모두, 큰 변화시편의 형태와 구조는 발생하기 쉽다. 수화 표본의 극저온 TEM 준비는 최소한의 화학적 변화를 유도하고 얼음의 유리화가 1-6을 얻을 수있다 특히, 자신의 고유 상태로 가능한 한 샘플을 가까이 생산하고 있습니다. FIB는 널리 많은 장점 7 TEM 샘플을 준비하는 데 사용됩니다. 몇 가지 이름을하려면 거의 수직 입사에 고 에너지 이온의 자료를 사용하는 관련 차동 밀링 환율의 영향을 최소화; 대부분의 샘플에서 추출 된 영역은 서브 마이크론의 정밀도로 선택 될 수있다; 물질의 미량이 추출된다. 일부 최근의 기술 개발은 극저온 2,8-10에서 TEM 샘플 준비를 위해 또한 FIB를 사용 가능하게했다. 이러한 슬라이스 라멜라의 기계적 변형의 부족과 같은 부드러운 물질 샘플에 주로 사용 크라이 microtomy 11,12의 전통적인 제조 방법에 비해 여러 가지 이점이있다하드 / 소프트 인터페이스 또는 구성 요소와 복합 샘플을 준비하는 칼 마크와 가능성의 부재.

<table><tbody><tr><td>Strata DB 235</td><td>FEI</td><td></td><td>FIB/SEM</td></tr><tr><td>Omniprobe 100</td><td>옥스포드 기기</td><td></td><td>나노 매니퓰레이터</td></tr><tr><td>Alto 2500</td><td>Gatan</td><td></td><td>Cryo 준비 챔버</td></tr><tr><td>모델 626</td><td>Gatan</td><td></td><td>Cryo 전사 TEM 홀더</td></tr><tr><td>Tecnai F30</td><td>FEI</td><td></td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

여기에서 우리는 아스 페르 길 루스 니제르 포자 크라이 TEM 시료를 준비하는 데 사용되는 프로토콜을 제시하지만, 쉽게 미생물 또는 솔루션의 수에 대한 적응 될 수있다. 우리는 사용자 정의 내장 크라이 전송 역 및 수정 크라이 SEM 준비 챔버 (2)를 사용합니다. 포자는 액체 질소의 비자금에 뛰어 들다 - 냉동 및 관심 영역을 선택 크라이 SEM에서 관찰, 문화에서 가져옵니다. 얇은 라멜라는 다음 TEM 그리드에 연결된 이후에 투명성을 전자 얇아, FIB를 사용하여 추출한다. 그리드는 크라이 TEM 홀더 및 고해상도 TEM 연구에 전사된다. 냉각 nanomanipulator 팁과 크라이 환승역 도입 덕분에,이 프로토콜은 TEM 샘플의 일상적 사용 FIB 준비의 극저온까지 간단 적응이다. 이와 같이 기존의 기기는, 셋업 및 절차에 대한 변형의 양이 적은 이점이있다; 그것의 I구현하기가 쉽다; 그것은 원칙 크라이 TEM 샘플 준비와 동일한에서 응용 프로그램의 넓은 범위를 가지고 있습니다. 하나의 한계는 오염을 방지하거나 최소화하기 위해 중요한 단계에서 표본의 숙련 된 처리가 필요한 것입니다.

이 작품에서 우리는 사용했다 : nanomanipulator와 크라이 준비 챔버가 장착 된 듀얼 빔 FIB / SEM을; 크라이 전송 홀더 TEM; 프로토 타입을 알아내는 전송 역. anticontaminator (AC)는 크라이 조정실의 블레이드와 nanomanipulator (NM)의 끝이와 Gatan에 의해 수정되었다. 표준 크라이 프렙 챔버에 대해, AC 블레이드 NM 팁에 대한 더 큰 히트 싱크를 제공하는 것이 크다. 또한, AC는 NM 팁의 열 교환을위한 구리 머리 띠를 연결하는 클램프가 장착되어 있습니다. FIB / SEM의 공압은 NM가 될 수 있도록 수정 된 샘플 챔버가 배출 된 경우에도 삽입 된 상태로 유지. 이는이 연구에서 사용 된 파라미터가 제일 위에 나열된 기기에 적합 주목해야한다; 이러한 매개 변수는 다른 유형의 장비로 작업 할 때 조절 될 필요가있다. 이 프로토콜을 사용하여 작업하는, 저온 학을 처리하기위한 일반적인주의 사항은, 액체 질소 진공 시스템은해야다음 될 수있다. 이 방법은 용액 또는 나노 입자를 포함하는 고분자 매트릭스에서, 선충에 단세포 유기​​체에 이르기까지, 좋은 결과 샘플의 다른 유형에서 테스트되었습니다. 절차의 여러 단계의 예는 A.에도 1-12에 도시되어있다 니제르 포자 산화 오스뮴 및 과망간산 칼륨으로 염색. 포자 먼저 추출 사이트를 식별 할 수 있습니다 (그림 1) SEM에 의해 촬영된다. 이 경우, 어떠한 포자의 단면은 충분하지만, 행 서브 마이크로 미터 정밀도로 추출 ROI의 위치를​​ 예를 들면, 세포막으로부터 특정 거리에서 특정 세포를 슬라이스하는 것이 가능하다. 그 기능이 확인되면, 크라이 편 증착의 제 1 단계는 이온 밀링에서 빔 손상으로부터 시료를 보호하기 위해, (도 2)에 구현된다. 이 샘플은 첫 단계 O를 진행하는 52 °로 기울어 져F 밀링 (도 3) : 얇은 판의 양측에 두 개의 트렌치 스퍼터링. 샘플을 기울이면 더욱 대량으로 연결하는 두 개의 작은 다리 (그림 4)를 남겨두기 위하여 가공된다. 냉각 nanomanipulator는 얇은 판에 접촉 (그림 5)과 백금의 다른 크라이 증착들을 함께 연납 (그림 6)하게된다. 작은 연결 교량은 다음 멀리 분쇄 NM은 TEM 그리드의 부착 면적이 백금의 최종 크라이 증착 (그림 8) 납땜 (그림 7), 근처에 얇은 판으로 이동합니다. NM이어서 이온빔 투명도 (도 10 및 11)를 위해 전자 박판화 라멜라 (도 9)로부터 분리된다. 얇은 판은 마지막으로 TEM (그림 12)로 전송되는 경우 고해상도 이미징, 분광기, 단층 촬영 및 기타 CA의 기술N 사용될 수. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> 그림 1. A. 포자의 극저온-SEM 이미지 백금 증착하기 전에 니제르. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> 그림 2. 백금 증착 후 그림 1 만 치료 전에 같은 지역. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> 그림 2와 같은 지역의 그림 3. 극저온-SEM 이미지, 트렌치 밀링, 백금 증착 및 경화 후, 52 º 기울어 진행(3.7 단계 참조). <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> 리프트 아웃에 대한 준비가 그림 4. 얇은 판. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> 그림 5. 차가운 nanomanipulator 팁 라멜라와 접촉한다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> 그림 6. 두 번째 백금 크라이 증착 nanomanipulator와 얇은 판을 함께 납땜하는 데 사용됩니다. <iSRC = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot;/&gt; : FO 내용 너비 = &quot;5 인치&quot;FO MG 고도는 = &quot;그림 7&quot; 그림 7. 차가운 nanomanipulator는 TEM 그리드의 부착 영역에 얇은 판을 전송하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> 그림 8. 크라이 증착 TEM 그리드에 얇은 판을 부착 한 번 더 사용됩니다. <img alt="그림 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> 그림 9. 얇은 판은 nanomanipulator 무료 잘라 이제 저장 또는 투명 전자에 얇게 하나에 대한 준비가되어 있습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.내 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> 그림 10. 숱의 중간 단계를 단면에서 보이는 몇 가지 포자. <img alt="그림 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> . 최종 숱이 후 샘플의 11 극저온-SEM 이미지를 그림; 다른 포자의 대부분은 얇은 판 컬하기 시작했기 때문에 멀리 분쇄되어야했다. <img alt="그림 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> 그림 12. 얇은 판의 복합 크라이 TEM 사진을. 알 스텁의 일부가 포함되어 있습니다얇은 판 (검은 색 화살표)에서.

극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다.

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

본 절차의 전반적인 목표는 극저온 동결된 벌크 샘플에서 집속 이온 빔 라멜라(lamella)를 추출하여 cryo TEM용 샘플을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 샘플을 액체 질소에 급속 동결(plunge freezing)시킨 후 cryo 집속 이온 빔 SEM 내부에 장착함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이온 빔으로 얇은 라멜라를 절단하고, 냉각된 나노 조작기(nano manipulator)를 사용하여 이를 TEM 그리드로 옮기는 것입니다.다음으로, 전송 스테이션에서 TEM 그리드를 SEM 홀더에서 TEM 홀더로 옮깁니다. 마지막 단계는 추가 분석을 위해 TEM 홀더를 cryo TEM으로 옮기는 것입니다. 최종적으로 cryo TEM을 사용하여 추출된 라멜라의 고해상도 이미지, 토모그램(tomograms) 또는 x-ray 맵을 확인합니다.이 기술을 통해 광학 현미경이나 주사 전자 현미경과 같은 다른 현미경으로 분석 위치를 미리 선택함으로써, 투과 전자 현미경에서 연성 물질을 극한의 해상도로 분석할 수 있습니다. Mac cryo Microtomy와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 시료의 압착 및 변형과 같은 준비 과정 중의 아티팩트를 방지할 수 있다는 점입니다. 먼저 집중 이온 빔 시료용 TEM 그리드 두 개를 장착하십시오.SEM 전송 홀더에서 드라이버로 해당 나사를 조여 그리드를 고정하고 셔터를 닫은 후, 시료에 적합한 샘플 스터브를 장착하고 시료의 일부를 추가합니다. 예를 들어, 피펫을 사용하여 평평한 스터브 위에 액적을 떨어뜨립니다. 그런 다음 SEM 전송 홀더를 진공 전송 장치 또는 VTD에 장착합니다.슬러싱 스테이션(slushing station)에 액체 질소를 넣고 펌프 다운한 후, 스테이션을 열고 SEM 전송 홀더를 급속 동결시킨 다음, 끓음 현상이 완전히 사라지고 다시 슬러시 상태가 될 때까지 다시 펌프 다운합니다. 그다음, SEM 전송 홀더를 VTD의 진공 챔버 안으로 후퇴시켜 밀봉합니다. 슬러싱 스테이션과 저온 준비 챔버를 벤트하고 외측 에어락을 벤트합니다.그 다음 VTD 씰을 cryo 준비 챔버 및 펌프의 에어록에 맞춥니다. 적절한 진공 수준에 도달하면, 에어록 핀을 조절하여 VTD 씰과 외부 에어록을 엽니다. 그런 다음 SEM 전송 홀더를 삽입합니다.그 다음, 차가운 칼을 사용하여 TEM 그리드 슬롯의 보호 덮개를 엽니다. 집중 이온 빔 SEM의 고전압을 끄고 내부 에어록을 엽니다. 그런 다음 VTD를 사용하여 SEM 홀더를 시료 챔버로 옮깁니다.SEM 홀더가 콜드 스테이지에 위치하면, 밀어서 회전시켜 VTD를 분리하십시오. VTD 로드를 VTD 진공 챔버 안으로 끝까지 후퇴시킨 후, 내부 에어락, 외부 에어락 및 VTD 씰을 닫으십시오. 이때 전구체 가스를 24~26°C로 가열하고, 가스 주입 시스템 또는 GIS 바늘을 시료 표면에서 약 1mm 높이에 위치시키십시오.전자빔으로 이미징하는 동안 가스 밸브를 몇 초 동안 엽니다. 그 후 저배율에서 1000 pico ampire 이온빔을 사용하여 관심 영역(ROI) 위에 증착물을 경화시킵니다. 경화 후, 표면이 이온빔과 수직이 되도록 시편을 52도로 기울입니다.밀링 작업을 수행합니다. 테러리스트 트렌치(terrorist trenches) 두 개를 생성합니다. ROI 양측에서 샘플을 0도로 다시 기울인 후, 이온 빔을 사용하여 라멜라의 측면과 하단을 절단하며, 이때 절단 표시가 라멜라 전체를 관통하도록 합니다.GIS 니들을 삽입한 후, 나노 매니퓰레이터의 팁이 라멜라와 물리적으로 접촉할 때까지 조작하며, 가급적 측면에 접촉시키십시오. GIS 밸브를 몇 초간 열고 전자빔을 이용한 연속 이미징을 통해 저온 증착 과정을 모니터링하십시오. 1~2 µm 두께의 백금 층이 추가로 저온 증착되면 밸브를 닫고, 나노 매니퓰레이터가 라멜라와 접촉하고 있는 지점 주변의 수 µm 영역에만 백금을 큐어링하십시오.그런 다음 높은 이온 빔 전류를 사용하여 라멜라를 절단하여 분리합니다. 나노 매니퓰레이터를 조심스럽게 조작하여 트렌치에서 라멜라를 추출하고, 시료 표면에서 최소 500 micrometers 위로 이동시킵니다. 니들을 후퇴시킨 후, 시료 스테이지를 몇 밀리미터 낮추고 TEM 그리드 중 하나가 보일 때까지 이동시킵니다.그리드의 부착 영역을 작업 위치로 이동시키고 GIS 바늘을 삽입합니다. 다음으로, 나노 매니퓰레이터를 조심스럽게 조작하여 부착된 라멜라를 TEM 그리드의 부착 영역에 물리적으로 접촉시킨 후, 가스 밸브를 몇 초 동안 열어 1~2 µm 두께의 백금 층을 추가로 저온 증착하고 라멜라와 TEM 그리드의 접촉점 주변 수 µm 영역에만 백금을 경화시킵니다. 그런 다음 높은 이온 빔 전류를 사용하여 나노 매니퓰레이터로부터 라멜라를 절단하여 분리합니다.시료를 52도로 기울인 후 이온 빔을 사용하여 전자 투과가 가능할 정도로 얇게 만듭니다. 극저온 전송 스테이션을 건조 질소 가스로 세척한 후, 극저온 전송 TEM 홀더를 극저온 전송 스테이션의 적절한 슬롯에 삽입하고 액체 질소로 채웁니다. 그다음, 드라이버, TEM 시료 고정 도구 및 핀셋을 액체 질소가 채워진 극저온 컵에 담가 팁 부분을 원하는 온도까지 냉각합니다.VTD가 외부 에어락에 맞물리면, 콜드 스테이지를 16 millimeters의 이송 높이로 이동시킵니다. 고전압을 끈 후, VTD 씰, 외부 에어락 및 내부 에어락을 엽니다. 그런 다음 VTD 로드를 밀고 시계 방향으로 회전시켜 SEM 이송 홀더에 고정합니다.이 시점에서 SEM 이송 홀더를 저온 준비 챔버로 되돌립니다. 콜드 나이프를 사용하여 TEM 그리드의 보호 덮개를 닫습니다. 그런 다음 VTD 로드를 사용하여 샘플을 VTD의 진공 챔버로 이동시킨 후 에어락을 닫고 밀봉합니다.그 후 외부 에어락을 배기하고 VTD를 분리합니다. VTD를 저온 전송 스테이션의 SEM 포트에 맞춥니다. 건조 질소로 플러싱하는 동안 스테이션의 핀을 사용하여 VTD의 씰을 열고, SEM 전송 홀더를 저온 전송 스테이션의 도어 안으로 밀어 넣습니다.냉각된 드라이버를 사용하여 덮개 중 하나를 열고, TEM 그리드가 고정된 상태에서 해당 나사를 풉니다. 그런 다음 냉각된 핀셋을 사용하여 TEM 그리드를 집어 TEM 홀더에 넣습니다. 이어서 TEM 그리드를 TEM 홀더에 고정합니다.냉각된 육각 링을 사용하여 cryo transfer TEM 홀더의 셔터를 닫고, cryo transfer 스테이션을 펌핑 시스템에서 분리하십시오. 스테이션과 TEM 홀더의 히터 컨트롤러를 TEM 근처로 운반하여 다시 연결하십시오. TEM 시료 스테이지의 기울기를 -70°로 설정하십시오.다음으로, 건조 질소 가스로 단 한 번의 퍼징 사이클만 수행하도록 에어락의 펌핑 시간을 최단 시간으로 설정하십시오. cryo transfer station에서 TEM holder를 꺼내 기울기 조절이 가능한 고니오미터(goniometer)의 1단계에 삽입하면 펌핑 사이클이 시작됩니다. 사이클이 완료되면, TEM holder가 고니오미터와 함께 회전하지 않도록 고정한 상태에서 고니오미터의 기울기를 다시 0도로 설정하십시오.그런 다음 홀더를 고니오미터를 통해 TEM 내부로 완전히 삽입합니다. 마지막으로 cryo transfer TEM 홀더 도어를 액체 질소로 다시 채웁니다. 이 방법에서는 추출 위치를 확인하기 위해 먼저 SEM으로 aspergillus Niger 포자를 이미징합니다.어떤 포자의 횡단면이라도 충분하지만, 세포막으로부터 특정 거리의 특정 세포를 절단하기 위해 서브 마이크로미터 정밀도로 추출 ROI를 배치할 수 있습니다. 관심 있는 특징이 식별되면 극저온 증착의 첫 번째 단계가 수행됩니다. 이온 밀링 동안 빔 손상으로부터 시료를 보호하기 위해 시료를 52도로 기울인 다음, 멜라(mella) 양쪽에 두 개의 트렌치를 스퍼터링합니다. 이후 시료를 다시 기울여 추가로 밀링함으로써, 벌크에 연결된 두 개의 작은 브릿지만 남깁니다.냉각된 나노 매니퓰레이터를 라멜라에 접촉시킨 후, 백금의 추가 저온 증착을 통해 두 부분을 서로 납땜하여 접합합니다. 작은 연결 브리지를 밀링하여 제거하면, 나노 매니퓰레이터가 라멜라를 TEM 등급의 부착 영역 근처로 이동시키며, 여기서 백금의 최종 저온 증착으로 납땜합니다. 이후 나노 매니퓰레이터를 라멜라에서 분리하며, 라멜라는 전자 투과가 가능할 정도의 두께로 얇게 가공합니다.이온 빔을 통해 라멜라를 TEM으로 전송하면 고해상도 이미징 분광법, 토모그래피 및 기타 기술을 적용할 수 있습니다. 이 방법은 신경 프로브나 골 임플란트와 같은 시스템에서 심장 연성 물질 계면을 이해하는 데 기여할 것입니다. 이 영상을 시청한 후에는 아티팩트가 없는 cryo TM 샘플을 준비하는 방법과 벌크 샘플의 특정 영역에서 서브 마이크로미터 정밀도로 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

cryo-electron-microscopy-specimen-preparation-means-focused-ion

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 "macromolecular"(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

이 프로토콜은 수지 내장 뇌 조직은 전자 현미경을 스캐닝, 초점을 맞춘 이온 빔의 3 차원에 준비하고 몇 군데 수있는 방법에 대해 설명합니다.

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

이 논문은 거의 네이티브 상태의 거대분자의 고품질 현미경 이미지를 얻는 데 사용되는 초저온 전자 현미경 검사 방법론에 대해 설명합니다. 이 방법은 거대분자의 3D 재구성을 생성하기 위해 고안된 단일 입자 접근 방식을 사용하여 추가 컴퓨터 처리에 적합한 이미지를 생성합니다.

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

극저온 집중 이온 빔 (FIB) 및 주사 전자 현미경 (SEM) 기술은 손상되지 않은 고액 계면의 화학 및 형태학에 대한 주요 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이러한 인터페이스의 고품질 에너지 분산 X선(EDX) 분광지도를 준비하는 방법은 에너지 저장 장치에 중점을 두고 상세히 설명되어 있습니다.

Cryo-Focused Ion Beam Milling과 주사 전자 현미경 및 분광법을 결합하여 액체-고체 인터페이스의 나노스케일 특성화

집속 이온빔 밀링을 사용하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 급락 동결 생물학적 샘플에서 유리질 그리드 상의 라멜라를 생성합니다.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

여기에서는 초저온 전자 단층 촬영을 위한 세포 샘플 준비를 안내하는 3D 상관 집속 이온 빔 밀링을 위한 파이프라인을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 관심 단백질의 3D 위치는 먼저 극저온 형광 현미경으로 측정한 다음 밀링을 대상으로 합니다. 이 프로토콜은 포유류, 효모 및 박테리아 세포에 적합합니다.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

이 워크플로우는 극저온 삼중 일치 이미징 플랫폼을 사용하여 작고(축 범위 &lt;1μm) 희귀한(세포당 1개 사본) 형광 표지된 생물학적 구조를 표적으로 하는 라멜라 생산을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 형광 현미경, 집중 이온 빔 밀링 및 스캐닝 전자 현미경을 단일 초점 위치에 통합하고 밀링 중 동시 형광 현미경을 가능하게합니다.

세포의 표적 밀링을 위한 극저온 일치 형광, 전자 및 이온빔 현미경을 사용한 워크플로

학습하세요 집중 이온 빔을 활용한 극저온 투과 전자 현미경 표본 준비 방법으로 연질 생물학적 시료의 고해상도 이미징을 수행하는 기술입니다. 이 기법은 시료 준비 과정에서 발생하는 왜곡을 최소화하여 정확한 분석 결과를 제공합니다.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

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