개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법 생체 내

다음 실험의 전반적인 목표는 생리학적으로 관련된 시간 척도에서 유전적으로 정의된 뉴런 집단을 빠르게 활성화하거나 침묵시키는 것입니다. 이는 유전적으로 정의된 뉴런에 청색광 뉴런 활성화 채널 옵신 또는 녹색 광 뉴런 침묵 홀 옵신을 암호화하는 전이유전자를 운반하는 바이러스 벡터를 전달함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 기록 전극에 부착된 광섬유로 구성된 발광 연산 도로가 건설되어 광 전달과 전기 기록을 동시에 수행할 수 있습니다.

다음으로, TRO는 Opsin 형질도입 뇌 영역 위에 위치하여 아래로 내려갑니다. 채널 옵신 및 ha 옵신 매개 반응을 유발하기 위해 개별 뉴런을 기록할 수 있는 단일 단위 기록 기술을 기반으로 채널 redsin 및 ha hallin 형질 전환 뉴런의 광 유도 활성화 및 억제를 보여주는 결과를 얻습니다. 이 방법은 빛이 밀리초 해상도와 특정 신경 아형으로 신경 활동을 유도하는 데 얼마나 효과적인지 정확히 결정할 수 있도록 함으로써 신경 과학의 근본적인 요구를 해결하고, 이를 Chin Nakamura가 입증할 것입니다.

내 실험실의 박사후 연구원: 바이러스를 준비하고 취급하는 동안 생물 안전 레벨 1 절차를 따르고 동물과 관련된 모든 지역 및 정부 지침을 준수하는지 확인합니다. 정위 주사를 하기 전에 바이러스 분취액을 얼음 위에서 해동시킨 다음 잠시 회전시킵니다. 탁상형 원심분리기에서 Hamilton 유리 주사기와 바늘에 소량의 실리콘 또는 미네랄 오일을 천천히 채웁니다.

주사기 배럴에 보이는 기포가 없는지 확인하십시오. 주사기를 마이크로 인젝터 펌프에 삽입하고 펌프를 수직 입체 암에 직접 부착합니다. 바이러스 부분 표본 튜브를 안정된 위치로 설정한 후 바늘 끝이 바이러스 부분 표본 튜브의 바닥에 닿을 때까지 입체 표본 암을 내립니다.

마이크로 인젝터 펌프용 컨트롤러를 사용하여 원하는 양의 바이러스를 회수합니다. 케타민과 자일라진으로 쥐를 마취한 후 표준 무균 방법을 사용하여 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 발가락 꼬집음에 대한 반사 반응을 확인합니다. 작은 수술용 가위나 메스로 동물의 두개골 위에 있는 피부를 통해 정중선을 절개한 후 동물을 정위 장치에 넣습니다.

결합 조직을 부드럽게 분리하고 작은 뼈 스크레이퍼로 두개골 상단을 청소합니다. 바늘을 내리고 bgma 및 lambda의 Z 좌표가 같은지 확인하여 머리가 수평임을 확인합니다. 그런 다음 입위축(stereotaxic arm)을 관심 있는 뇌 구조에 해당하는 좌표로 이동합니다.

수술용 펜으로 주사하려는 위치를 표시하십시오. 휴대용 드릴을 사용하여 목표 부위의 두개골을 조심스럽게 얇게 만듭니다. 드릴 비트가 두개골 바닥에 닿으면 멈추고 한 쌍의 매우 가는 집게를 사용하여 얇아진 뼈를 제거합니다.

경막이 노출된 후 주사기 바늘을 대상 부위에 놓고 경막에 닿을 때까지 바늘을 내립니다. 그리고 이 점을 사용하여 z를 계산합니다. 이제 적절한 Z 위치에 도달할 때까지 주사 바늘을 뇌로 아주 천천히 내립니다.

이 프로토콜에서는 내측 전전두엽 피질의 전변연계 영역이 표적화됩니다. 분당 0.1마이크로리터의 속도로 바이러스를 주입합니다. 주사가 완료된 후 바이러스가 뇌 표면으로 역류하는 것을 방지하기 위해 바늘을 빼기 전에 10분 정도 기다립니다.

바늘이 부착된 봉합사를 사용하여 피부를 봉합한 후 상처에 항생제를 도포합니다. 먼저 초강력 접착제를 사용하여 1-1.5 메가 옴 텅스텐 전극을 유리 모세관 튜브에 부착합니다. 그런 다음 광섬유 스트리핑 도구를 사용하여 다중 모드 광섬유의 맨 끝을 노출시키고 광섬유 팁을 에탄올로 매우 가볍게 청소합니다.

쐐기 모양의 다이아몬드 나이프로 섬유 끝에 점수를 매기고 가는 집게를 사용하여 여분의 섬유를 조심스럽게 제거합니다. 섬유는 점수에서 쉽게 절단되어야 합니다. 광 파워 미터를 사용하여 광섬유 끝의 레이저 강도를 측정합니다.

생체 내 기록의 경우, 평방 밀리미터당 20-100밀리와트의 광 강도는 각각 뉴런 활동의 채널 redsin 또는 hallin 매개 활성화 또는 침묵을 안정적으로 유발할 수 있습니다. 그런 다음 광섬유를 모세관에 삽입합니다. 섬유 팁을 텅스텐 전극 끝에서 약 500미크론 위에 놓고 전극과 섬유가 직선이 되도록 팁 근처의 몇 지점에 얇은 봉합사를 두 번 묶습니다.

전극 끝과 가장 가까운 매듭 사이의 거리가 여기에서 볼 수 있듯이 대상 영역에 삽입할 수 있을 만큼 충분히 긴지 확인하십시오. 이전과 같이 동물이 수술을 받을 수 있도록 준비합니다. 그런 다음 초기 개두술을 가이드로 사용하여 두개골에 새롭고 깨끗한 작은 창을 만드십시오.

tro 포지셔닝을 위해. 가는 바늘을 사용하여 경막을 작게 절개합니다. 두개골 창을 통해 TRO를 조심스럽게 낮추고 마이크로미터 매니퓰레이터를 사용하여 뇌로 형질주입된 부위로 이동합니다.

그런 다음 빛에 반응하는 셀이 나타날 때까지 10-50 미크론 단계로 오프로드를 천천히 전진시킵니다. 여기에서 랩 뷰로 작성된 맞춤형 소프트웨어 사용자 인터페이스는 단일 다이오드 레이저를 제어하고 진행 중인 신경 활동을 시각화 및 기록하는 데 사용됩니다. 기록된 신호는 0.3-8킬로헤르츠로 필터링된 ex AMP 20K 앰프 대역 통과와 내셔널 인스트루먼트의 아날로그-디지털 보드로 캡처됩니다.

neuro lux Pro 사용자 인터페이스를 통해 아날로그 입력과 디지털 출력을 선택할 수 있습니다. 뉴런 및 트랜지스터 트랜지스터 로직 또는 TTL 신호에 대해 두 개의 아날로그 채널을 선택합니다. 샘플링 속도를 20킬로헤르츠로 설정하고, 기준 조명 전 기간을 2초로, 조명 후 기간을 2초로 설정합니다.

그런 다음 TTL 레이저 자극 펄스 폭, 주파수 및 자극 기간을 설정합니다. 여기서 주파수는 20Hz이고 자극 기간은 500밀리초이며, 이는 펄스 폭이 정의된 10개의 레이저 펄스가 전달됨을 의미합니다. 사용자는 연속 광 전달 또는 반복 녹음을 선택할 수 있습니다.

그들은 펄스 사이의 간격과 펄스 변형률의 수를 선택할 수 있습니다. 녹음 후 디스크에 기록하거나 기록하지 않고 데이터를 가져올 수 있습니다. 동물은 승인된 절차에 따라 희생되고 뇌 조직은 여기에 표시된 바와 같이 미식 배치 및 옵신 발현을 확인하기 위해 처리됩니다.

광 전달과 전기생리학적 기록을 동시에 수행하도록 설정된 Neuro LX Pro 소프트웨어 인터페이스의 이 스크린샷은 Hall Rod Dobson이 10초 동안 532나노미터의 연속적인 빛 전달에 반응하여 랩 전 변연계 파라메탈 세포의 자발적 활동을 침묵으로 유도한 것을 보여줍니다. 이 사진은 등쪽 울루에서 대표적인 할로 레진(hallo redsin) 표현을 보여줍니다. 오른쪽의 회로도는 사진이 촬영된 위치를 나타냅니다.

화살촉은 텅스텐 전극의 위치를 나타내고 화살표는 광섬유의 위치를 나타냅니다. 이 사진은 전변연계 피질(pre limbic cortex)에서 대표적인 채널 옵신 발현을 보여줍니다. 다시 말하지만, 오른쪽의 회로도는 사진이 촬영된 위치를 나타냅니다.

화살촉은 텅스텐 전극의 위치를 나타내고 화살표는 광섬유의 위치를 나타냅니다. 쥐의 변연계 전 피질에서 기록된 이 예시 추적은 파란색 막대로 표시된 대로 각각 10밀리초 동안 파란색 473나노미터의 20헤르츠 전달에 대한 응답으로 두 개의 트리거된 활동 전위가 있는 채널 redsin을 보여줍니다. 아래. 래스터 플롯은 6개의 대표적인 뉴런에서 채널 redsin 유도 스파이크를 보여줍니다.

각 단위 활동은 점으로 그려집니다. 이 예시 추적은 동일한 뇌 영역에서 녹색 막대로 표시된 대로 10초 동안 연속적인 녹색 532나노미터 조명 조명 동안 홀 옵신이 자발적 활동의 억제를 유도했음을 보여줍니다. 래스터 플롯은 6개의 대표 뉴런에서 haller dosin에 의해 유도된 침묵을 보여줍니다.

각 단위 활동은 점으로 그려집니다. 이 이미지는 기록 시작 후 0, 30, 60, 90 및 120분 시점에 유발된 빛의 스파이크, 스파이킹, 생체 내 전압, 쥐의 절름발이 전 초금속 뉴런의 반복적인 20Hz 채널 옵신 구동 스파이크를 왼쪽에 표시합니다. 오른쪽의 래스터 플롯은 빛 유도 활성화의 61회 반복을 모두 보여줍니다.

각 단위 활동은 점으로 그려집니다. 여기 생체 내에서, Haller Dossin 형질도입 쥐 등쪽 sicm의 전기생리학적 기록이 맨 위에 표시됩니다. 예제 추적은 Hall Dobson을 표현하는 등쪽 잠수부의 녹색 막대로 표시되는 10초 연속 532나노미터 조명이 자발적인 활동을 제거한다는 것을 보여줍니다.

다음은 위의 추적에서 기록된 두 장치의 평균 파형입니다. 진폭 임계값은 두 개의 별개의 뉴런을 식별하는 데 사용되었습니다. 마지막으로, 래스터 플롯은 이러한 단위의 Haller dossin 유도 침묵의 5회 반복을 보여줍니다.

각 단위 활동은 점으로 그려집니다. 마지막으로, 이 이미지는 0, 30, 60, 90 및 120분 시점에서 획득된 빛의 생체 내 전압 스파이크에서 쥐 등쪽 하부 뉴런의 반복적인 20헤르츠 채널 옵신 구동 스파이크를 보여줍니다. 녹음의 시작 부분이 왼쪽에 표시된 후 아래 삽입은 이 셀의 일반적인 버스트 활동을 보여줍니다.

오른쪽의 래스터 플롯은 빛 유도 활성화의 61회 반복을 모두 보여줍니다. 각 단위 활동은 점으로 그려집니다. 이 기술은 특정 신경 하위 유형이 장기간 활성화되거나 침묵될 수 있음을 보여주기 때문에 중요합니다.

실제로 우리는 2시간 이상 뉴런을 활성화하고 적용할 수 있음을 입증했습니다. 궁극적인 목표는 주의력이나 기억 작업을 수행하는 동물의 행동하는 동물에게 이것을 적용하여 특정 회로를 활성화하고 그것이 다른 기억 기능을 어떻게 제어하는지 볼 수 있도록 하는 것입니다.