암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 Tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 Tomography

다음 실험의 전반적인 목표는 정소성 신경교종 마우스 모델에서 표피 성장 인자 수용체 발현의 형광 이미지를 생성하는 것입니다. 이는 A IIC 마우스의 좌측 대뇌 반구에 인간 U2 51 신경교종 세포를 발현하는 녹색 형광 단백질을 접종함으로써 달성됩니다. 종양이 2주 동안 자란 후, 마우스에게 두 가지 형광 추적자 칵테일을 주입합니다.

그런 다음 정확한 이미지 재구성에 필요한 해부학적 데이터를 수집하기 위해 작은 동물 X-ray 시스템에서 마우스를 이미지화합니다. 이 데이터는 광원을 해부학적으로 배치하고 광학 단층 촬영 시스템의 위치를 감지하는 데 사용되며, 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 형광 데이터를 수집하고 최종 이미지를 구성합니다. 궁극적으로 이 방법은 형광 및 X선 이미징을 모두 사용하여 표피 성장 인자의 과발현을 기반으로 종양의 이미지를 구성할 수 있으며, 그 정확도는 대비 강화 자기 공명 이미징과 비교할 수 있습니다.

전하 커플, 장치 기반 소동물 형광 단층 촬영과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 광 증배관을 사용한 단일 광자 계수 감지가 광 감지를 위한 훨씬 더 높은 감도와 동적 범위를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 궁극적으로 표적의 발현을 측정하여 분자 치료의 성공을 모니터링하고 측정하는 데 사용할 수 있으며, 피하 종양은 표면 이미징을 사용하여 비단층 촬영 방법으로 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 이 시스템은 최대 수 센티미터 두께의 조직을 통해 이미징할 수 있도록 설계되어 이미징, 조영제, 제제 전달 및 뇌종양으로의 누출에 특히 적합합니다.

이 방법은 암 바이오마커 발현에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 감염, 비만 또는 알츠하이머병과 같은 노화 요소와 같은 질병의 다른 연구에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생물학적 조직에서 광 전파의 확산 특성과 확산광 재구성을 위한 X선 단층 촬영을 사용하는 어려움 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다.

데이터 수집 및 이미지 재구성 단계는 배우기 어려울 수 있으므로 형광 시스템에서 수집된 데이터가 잘 보정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 거의 빠른 소프트웨어 패키지는 광학 데이터를 읽고 X선 단층 촬영 이미지를 사용하여 형광 재구성을 위한 공간 템플릿으로 사용되는 유한 요소 메시를 생성하도록 설계되었습니다. 시작하려면 마취된 흉선 무늬 마우스를 멸균 수술용 드레이프에 놓고 마취 깊이를 확인한 후 절개 부위의 피부를 세척하고 소독합니다.

베타딘을 사용하여 메스를 사용하여 절개 부위에 멸균 수술용 드레이프를 놓고 정중선에서 약간 왼쪽, 안구 내 선에서 0.5cm 뒤쪽으로 작게 절개합니다. 랜드마크를 식별할 수 있도록 결합 조직을 제거하여 두개골 표면을 청소합니다. 두개골이 노출되면 멸균 1mm 비트가 있는 고속 드릴을 사용하여 중심선에서 2mm 왼쪽, bgma 뒤에서 2mm 떨어진 곳에 구멍을 뚫습니다.

Hamilton Micros 주사기에 끝이 뭉툭한 27게이지 바늘에 이식할 세포를 로드합니다. 다음으로, 마우스를 입체성 프레임에 놓습니다. 그런 다음 발가락 꼬집기로 깊은 수술 및 미적 평면을 확인하고 동물의 수술 드레이프를 교체합니다.

다음으로, 장전된 주사기를 입체 프레임에 고정합니다. 주사기를 두개골의 구멍 위에 놓고 바늘 끝을 두개골 표면 아래 3mm에 삽입합니다. 그런 다음 바늘을 1mm 당겨 주머니를 만듭니다.

다음 단계는 5분에 걸쳐 세포를 좌측 대뇌 반구에 천천히 주입하는 것입니다. 주사가 완료되면 바늘을 빼내고 베타딘으로 구멍을 닦습니다. 주사 부위 밖에서 세포가 자라는 것을 방지하려면 입체성 프레임에서 마우스를 제거하고 노출된 구멍을 예열 전 뼈 왁스로 채웁니다.

마지막으로 멸균 5 oh 나일론 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 마우스를 가열된 케이지로 되돌리고 회복 후 회복될 때까지 모니터링하고, 마우스에 130마이크로리터의 0.1mg당 0.1mg의 부프레노르핀 IP를 주입하고 이미징 전 14일 동안 종양이 자랄 수 있도록 합니다. 마우스 이미징 당일에는 레이저와 광 감지기가 약 20분 동안 예열될 수 있도록 시스템을 시작합니다.

드리프트 및 시스템 감도를 방지하려면 이미징 갠트리의 바로 중앙에 100도 x 4도 엔지니어링 라인 디퓨저를 배치하여 여기 레이저를 시스템의 감지 채널 간에 동일한 강도로 분산시킵니다. 디퓨저의 각도를 직접 조정하여 5개의 집광 채널이 모두 감지하는 신호의 양을 최대화합니다. 다음은 광학 밀도를 배치합니다.

PMT와 광학 밀도라고 하는 모든 형광 검출 광전자 증배관 앞에 있는 두 개의 중성 밀도 필터. 하나의 중성 밀도가 모든 투과율 감지 앞에 필터링됩니다. PMT는 각 레이저에 대해 1초의 통합 시간으로 레이저의 100개의 시간 펄스 확산 함수 또는 T psfs를 순차적으로 수집하고, 레이저 참조의 시간 드리프트를 보정하는 레이저 참조로 각 TPSF를 정규화하고, 각 검출기 및 각 레이저에 대해 개별적으로 모든 반복에 대해 평균을 계산합니다.

이러한 평균 TPS는 이미징 절차 12시간 전에 광학 이미지 재구성에 사용되는 검출기별 기기 응답 기능입니다. 테스트 마우스에 형광 추적기 칵테일을 주입합니다. 형광 단층 촬영 시스템의 정확한 보정과 동물의 움직임을 제한하는 것은 이 절차에서 가장 어려운 측면입니다.

이미지 재구성은 너무 잘못되어 데이터 수집의 사소한 오류라도 재구성된 이미지에 심각한 오류로 이어질 수 있습니다. 정확한 데이터가 수집되도록 하기 위해 가능한 한 마우스를 고정하고 스캔 전후에 보정을 반복하여 준비가 되었을 때 정확한 보정을 받을 가능성을 높입니다. 마취된 동물을 이미징 베드의 유리 섬유 지지대에 놓습니다.

지속적인 가스 마취를 위해 머리를 콧방울에 넣은 후 이빨을 바이트 바에 고정하고 동물을 테이프로 감습니다. 마우스는 이미징 갠트리의 대략적인 중앙에 위치해야 합니다. 이 포지셔닝은 여기 레이저를 마우스 주위로 180도 회전하여 안내할 수 있으며, 레이저의 초점이 모든 각도에서 레이저의 관점에서 마우스 중심의 한 지점을 대략적으로 비추도록 합니다.

적절하게 배치되면 이미징 베드와 마우스를 마이크로 CT 스캐너로 조심스럽게 옮기고 마우스 머리 전체에 대해 93마이크로미터 등방성 해상도로 해부학적 정보를 수집합니다. CT 이미지 스택을 시각화하고 형광 단층 촬영 시스템으로 이미징할 슬라이스를 선택합니다. 이미징 베드와 마우스를 형광 단층 촬영 시스템으로 조심스럽게 다시 옮깁니다.

각 이미징 슬라이스의 소스 위치 수, 각 TPSF 측정의 통합 시간, 각 소스 위치에 대한 반복 횟수, 앞서 생성한 CT 이미지 스택에서 원하는 이미징 슬라이스의 위치와 수를 선택합니다. 다음으로, 형광 검출 PMT 앞에 필터를 배치하여 모든 여기광과 광학 밀도를 차단하고 투과율 검출 PMT 앞에 있는 중성 밀도 필터를 차단합니다. 이러한 검출기의 포화를 방지하려면 두 여기 파장에서 정의된 각 소스 검출기 위치에서 형광 및 투과율 t psfs를 수집하는 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다.

수집된 모든 T psf 세트에 대해 기준 PMT 채널을 사용하여 레이저 강도를 모니터링하고 기록합니다. 마우스의 외부 표면과 이미징 베드의 위치를 확인합니다. CT 이미지에서 막대를 지지하고 마우스와 이미징 막대의 경계를 커버하는 마스크를 만듭니다.

이와 별도로, 마우스 마스크를 사용하여 거의 빠른 소프트웨어를 사용하여 동물의 유한 요소 메시를 생성합니다. 형광 단층 촬영 시스템의 소스 및 검출기 위치를 마이크로 CT 및 형광 공간 등록 좌표를 기반으로 메시 표면의 위치에 배치합니다. 이미징 베드의 위치와 상호 작용하는 소스 또는 검출기 위치와 관련된 광학 데이터 포인트를 제거합니다.

서포트 로드는 레이저 레퍼런스에 의해 각 소스 검출기 위치에서 수집된 데이터를 정규화하고, 레이저 레퍼런스의 시간적 드리프트를 수정하고, 구매 시 실험적 테스트를 통해 결정된 필터 감도를 수정합니다. 각 소스 검출기 위치에 대한 데이터의 출생 비율을 취하고 균일한 광학 특성을 위해 유한 요소 동물 메시를 기반으로 하는 투과율의 순방향 모델 시뮬레이션을 곱합니다. 이는 소스 또는 검출기 조직 결합과 관련된 오류를 완화하고, 모델에 대한 데이터를 보정하고, 모델 데이터 불일치의 다른 측면에 대한 데이터를 조정하고, 두 파장에서 수집된 출생 비율 데이터의 스케일링된 차이로 구성된 데이터 벡터를 구성하기 위해 수행됩니다.

스케일링 계수는 EGFR 결합 대비를 최대화하고, 각 검출 채널에 대한 TPSF를 입력으로 사용하여 보정된 차이 데이터로 시간 도메인 이미지 재구성을 수행하고, 보이는 대비 강화 표적 추적자의 형광 맵을 생성하기 위해 선택됩니다. 다음은 U2 51 orthotopic glioma 종양이 있는 마우스의 coregistered CT 해부학적 이미지와 중첩된 형광 재구성의 예입니다. 형광 재구성에 의해 결정된 신경교종의 질량 중심은 종양 질량 중심의 1mm 이내였으며, 이는 대비 향상된 자기 공명 영상(enhanced magnetic resonance imaging)에 의해 결정되었습니다.

데이터 수집을 위한 소프트웨어는 이 장치를 위해 맞춤 제작되었지만 대부분의 이미지 처리 기술은 근속 소프트웨어 available@nearfasts.org 를 사용하여 수행할 수 있습니다. 따라서 이 절차를 시도하는 동안 이미지를 재구성하기 전에 시스템과 데이터가 모두 정확하게 보정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 보정을 위해서는 검출기 간의 감도와 시간적 차이를 고려하여 바이오마커 표적 추적자의 이미지를 재구성해야 합니다.

비표적 추적자의 유사한 이미징은 비수용체 매개 흡수를 보정하는 수단을 제공합니다. 이를 통해 추적 결합의 양과 in vivo 수용체 밀도를 개발 후 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 다른 연구자들이 X선 이미징 유도 형광 단층 촬영 시스템을 설계하도록 영감을 주었고 더 큰 동물의 전신 이미징을 위한 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 암 바이오마커 이미징을 위해 X선 해부학적 이미징과 광학 이미징 시스템을 결합하는 확산 형광 단층 촬영 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.