단일 셀 및 단일 스파이크 해상도 suprathreshold 신경 활동의 광 기록

FollowMe 실험의 전반적인 목표는 많은 수의 뉴런에서 발생하는 신경 스파이크 활동을 기록하는 것입니다. 이는 첫 번째 단계에서 형광 현미경을 사용하여 각 활동 전위와 관련된 뉴런 소마에서 세포 내 칼슘 농도의 증가를 관찰함으로써 달성됩니다. 두 개의 광자 여기(two photon excitation)와 랜덤 액세스 스캐닝 원리(random access scanning principle)는 40개의 뉴런 소마토(neuron somato)에서 칼슘 형광 신호를 높은 공간 및 시간 해상도로 기록하는 데 사용됩니다.

두 번째 단계에서는 디콘볼루션 알고리즘을 사용하여 형광 신호에서 정확한 스파이크 타이밍을 추출합니다. 이 기술은 수십 개의 뉴런에서 스파이크 활동을 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 그런 다음 스파이크 데이터를 사용하여 상호 정보, 뉴런 집단 간의 신호 전파 또는 신경 상관 관계를 측정할 수 있습니다.

마이크로 전극 기록과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 지역 인구의 많은 뉴런에서 뉴런 스파이킹 활동을 기록할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 상관관계의 중요성, 정보 검색 및 코르티코 가소성을 가진 네트워크 역학의 변화와 같은 뉴런의 로컬 네트워크 수준에서 피질 기능에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.두 광자 여기의 경우 펨토초 펄스가 있는 적외선 펄스 레이저 시스템이 사용됩니다. 높은 레이저 출력은 시스템의 광학 구성 요소에 의해 발생하는 큰 손실을 상쇄하기 위해 필요합니다.

두 개의 프리즘으로 구성된 시스템당 프리처는 커스토 광학 편향기에 앞서 레이저 펄스에 음의 그룹 속도 분산을 부여하여 AOD에 의해 도입된 시간적 분산을 보상하고, 큰 조리개를 가진 두 개의 AOD는 레이저 빔을 2차원으로 편향시킵니다. 밀리미터당 100개의 홈이 있는 반사 회절 등급은 AOD에 의해 도입된 공간 분산을 보상하기 위해 AOD 뒤에 13cm 배치됩니다. 짧은 레이저 펄스를 사용할 때 레이저 빔은 두 개의 릴레이 망원경을 사용하여 정립 현미경의 카메라 포트로 향하게 됩니다.

Irises는 광학 구성 요소의 정렬을 위해 일정한 간격으로 배치됩니다. 대물렌즈 전면의 이색성 빔 스플리터는 적외선 여기광을 표본으로 전송하고 표본의 형광을 검출기로 반사합니다. Epi 및 trans 형광 검출기는 대물렌즈를 통해 형광 신호를 수집하고, 여기광이 검출기에 도달하는 것을 방지하기 위해 콘덴서 컬러 유리 필터를 검출기 앞에 배치합니다.

A OD 편향 각도는 디지털 아날로그 컨버터 보드가 장착된 컴퓨터에 의해 제어되며, 이는 차례로 전압 제어 발진기를 구동합니다. 광 증배의 신호는 차단 주파수가 100 킬로헤르츠인 저역 통과 버터워스 필터를 통해 중계되고 분석을 위해 컴퓨터에 저장되기 전에 156.25 킬로헤르츠 클럭 속도로 아날로그 디지털 변환기에 의해 디지털화되며, 정렬 및 전기 잡음은 광 증배의 저이득 및 고이득에서 레이저 광이 있거나 없는 형광 신호의 분포를 기록하여 테스트됩니다. 지표가 있거나 없는 경우뿐만 아니라 디더링된 무작위 액세스 스캔은 칼슘의 세포 내 증가 감지에 의존합니다. 프로토콜의 첫 번째 단계는 볼루스 주사를 통해 많은 수의 뉴런을 에스더 형태의 칼슘 지시약으로 염색하는 것입니다.

다음으로, 각 위치에서 6.4마이크로초 동안 4개의 각 뉴런에서 소마의 활동을 기록합니다. 관심 있는 뉴런을 선택하려면 256 x 256 픽셀로 구성된 전체 프레임을 획득하십시오. 그런 다음 이 이미지 내에 기록할 뉴런의 중심을 수동으로 선택합니다.

각 중심 주위로 2미크론 거리에 있는 3개의 지점은 각 주기의 제어 소프트웨어에 의해 자동으로 추가됩니다. 형광 신호는 40개 뉴런 모두의 4개 위치에서 기록됩니다. 한 주기에서 모든 뉴런을 기록하려면 1.536밀리초가 필요합니다.

40개의 모든 뉴런을 5초 동안 순차적으로 기록하는 것을 반복합니다. 형광 체세포 칼슘 신호에서 스파이크 감지는 높은 신호 대 잡음비에 의존합니다. 높은 신호 대 잡음비는 여기 강도를 증가시켜 달성할 수 있습니다.

그러나 여기 강도는 사진 손상으로 인해 특정 한계까지만 증가 할 수 있습니다. 광 손상이 낮고 신호 대 잡음비가 단일 스파이크를 감지하기에 충분한 경우 여기 강도의 매우 작은 창만 있어 기록된 신호가 높은 스파이크 감지 창 내에 있는지 확인합니다. 실험 중에는 우리 연구실에서 개발한 여러 온라인 분석 소프트웨어가 사용됩니다.

다음으로, 약 100 - 200밀리초의 기준선 잡음의 짧은 시간 창에서 뉴런당 대략적인 광자 속도를 계산합니다. 광자의 수와 광자 비율은 상대 형광 변화의 분포를 이 방정식에 맞추어 형광 값에서 계산한 다음 동일한 시간 창에서 기준선 형광을 계산하고 시간 또는 시행의 함수로 표시합니다. 레이저 출력을 조정하여 베이스라인의 평균 감소를 초당 0.0002 미만으로 유지합니다.

이 제한을 초과할 경우 스파이크 감지가 급격히 감소하기 때문입니다. 그 후, 전체 프레임 이미지를 획득하여 10-20분마다 뉴런 체세포 위치를 확인합니다. 필요한 경우 녹음 위치를 조정합니다.

신경 활동으로 인한 형광 신호는 칼슘 과도기의 긴 붕괴 때문에 종종 제 시간에 먹혔습니다. 이 절차에서는 디콘볼루션 방법을 사용하여 형광 신호에서 스파이크 및 스파이크 타이밍을 사용합니다. 여기서는 유전 알고리즘을 사용하여 기록된 형광 신호에 맞는 가장 가능성이 높은 스파이크 트레인 모델을 결정합니다.

알고리즘이 반복될 때마다 최대 가능성은 형광 기록의 노이즈에 의해 제공되는 최대값에 점근적으로 접근합니다. 뉴런의 동질적인 집단에서 스파이크가 유발한 칼슘 신호는 뉴런마다 다를 수 있습니다. 대규모 데이터 세트에 대한 비지도 분석을 위해 많은 수의 거짓 양성 탐지를 피하기 위해 뉴런에서 뉴런으로 스파이크 유발 칼슘 신호의 변화를 고려하는 알고리즘을 설계했습니다.

단일 스파이크가 유발된 칼슘 과도 상태의 진폭과 감쇠 시간 상수의 결합 분포는 동일한 실험 조건에서 동일한 유형의 뉴런에서 별도의 실험 세트에 기록됩니다. 느린 기준선 변화를 고려하고 디콘의 계산 비용을 줄이기 위해, 더 긴 기록은 각 기록의 각 뉴런에 대해 1-5초의 여러 짧은 트레이스로 나뉘며, 디콘볼루션 알고리즘은 디콘볼루션 속도를 높이기 위해 최대 100만 개 이상의 서로 다른 모델까지 많은 수의 모델을 테스트할 수 있으며, 하나의 실험은 최대 10개의 서로 다른 컴퓨터에서 디컨볼루션됩니다. 병렬로.

디콘볼루션 후 스파이크 데이터를 분석하고 검사합니다. peri stimulus time, 히스토그램, 스파이크 확률 및 뉴런 발화 속도는 자동화된 방식으로 계산됩니다. 다음은 검출 창 내에서 매우 낮은 여기율로 기록된 형광 신호와 매우 높은 여기율로 기록된 형광 신호의 예입니다.

각 예는 하나의 스파이크에 대한 응답을 보여줍니다. 여기에 보이는 것은 급성 뇌 절편과 동일한 피질 기둥에 배치된 두 개의 자극 피펫의 사진 현미경 사진입니다. 레이어 4에서 이들은 반복적인 자극에 대한 신경 반응을 보여주고, 이 그래프는 기록된 뉴런 모집단에 의해 신호를 받은 Shannon의 상호 정보를 보여줍니다.

다음은 피질 뉴런의 서로 다른 집단 간의 슈퍼 임계값 스파이킹 활동의 전파 측정입니다. 이것은 피질 뉴런에서 감지된 스파이크, 즉 탈 피질 섬유의 전기 자극에 대한 반응입니다. 랜덤 액세스 스캔을 사용하여 뉴런 활동을 기록할 때 감지 창 내에 기록하는 것이 매우 중요합니다.

그렇지 않으면 사용할 수 없는 데이터 세트로 끝나기 쉽습니다. 광학 스파이크 감지는 아직 초기 단계입니다. 개선의 여지가 많습니다.

몇 가지 개선을 통해 더 많은 뉴런에서 기록합니다. 다른 개선 사항을 통해 우리는 깨어 있고 행동하는 동물을 기록 할 수도 있습니다.