Name: 암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 Tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 Tomography (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 학습하세요 형광 및 엑스레이 영상을 결합한 확산 형광 단층촬영법으로 교모세포종 마우스 모델에서 EGFR 발현을 시각화하는 방법을. 이 기술은 종양 바이오마커 이미징과 분자 치료 모니터링에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 암 연구소의 보조금 R01 CA120368, R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP)과 K25 CA138578 (FL)에 의해 재정 지원 및 보건 연구 박사 화목상은 캐나다 연구소 (KMT되었습니다 ). 형광 tomography 시스템의 개발은 부분적으로 고급 연구 기술 (몬트리올, QC)에 의해 재정 지원되었다.

1. 동물 준비 <ol><li> 케타민을-xylazine (: 10 밀리그램 / kg IP 100 밀리그램 / ㎏)의 내부 복막 주사로 누드 마우스 (찰스 강, 윌밍턴, MA)를 마취. </li><li> stereotactic 프레임 플레이스 마우스, 두개골의 왼쪽에있는 두피에 절개를하고, 18 게이지 바늘을 사용하여 중앙 라인에서 두개골 2mm로 1mm 지름의 구멍과 뒤로 2mm를 만들 bregma. </li><li> 의 표면 아래에 약 2 mm의 깊이에서 왼쪽 대뇌 반구에 인산염 완충 용액 5 μl에 5 × 10 5 U251 인간의 연결을 glioblastoma 세포를 (친절하게 다트머스 대학, 하노버, 뉴 햄프셔에서 박사 마크 이스라엘에서 제공) 주사 뇌. 해밀턴 마이크로 주사기 18 뭉툭한 사용은 세포 주입에 대해 27 게이지 바늘을 종료하고 전지 주머니를 만드는 1mm를 철회 후 두개골의 외부 표면에서 바늘 3mm의 팁을 삽입합니다. </li><li> 봉합사의 절개 사이트 및 재사용을 허용수술에서 covery. </li><li> 종양 이미징 전에 성장할 수 있도록 ~ 14 일 기다리십시오. </li></ol> 2. 형광 Tomography 시스템 보정 <ol><li> 마우스 이미징의 날, 시스템을 시작하고 시스템 감도에 앉을 피하기 위해 약 20 분 동안 레이저와 광 감지기로 워밍업 수 있습니다. </li><li> 놓고 100 °별로-4 ° 이미징 갠트리의 직접적인 중앙 엔지니어링 라인 diffusor (Thorlabs, 뉴튼, 뉴저지), 여기 레이저로 정상 : picosecond-펄스 80-MHz의 멀티모드 635 nm의 레이저 다이오드 (PicoQuant Photonics 북 미국 주식, 웨스트 필드, MA). 다섯 빛을 수집 채널에 의해 감지된 신호의 양을 최대화하기 위해 diffusor의 각도를 조정합니다. 이미징 기하학의 완전한 설명은 다른 곳에서 11,14,15 제공됩니다. </li><li> 놓고 OD 모든 형광 검출 photomultiplier 튜브 (PMT)와 OD 한 중성 밀도 필터 앞에 2 중성 밀도 필터 (Thorlabs, 뉴튼, 뉴저지) (TH모든 투과율 검출 PMTs 앞 orlabs, 뉴튼, 뉴저지). 레이저 100 시간적 펄스 확산 프로파일 (TPSF), 1의 통합 시간을 각 수집합니다. </li><li> 각 검출기에 대한 모든 반복 이상 시간적 레이저 레퍼런스의 표류, 평균에 대한 정확한, 레이저 참조하여 각 TPSF을 정상화. 이러한 평균 TPSFs은 광학 이미지 재건에 사용되는 검출기 특정 악기 응답 함수 (IRF)입니다. </li></ol> 3. 이미징 프로토콜 <ol><li> 산소 (1 L / 분)에서 isoflurane 2%와 마우스를 마취. </li><li> 종양에서 표피 성장 인자 수용체 overexpression을 대상으로 사전 이미징에 인산염 완충 용액, intraperitoneally, 12 H 100 μl에 IRDye 800CW-EGF의 1 nanomole와 알렉사 형석 647 개 중 1 nanomole을 주사. </li><li> 그것의 코는 isoflurane 마취를 전달하는 원추형에 남아 있도록 마우스를 정리, 이미징 침대에서 지원하는 유리 섬유 위에 마우스를 놓습니다. </li><li> 음침대 형광 tomography 시스템으로 보안이 때 마우스 이미징 갠트리의 대략적인 중심임을, 즉 : 마우스가 침대에 적절히 위치되어 있는지 확인합니다. 이 위치는 레이저의 초점은 모든 각도에서 레이저의 관점에서 마우스의 중앙에 대략 요점을 조명 있도록, 마우스에 대해 여기 레이저 180 ° 회전으로 ​​보이는 수 있습니다. </li><li> 일단 위치, microCT (ON 현장, GE 헬스케어, 런던을 탐험) 스캐너로 이미지 침대와 마우스를 조심스럽게를 전송하고 마우스의 전체 머리에 93 μm의 등방성의 해상도로 해부 학적 정보를 수집합니다. </li><li> 중부 표준시 이미지 스택을 시각화하고 형광 tomography 시스템을 몇 군데되는 슬라이스 (들)을 선택합니다. </li><li> 조심스럽게 형광 tomography 시스템에 다시 이미징 침대와 마우스를 전송합니다. 각 이미징 slic에 대해 마우스에 대한 데이터를 수집하는 소스 위치의 개수를 선택하십시오E (32), 각 TPSF 측정 (1의), 각 소스 위치 (10)에 대한 반복의 개수와 단계 3.6에서 중부 표준시 이미지 스택의 위치와 원하는 이미지 조각의 번호 적분 시간. 괄호 안의 숫자는 이미지 슬라이스 당 데이터 수집의 ~ 5 분하였으며 각 이미지 매개 변수의 전형적인 값입니다. </li><li> 채도를 피하기 위해 형광 감지기에 도달으로부터 레이저 빛을 제한하는 형광 검출 PMTs 앞에서 트리플 노치 필터 (채도 기술 공단, 폭포, VT를 벨로우즈), 그리고 투과율 탐지 PMTs 앞에 OD 2 중성 농도 필터를 놓으십시오 이러한 탐지기니다. </li><li> 각 정의된 소스 검출기 위치에 각각의 여기 파장 (각각 알렉사 형석 647 및 IRDye 800CW-EGF 추적기를 자극 635 nm의와 755 nm의)에 대한 형광 및 투과율의 TPSFs를 수집, 데이터 수집 소프트웨어를 실행합니다. TPSFs 수집된 모든 설정 내용은 모니터 및 레이저 강도를 기록참고 PMT 채널과. </li></ol> 4. 이미지 재건 <ol><li> 마우스의 바깥쪽 표면과 중부 표준시 이미지에서 이미징 베드 지원 막대의 위치를​​ 확인하고 별도로 마우스의 굴레와 이미징 봉을 다루고 마스크를 만듭니다. </li><li> NIRFAST 소프트웨어 19 사용하는 동물의 유한 요소 메쉬를 생성하기 위해 마우스 마스크를 사용하십시오. </li><li> microCT 및 형광 공간적 등록 좌표 20 일 기준으로 메쉬의 표면에 형광 tomography 시스템에서 소스와 검출기 위치를 집중하다. </li><li> 이미징 베드 지원 막대의 위치와 상호 작용하는 소스 또는 감지기 위치와 관련된 광학 데이터 포인트를 제거합니다. </li><li> 실험 테스트에 의해 결정되었다 레이저 참조의 시간적 드리프트에 대한 정확한, 그리고 필터 감성에 대한 정확한 레이저 참조하여 각 소스 검출기 위치에서 수집된 데이터, 정상화<html> 구입 15시. </li><li> 각 소스 검출기의 위치에 대한 데이터의 출생 비율 (형광은 투과율로 나눈)를 가지고 균일한 광학 특성에 대한 유한 요소 동물 메쉬를 기반으로 투과율의 전달 모델 시뮬레이션으로 곱하면됩니다. 이것은, 소스 또는 검출기 - 조직 커플링 21과 관련된 오류를 완화하기 위해 모델 22 데이터를 교정하고, 모델의 데이터 불일치 23,24의 다른 측면에 대한 데이터를 조정하기 위해 수행됩니다. </li><li> 두 파장에서 수집된 출생 비율 데이터의 스케일 차이로 구성된 데이터 벡터를 구축. 스케일링 팩터는 EGFR 구속력 대비를 최대화하기 위해 선택됩니다. 입력으로 각각 검출 채널 TPSF를 사용하여 보정 차이 데이터와 시간 도메인 이미지 재건을 수행하고, 명암이 향상된 타겟 추적 15 형광지도를 만듭니다. </li></ol> 5. 대표 결과 &quot;&gt; U251 orthotopic glioma 종양이 그림 1B에 표시됩니다와 마우스의 머리에서 공동 등록 CT 담당자 해부학 이미지와 중첩 형광 재건의 예. 형광 재건 (그림 1B에 의해 결정 glioma의 질량 중심 ) 자기 공명 영상 (그림 1A에게) 대비 - 향상에 의해 결정 질량 종양 중심 1mm 이내였다. 중부 표준시와 MRI 영상이 공동으로 등록된 상호-정보 변환을 기반으로했다. <img src="/files/ftp_upload/4050/4050fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 대비 향상된 (가돌리늄) 마우스 머리의 자기 공명 이미지 (.) 마우스는 U251 인간 glioma 세포 라인 orthotopically 주사되었다. 정상 뇌보다 콘트라스트 에이전트를 흡수 종양의 위치, 왼쪽 대뇌 반구 (오른쪽 이미지)에서 볼 수와 흰색 화살표로 표시됩니다. corresponding 계산된 tomography 이미지 (마우스 머리에 동일한 위치에서) (b)는 표피 성장 인자는 형광 마이너스 타겟이 불분명한 형광 재건 오버레이 대상으로 그려져 있습니다. 형광의 단위는 mm ​​반대하고 있고 그 양자 효율에 의해 및 그 농도를 곱한 바운드 타겟 형광의 흡수 계수와 관련된.

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형광 tomography (FT)는 생물 학적 조직을 통해 보이는 가까운 적외선 전송을 기반으로 민감한, 이온화​​ 방사선 무료 분자 이미징 양상이다. FT에 대한 관심의 대부분은 실험 모델 1과 연구 중 하나가 핵심 영역은 암 biomarker의 표현과 분자 치료법 26 응답의 연구 왔습니다 작은 동물에서 약물 발견과 개발을 진행할 수 있도록 자사의 잠재력에 집중되었습니다. 현재 FT 시스템 설계 두 경쟁하는 방법이 있습니다. 가장 일반적인 디자인은 형광 검출 4-9위한 냉각 전하 결합 소자 (CCD) 카메라를 기준으로합니다. 이 디자인은 CCD 카메라의 각 픽셀 이후 조직 샘플링을 극대화하는 조직을 통해 독특한 경로를 여행했다 빛을 감지할 수, 측정의 높은 밀도를 제공합니다. 그러나 CCD 카메라는 제한된 동적 범위를 가지고 읽기 아웃 소음은 그들의 궁극적인 감도를 제한합니다. 두 번째 디자인은 잠재 limita를 방지<html> photomultiplier 튜브 또는 애벌란치 photodiodes 10-13 등 탐지기의 사용을 바탕으로 고도로 민감한 단일 광자 계수 기술을 채용하여 CCD 카메라 감지의 tions. 이러한 더 민감한 검출 방법의 단점은 각 검출기는 단일 지점에서 빛을 모을 수있다는 것입니다, 따라서 고밀도 조직 샘플링을 달성하기 위해 많은 탐지기 중 하나는 (매우 고가입니다)를 사용해야하거나, 여러 예측이 몇 군데해야 같은 검출기 (많은 시간이 소요가 될 수있는)로. 작은 동물 FT를위한 조직 표본의 최적 수준이 합의되지 않은, 그리고 건별로 다를 수 있지만, 그것은 단일 광자 계수 장비가 더 나은 측면에서 FT의 감도 한계를 탐험하는 데 적합합니다 동의합니다 분자 마커의 낮은 농도를 감지하는 기능. 본 연구에서는 마우스에서 종양을 집중하기 위해 단일 ​​광자 계수 탐지 장비를 사용하여 FT를 수행하기위한 방법론을 제공합니다. 엔트 &quot;&gt; 시간이 서로 관련 단일 광자 계수 FT와 강력한 데이터 세트를 생성하기 위해 관련된 네 중요한 단계가 있습니다. 최초 적합하고 간단한 보정 절차의 응용 프로그램입니다. 제시 방법론에서 각 감지 채널의 각각의 감성이 차지하고있다 각 검출기 15 빛의 동등한 분수 직접하도록 설계된 라인 diffusor 통해 전송되는 여기 빛의 기본적인 측정을 수집하여 위해. 또한, 실험하는 동안 감지된 빛이 지속적으로 두 강도의 측면에서, 레이저 참조로 보정하고 의미있다 . 레이저 레퍼런스 채널 11,15의 작동에 의해 시간이 지남에 따라 변동될 수있는 시간은 두 번째 중요한 단계는 가이드와 형광 reconstructions에 대한 해부 학적 영상의 정확한 수집과 공동 등록은 FT 데이터는 혼자서도 해부 학적 정보를 제공하지 않습니다.; 따라서 가벼운 교통 모델을 만들 수 있도록 싸다을 재구성하는 데 사용할 수있는시편의 표면에서 검출 형광의 표본 내에서 형광 소스의 양이온은 FT 시스템과 관련하여 시편의 해부학 정확하게 알고 있어야합니다. 저희 시스템에서는 해부 학적 정보 spatially FT 시스템 15-20 분들에 등록되어 공간 좌표와 마이크로 계산된 tomography 시스템에 의해 인수되었습니다. 세 번째 중요한 단계는 최적의 노출이 (즉, 각각의 레이저 프로젝션에 대한 전체 광자 검출 시간) 모든 소스 검출기 위치에 고용되어 있도록하는 것입니다. 이것은 두 가지 이유로 중요하다 : 먼저 감지 장치가 손상될 수 검출기 포화를 피하기 위해 각각의 검출 위치에서 신호 대 잡음 충분한와 두번째가 있는지 확인합니다. 각 검출기 위치에서 최적의 노출을 달성하기 위해, 자동 노출 컨트롤이 고용되어 본질적으로 두 낮은 신호 노출 14에서 최적의 노출을 triangulates 있습니다. 네 번째 임계방법론의 단계는 전송된 여기 빛의 금액에 수집된 형광 데이터를 참조하고 있습니다. 이 참조는 종종 출생 비율라는 모델 데이터 불일치 오류 23,24의 완화되는 주요 하나, FT에 대한 많은 혜택을 제공합니다. 제시된 시스템은 쏟아야 2 개의 분리된 photomultiplier 튜브에 각각 검출 채널의 불빛에 의해 동시에 형광 및 전송 모두 여기 광을 감지하도록 설계되었습니다. 이렇게하면, 우리는 출생 비율의 정확성에 대한 운동의 효과를 피하십시오. 강력한 데이터 세트가 손으로, 시간 영역 데이터의 이미지 재건은 식을 갖는 유한 요소 메쉬의 반전 문제 해결과 관련된 : D = Jx 어디 d는 N 소스 검출기 전망 및 M TPSF 시간은 성문을위한 N X 미터 요소 벡터이다; J는 N X M-별로리터 감성 메쉬에서 내가 노드에 대한 행렬 (또는 Jacobian), 그리고 x는 크기 나도 가지고, 각 노드에서 형광 광학 특성 벡터는 d는 실험과 J 수집된 보정 데이터는 유한 요소 솔루션을 사용하여 시뮬레이션입니다. 형광 수송 25 시간 영역 확산 근사치 있습니다. J의 시간 차원은 또한 검출기 특정 악기 응답 기능을 convolved됩니다. x는 관심의 형광지도의 표현이며 Tikhonov regularization 15 Levenberg-Marqardt 음수가 아닌 최소 제곱 접근법을 사용하기위한 해결되었다. 방법론은 형광 검출을 카운트 고도로 민감한 광자를 사용하여 생쥐에서 fluorescently 분류된 종양 현지화 수있는 절차를 설명하는, 여기 제시된 FT의 한계를 넓히고있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이전 연구에서는의 잠재력이 고용같은 쥐뿐만 아니라, 마우스 크기의 표본에서 기존 시스템 설계를 통해 향상된 감도와 같은 크기 이상의 쥐 동물 모델의 접근 방식은, 17을 시연했다. 이 방법의 즉각적인 응용 프로그램은 높은 처리량 의미에서 약물 효능을 평가하는 작은 동물 종양 모델에서 생체내의 biomarker의 표현의 모니터링을위한 것입니다. 여러 파장에서 형광을 자극하고 감지하는 시스템의 능력은 여러 개의 형광 마커의 동시 검출이 가능합니다. 추가 형광 마커는 생체내 구속력 잠재력에 측정하는 듀얼 기자 방법, 수용체 밀도 마커와 같은 양적 이미징 접근 방식을 채용하는 동시에, 병리 현상의 여러 측면을 심문하거나, 본 연구에서와 같이 사용될 수있는 수단을 제공 26,27.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> IRDye 800CW - EGF </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-08446 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 형석 647, succinimidyl 에스테르 </td><td> 생명 기술 </td><td> A20106 </td><td> 비 특정 바인딩을 최소화하기 위해 물을 반응 </td></tr></tbody></table>

암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 tomography

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

작은 동물의 형광 분자 이미징 (FMI)는 잠복기 약물 발견과 개발 연구 1에 대한 강력한 도구가 될 수 있습니다. 그러나 조직 chromophores (예 : 헤모글로빈, 물, lipids, 멜라닌)에 의한 빛의 흡수는 일반적으로 몇 mm 2보다 큰 두께를 통해 광학 신호의 전파를 제한합니다. 다른 가시 파장에 대한 조직의 흡수에 비해 붉은 색과 가까운 적외선 (가까운 IR) 빛의 흡수가 대폭 감소 및 비 탄성 산란이 지배적 가벼운 조직 상호 작용 메커니즘이됩니다. 가까운 적외선 범위 (600-1000 nm의)에서 빛을 흡수하고 방출 형광 요원 중 비교적 최근에 개발이 작은 동물 3에서 입체 영상 몸 전체를 달성할 수있는 이미징 시스템과 빛의 전파 모델의 개발을 주도하고있다. 이 분야에서 커다란 진보에도 불구하고 확산 형광 tomography의 학대 인한 자연은 상당한 남아안정성, 명암 복구 및 영상 재구성 기법과 작은 동물의 FMI에 대한 최적의 접근 방식의 공간적 해상도에 대한 문제에 대해서도 동의되지 않았습니다. 우리 그룹과 몇 가지 다른 10-13 매우 고감도 탐지기를 기반으로 시스템을 추구하는 반면, 연구 그룹의 대다수는, 전하 결합 소자 (CCD) 기반 풍부한 조직 - 샘플링하지만 suboptimal 감도 4-9를 제공할 시스템에 투자 이 시간에 치밀한 조직 샘플링은 낮은 이미징 처리량의 비용에서만 달성될 수 있도록니다. 여기에서 우리는 마우스 모델에서 암의 뇌 병변을 집중하기 위해 형광 tomography 시스템에 단일 광자 검출 기술을 적용하기위한 방법론을 보여줍니다. 형광 tomography (FT) 시스템은 photomultiplier 튜브 (PMT)과 비 접촉 형태 11에서 풍부한 정보를 시간 도메인 빛을 감지를 사용하여 계산 단일 광자 고용. 이것은 동시에 열 수 있습니다전송된 여기 및 방출 빛의 성귀, 그리고이 작은 동물 계산된 tomography (microCT) 시스템 15 자동 형광 여기 노출 제어 14, 레이저 참조 및 공동 등록을 포함합니다. 누드 마우스 모델은 이미징을 위해 사용되었다. 동물은 왼쪽 대뇌 반구에서 인간 glioma 세포주 (U251)과 orthotopically 주사와 2 주후에 몇 군데했습니다. 종양은 형광 추적기 주입하여 형광 었지 IRDye 800CW-EGF 표피 성장 인자 수용체를 타겟 (LI-COR Biosciences, 링컨, NE), 세포 멤브레인 U251 종양 라인에 overexpressed 것으로 알려진 단백질과 많은 다른 암 18. 두번째 타겟이 분명하지 않은 형광 트레 이서, 알렉사 형석 647은 (생명 기술, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)도 추적 바인딩 및 수용체 가용성 / 밀도를 quantifying 수단을 제공하기 위해 타겟 추적기의 이해에 비 수용체 중재 효과에 대한 계정으로 주입되었다 27. CT-가이드, TIME 도메인 알고리즘은 마우스 뇌의 두 형광 추적기의 위치 (즉, 종양의 위치)와 종양은 명암이 향상된 자기 공명 영상에 의해 검증되었다 집중하는 능력을 재구성하는 데 사용되었다. 비록 glioma 마우스 모델에서 형광 이미징을위한 시연이 비디오에 제시된 방법론은 쥐의 17 크기로 잠재적까지 다양한 작은 동물 모델에서 다른 종양 모델로 확장할 수 있습니다.

미만성 형광 tomography는 잠복기로 높은 걸쳐 상대적으로 저렴한 비용과 잠재적인 접근 방식을 제공합니다<em&gt; 생체내에서</em&gt; 종양 이미징. 광학 데이터 수집, 교정 및 이미지 재건의 방법론은 형광 마우스 glioma 모델에서 종양 biomarker 표피 성장 인자 수용체 타겟팅을 사용하여 계산된 tomography 주 도형 비 접촉 시간 영역 시스템에 대해 제공됩니다.

암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 Tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 Tomography

소동물 형광 분자 이미징(FMI)은 전임상 약물 발견 및 개발 연구에서 강력한 도구가 될 수 있습니다1. 하지만 빛은...

다음 실험의 전체적인 목표는 정위성 교모세포종 마우스 모델에서 상피 성장 인자 수용체 발현의 형광 이미지를 생성하는 것입니다. 이는 A IIC 마우스의 좌측 대뇌 반구에 녹색 형광 단백질을 발현하는 인간 U2 51 교모세포종 세포를 접종함으로써 달성됩니다. 종양이 2주 동안 성장한 후, 마우스에 두 가지 형광 추적자로 구성된 칵테일을 주입합니다.그 다음, 정확한 영상 재구성(image reconstruction)에 필요한 해부학적 데이터를 수집하기 위해 소동물 X선 시스템으로 마우스를 촬영합니다. 이 데이터는 광학 단층 촬영 시스템의 광원과 검출기 위치를 해부학적으로 배치하는 데 사용되며, 맞춤형 소프트웨어를 이용해 형광 데이터를 수집하고 최종 영상을 구축합니다. 궁극적으로, 이 방법은 형광 및 X선 영상을 모두 활용하여 표피성장인자(epidermal growth factor)의 과발현을 기반으로 종양 영상을 구축할 수 있으며, 그 정확도는 조영 증강 자기공명영상(contrast enhanced magnetic resonance imaging)과 비교하여 검증할 수 있습니다.전하결합소자(CCD) 기반의 소동물 형광 단층촬영과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 광전증배관을 이용한 단일 광자 계수 검출을 통해 빛 검출에 있어 훨씬 더 높은 민감도와 다이내믹 레인지를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 궁극적으로 표적의 발현을 측정함으로써 분자 치료의 성공 여부를 모니터링하고 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 피하 종양은 표면 이미징을 이용한 비단층촬영 방식으로 쉽게 촬영할 수 있지만, 본 시스템은 최대 수 센티미터 두께의 조직을 투과하여 이미징할 수 있도록 설계되어 뇌종양 내 조영제 전달 및 누출을 이미징하는 데 특히 적합합니다.이 방법은 암 바이오마커 발현에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 감염이나 비만과 같은 다른 질환 연구 또는 알츠하이머와 같은 노화 관련 요소 연구에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 생체 조직 내 빛 전파의 확산 특성과 확산광 재구성을 위한 X선 단층촬영 활용의 어려움으로 인해 고전할 수 있습니다. 따라서 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.데이터 수집 및 이미지 재구성 단계는 습득하기 어려울 수 있으므로, 형광 시스템에서 수집된 데이터가 적절히 보정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. near fast 소프트웨어 패키지는 광학 데이터를 읽어 들여 X선 단층 촬영 이미지를 통해 유한 요소 메쉬를 생성하도록 설계되었으며, 이는 형광 재구성을 위한 공간 템플릿으로 사용됩니다. 먼저 마취된 무삭모(athymic nude) 마우스를 멸균 수술 포 위에 놓고, 진행하기 전에 마취 깊이를 확인한 후 절개 부위의 피부를 세척하고 소독하십시오.Betadine을 사용하여 절개 부위 위에 멸균 수술 포를 덮습니다. 메스를 사용하여 정중선에서 약간 왼쪽, 안구 내 라인에서 뒤쪽으로 0.5 centimeters 지점에 작은 절개를 가합니다. 지표를 확인할 수 있도록 결합 조직을 제거하여 두개골 표면을 깨끗이 닦아냅니다. 두개골이 노출되면, 멸균된 1 millimeter 비트가 장착된 고속 드릴을 사용하여 중앙선에서 왼쪽으로 2 millimeters, bgma에서 뒤쪽으로 2 millimeters 지점에 구멍을 뚫습니다.이식할 세포를 27 gauge 둔단 바늘(blunt ended needle)이 장착된 Hamilton Micros 주사기에 충전합니다. 다음으로, 마우스를 정위 고정틀(stereotaxic frame)에 배치합니다. 그 후 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 깊은 수술 및 미용 마취 단계에 진입했는지 확인하고, 동물에게 수술용 드레이프를 다시 덮어줍니다.다음으로, 시약을 충전한 주사기를 정위 고정 틀(stereotaxic frame)에 고정합니다. 두개골의 구멍 위에 주사기를 위치시키고, 바늘 끝을 두개골 표면에서 3 mm 아래로 삽입합니다. 그 다음, 바늘을 1 mm 뒤로 빼서 포켓을 생성합니다.다음 단계는 5분에 걸쳐 세포를 좌측 대뇌 반구에 천천히 주입하는 것입니다. 주입이 완료되면 바늘을 제거하고 구멍을 Betadine으로 닦아냅니다. 세포가 주입 부위 외로 성장하는 것을 방지하기 위해, 마우스를 정위 고정 장치에서 분리하고 노출된 구멍을 미리 데워둔 bone wax로 채웁니다.마지막으로, 멸균된 5-0 나일론 봉합사로 절개 부위를 봉합합니다. 마우스를 가온 케이지로 옮기고 회복될 때까지 모니터링합니다. 회복 후, 마우스의 복강 내(IP)로 0.1 mg/kg 농도의 부프레노르핀 130 µL를 주입하고, 영상 촬영 전 14일 동안 종양을 성장시킵니다. 마우스 영상 촬영 당일에는 시스템을 가동하여 레이저와 광검출기가 약 20분 동안 예열되도록 합니다.드리프트와 시스템 민감도를 방지하기 위해, 100도 x 4도 설계 라인 디퓨저를 이미징 갠트리의 정중앙에 배치하여 여기 레이저가 시스템의 검출 채널들에 동일한 강도로 분산되도록 합니다. 모든 5개 광수집 채널에서 검출되는 신호량을 최대화하도록 디퓨저의 각도를 수동으로 조정하십시오. 그다음 광학 밀도 필터를 배치합니다.모든 형광 검출 광전증배관(PMT)과 광학 밀도 측정 전단에 두 개의 중성 농도 필터를 배치합니다. 모든 투과율 검출 전단에는 하나의 중성 농도 필터를 배치합니다. PMT는 각 레이저에 대해 1초의 적분 시간을 갖는 100개의 시간적 펄스 확산 함수(T psf)를 순차적으로 수집합니다. 각 TPSF를 레이저 기준값으로 정규화하고 레이저 기준값의 시간적 드리프트를 보정한 후, 각 검출기와 각 레이저별로 모든 반복 횟수에 대해 평균을 냅니다.이러한 평균 TPS는 영상 촬영 절차 12시간 전에 광학 이미지 재구성 과정에서 사용되는 검출기 특이적 기기 응답 함수입니다. 형광 추적자 칵테일을 실험용 마우스에 주입하십시오. 형광 단층 촬영 시스템의 정확한 보정과 동물의 움직임을 제한하는 것이 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다.영상 재구성은 매우 부정형(ill-posed)이기 때문에 데이터 수집 과정에서의 작은 오류만으로도 재구성된 영상에 상당한 오류가 발생할 수 있습니다. 정확한 데이터 수집을 보장하기 위해, 마우스를 가능한 한 최대한 고정하고 스캔 전후로 캘리브레이션을 반복하여 정확한 캘리브레이션 값을 얻을 가능성을 높입니다. 준비가 되면, 마취된 동물을 이미징 베드의 유리섬유 지지대 위에 놓습니다.지속적인 가스 마취를 위해 코 콘(nose cone)에 머리를 위치시킨 후, 바이트 바(bite bar)로 치아를 고정하고 동물을 테이프로 고정합니다. 마우스는 영상 갠트리(imaging gantry)의 대략적인 중앙에 배치해야 합니다. 이러한 위치 설정은 여기 레이저를 마우스 주변으로 180도 회전시켜, 모든 각도에서 레이저의 초점이 마우스의 중앙 지점을 비추는지 확인하여 안내될 수 있습니다.적절하게 위치시킨 후, 이미징 베드와 마우스를 micro CT 스캐너로 조심스럽게 옮기고 마우스 머리 전체에 대해 93 micrometers 등방성 해상도로 해부학적 정보를 수집합니다. CT 이미지 스택을 시각화하고 형광 토모그래피 시스템으로 촬영할 슬라이스를 선택합니다. 이미징 베드와 마우스를 형광 토모그래피 시스템으로 다시 조심스럽게 옮깁니다.각 이미징 슬라이스에 대한 광원 위치 수, 각 TPSF 측정의 적분 시간, 각 광원 위치당 반복 횟수, 그리고 앞서 생성한 CT 이미지 스택에서 원하는 이미징 슬라이스의 위치와 수를 선택하십시오. 다음으로, 모든 여기광을 차단하기 위해 형광 검출 PMT 앞에 필터를 배치하고, 투과도 검출 PMT 앞에는 광밀도 중성 밀도 필터를 배치하십시오. 검출기의 포화를 방지하기 위해, 데이터 수집 소프트웨어를 실행하여 정의된 각 광원-검출기 위치에서 두 가지 여기 파장 모두에 대해 형광 및 투과도 t psf를 수집하십시오.수집된 모든 T psf 세트에 대해, 기준 PMT 채널을 사용하여 레이저 강도를 모니터링하고 기록하십시오. 마우스의 외면과 이미징 베드의 위치를 결정하십시오. CT 이미지에서 지지대를 식별하고, 마우스와 이미징 로드의 범위를 덮는 마스크를 생성하십시오.별도로, near fast 소프트웨어를 사용하여 마우스 마스크로부터 동물의 유한 요소 망(finite element mesh)을 생성합니다. micro CT 및 형광 공간 등록 좌표를 기반으로 형광 토모그래피 시스템의 광원 및 검출기 위치를 망 표면에 국소화합니다. 이미징 베드의 위치와 상호작용하는 광원 또는 검출기 위치와 관련된 광학 데이터 포인트는 제거합니다.지지 로드(Support rods)는 각 광원 검출기 위치에서 수집된 데이터를 레이저 기준점으로 정규화하여 레이저 기준점의 시간적 드리프트를 보정하고, 구매 시 실험적 테스트를 통해 결정된 필터 감도를 보정합니다. 각 광원 검출기 위치 데이터의 본 비율(born ratio)을 구하고, 이를 균일한 광학 특성을 가진 유한 요소 동물 메쉬 기반의 투과율 순방향 모델 시뮬레이션 값과 곱합니다. 이는 광원 또는 검출기의 조직 결합과 관련된 오차를 완화하고, 데이터를 모델에 맞게 보정하며, 모델 데이터 불일치의 다른 측면들을 조정하기 위해 수행됩니다. 두 파장에서 수집된 본 비율 데이터의 스케일링된 차이로 구성된 데이터 벡터를 생성합니다.EGFR 결합 대비를 최대화하도록 스케일링 인자를 선택하고, 각 검출 채널의 TPSF를 입력값으로 사용하여 교정된 차이 데이터로 시간 영역 영상 재구성을 수행하며, 이를 통해 관찰된 대비 증강 표적 추적자의 형광 맵을 생성합니다. 여기 U2 51 정위성 신경교종 종양이 있는 마우스의 코어지스트레이션된 CT 해부학적 영상 위에 형광 재구성 영상을 중첩한 예시가 있습니다. 형광 재구성으로 결정된 신경교종의 질량 중심은 대비 증강 자기공명영상으로 결정된 종양 질량 중심의 1mm 이내에 있었습니다.데이터 수집을 위한 소프트웨어는 이 장치를 위해 맞춤 제작되었으나, 대부분의 이미지 처리 기술은 nearfasts.org에서 제공하는 near fasts 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 따라서 이 절차를 시도할 때는 이미지 재구성 전에 시스템과 데이터가 모두 정확하게 보정되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이러한 보정 과정에서는 바이오마커 표적 추적자의 이미지 재구성 이후, 검출기 간의 감도 및 시간적 차이를 반드시 고려해야 합니다.표적화되지 않은 추적자를 이용한 유사한 영상 촬영은 수용체 비매개성 섭취를 보정하는 수단을 제공합니다. 이를 통해 추적자의 결합량과 생체 내 수용체 밀도를 개발 후 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 다른 연구자들이 X선 영상 유도 형광 단층 촬영 시스템을 설계하도록 영감을 주었으며, 더 큰 동물의 전신 영상 촬영을 위한 길을 열었습니다.이 영상을 시청한 후, 암 바이오마커 이미징을 위해 X선 해부학적 이미징과 광학 이미징 시스템을 결합한 확산 형광 토모그래피 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

뼈 전이의 실험 마우스 모델은 루시페라제 내유 종양 세포를 표현 intracardiac 배달 아래 설립되었습니다. 종양 개발 및 osteolytic 병변을 발생은 bioluminescence과 마이크로 중부 표준시 이미징과 길이 방향 감시했다.

Bioluminescence 및 마이크로 중부 표준시 이미징과 함께 종양의 Metastases 및 Osteolytic 조직 손상을 모니터링

이 기사에서는 방사선 추적자 18F-FDG를 사용하여 PET 및 CT 진단 영상을 통한 암 조직의 다중 모드 영상에 대해 설명합니다. 해당작용이 높은 암 조직은 18F-FDG를 더 많이 흡수합니다.

FDG 기반 PET/CT 스캔: 종양 대사의 비침습적 영상화를 위한 방사선 추적자 사용 방법

이 비디오에서는 마우스 모델에서 형광 단백질이 태그된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 형광 분자 단층 촬영 또는 FMT에 대해 설명합니다. 이 기술은 분자 수준에서 항종양 치료제의 효과를 밝히는 데 유용합니다.

형광 분자 단층 촬영: 마우스 모델에서 형광 단백질 태그가 지정된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 이미징 기술

이 동영상은 형광 매개 단층촬영(FMT)을 사용하여 쥐 대장염 모델에서 장 대식세포 침투를 평가하는 기술을 보여줍니다. 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 통해 마우스에 대장염을 유발하면 대장에 침투한 대식세포의 F4/80 당단백질 마커를 인식하는 항체를 동물에게 주입합니다. 그런 다음 FMT 장치에서 마우스를 이미지화하여 형광 및 반사 신호를 3차원 이미지로 재구성하여 형광의 공간 분포와 강도를 결정합니다.

쥐 장 염증을 평가하기 위한 형광 매개 단층 촬영(Fluorescence-Mediated Tomography) 사용

형광 매개 단층 촬영(FMT)과 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT)을 결합한 하이브리드 이미징 프로토콜을 설명합니다. 융합 및 재구성 후, 우리는 형광 분포의 정량적 측정을 추출하기 위해 대화형 장기 분할을 수행합니다.

하이브리드 μCT-FMT 및 촬상 화상 해석

마이크로 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 선암종 마우스 모델의 폐에서 종양 결절 발달을 감지하는 방법과 시간 경과에 따른 결절 크기 및 치료에 대한 반응 변화를 모니터링하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 평가의 정확성은 종말점 조직학적 정량화로 확인되었습니다.

종양 개발의 평가를 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하고 후속 치료에 대한 반응의를 폐암의 마우스 모델에서

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

여기 우리가 사용 발광, x 선, 그리고 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 이미징 공부 어떻게 억제 mTOR 활동 영향이 종이 식 모델에서 골 engrafted 발성 종양. 이로써 순수 관련, 비-침략 적, 및 복합 요법 골 engrafted 발성 종양에서 vivo에서대상의 안티 발성 효과의 분석.

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

학습하세요 형광 및 엑스레이 영상을 결합한 확산 형광 단층촬영법으로 교모세포종 마우스 모델에서 EGFR 발현을 시각화하는 방법을. 이 기술은 종양 바이오마커 이미징과 분자 치료 모니터링에 활용됩니다.

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