Name: 인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 배우세요 인간 췌장 Islets의 H&E 및 면역조직화학 염색법을 통한 특성 분석 기법을. 이 방법은 내분비 구성, 세포 증식 및 염증 반응을 평가하여 당뇨병 연구에 활용됩니다.

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저자는 기증자의 가족과 전문가의 도움이 연구와 에밀리 몽고메리, 로버트 Pietras, 앤 푸, Mitali Agarwal, 그리고 Roshan Agarwal에 관련된 장기 조달 기관 감사드립니다. 이 작품은 당뇨병과 췌장 장기 기증자를위한 네트워크를 지원 소아 당뇨병 연구 재단 (MC-T.)에 의해 재정 지원되었다.

1. 흠없는 섹션에 대한 Microtomy <ol><li> 표준 파라핀의 microtomy위한 한 물 목욕 및 마이크로톰를 설정합니다. 사건 번호, 췌장 영역 (샘플)과 슬라이드 번호를 긍정적으로 기소 슬라이드 미리 레이블을 사용합니다. 왼쪽에있는 카세트 레이블 마이크로톰 척의 장소 파라핀 블록. </li><li> 조직이 균일하게 발생 때까지 블록으로 정상 microtomy 절차, 섹션을 따릅니다. 시리얼 섹션 (두께 4 μm의, 초기 필수 얼룩의 수에 따라 3-6 (사례 제출 양식 부록 1 참조))의 리본을 생산하고 있습니다. 리본의 별도의 섹션, 연필로 번호가 매겨진 순서로 슬라이드에 순서대로 각 데리러, 장소. 섹션 정확한 순서 섹션 번호에 의해 사용되지 않는 경우 나타냅니다. 왼쪽으로 지향 슬라이드 레이블 카세트에서 발견으로 슬라이드에 동일한 방향을 유지합니다. 실온에서 하룻밤 건조 후 조사관에게 염색법 또는 배포와 함께 진행합니다. </li><li> 해상도실온 또는 -20 ° C.에 조직 및 아카이브를 보존하기 위해 파라핀의 얇은 레이어와 파라핀 블록의 표면 eal </li><li> 이후 microtomy 들어, 위와 같이 각 레벨에서 시리얼 부분에 대해 번호 유지합니다. 한 추가적인 슬라이드를 확보하고 각 블록 내의 각 ~ 100 μm의 수준을 위해 H &amp; E 슬라이드로 얼룩. </li></ol> 2. H &amp; E 염색법 <ol><li> autostainer의 첫 트레이에 다음 슬라이드 선반의 각 블록의 첫 번째 시리얼 sectioned 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 표준 H &amp; E 얼룩 프로그램을 선택하고 평소와 같이 진행합니다. </li><li> 염색법을 완료하면 coverslipping 위해 후드에 autostainer과 장소에서 슬라이드를 제거합니다. </li><li> 표준 기술을 사용 Coverslip. 인쇄된 라벨 (섹션 12 참조)과 함께 철저히 및 레이블 건조합니다. </li></ol> 3. IHC 설정 <ol><li> 이중 얼룩과 슬라이드의 입력 번호에 대한 Dako 프로그램을 선택합니다. TBST와 구연산 버퍼, 항체 및 기타 reag 준비지정된 볼륨 (표 1)에 따라 행군. 시약 트레이와 슬라이드를로드합니다. 깨끗하고 폐기물 라인의 회전은 제조 업체의 권장 사항에 따라 프로그램됩니다. </li><li> 수동 assays를 수행하는 경우 예상 볼륨을 준비합니다. 어느 단계에서 말리는 슬라이드를 피하기 위해 humidified 챔버에서 슬라이드를 품어. autostainer에 사용하면 각 시약에 대해 동일한 절차를 따르십시오. </li></ol> 4. IHC의 Deparaffinization 및 항원 불러오기 <ol><li> 5 분 크실렌에 슬라이드를 넣고. 한 번 반복합니다. 이것은 과도한 배경과 가난한 염색법을 초래하므로 표시된 때까지 슬라이드 후속 지점에서 밖으로 건조하도록 허용하지 마십시오. </li><li> 2 분 동안 100 % 에탄올로 슬라이드를 전송합니다. 한 번 반복합니다. </li><li> 10 분 동안 메탄올의 신선한 3% H 2 O 2에 슬라이드를 넣고. </li><li> 90 % 에탄올에서 그리고 물놀이 슬라이드는 3 분 동안 90 % 에탄올에 넣습니다. </li><li> 전송로 슬라이드1 분 70 %의 에탄올. </li><li> 드 이온화 물에 슬라이드를 씻어. </li><li> 예열 스티머 5 분간 기선의 구연산 완충액. </li><li> 30 분 증기선과 증기에 버퍼를 구연 산염하기 슬라이드를 추가합니다. </li><li> 즉시 물로 슬라이드를 전송하고 상온 (~ 20 분)까지 시원한 슬라이드 때까지 누르고 있습니다. </li><li> 시퀀스 (그림 1) 얼룩에 따라 Dako autostainer 랙에에 슬라이드를 전송하며 이중 염색법 프로그램을 실행합니다. autostainer 프로그램의 주요 단계는 수동 실행이 중복 수 있도록 나열됩니다. </li></ol> 5. 첫 차 항체 (KI-67, 인 경우에는 3 번 CD, 췌장 폴리펩티드) <ol><li> 15 분 동안 스나이퍼 솔루션으로 슬라이드를 차단하십시오. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 30 분 동안 일차 항체의 슬라이드를 품어. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 30m 위해 Mach2 염소 항 마우스 (KI-67) 또는 안티 - 토끼 (인 경우에는 3 번 CD, 폴리펩티드 췌장) 말과 무 퍼옥시데이즈 (HRP) 폴리머로 품어inutes. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 4 분간 슬라이드로 3,3-diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB)을 적용합니다. 물로 두 번 씻는다. </li><li> 폴리펩티드 췌장과 incubated 슬라이드가 동시에 assayed중인 Dako 개최되며 나머지 슬라이드는 일차 항체의 두 번째 세트 incubated하는 동안 모든 후속 단계에 사용 TBST. 또는 수동 assays 들어, 섹션 6으로 진행합니다. </li></ol> 6. 둘째 차 항체 (인슐린, 글루카곤) <ol><li> 20 분 동안 DEEB에서 슬라이드를 품어. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 20 분 TBST (인슐린) 또는 TBST에서 스나이퍼 (글루카곤)의 20 % 아비딘 차단에서 10 % 정상 염소 혈청으로 차단. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 15 분 동안 인슐린이나 글루카곤 일차 항체와 부화. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 인슐린 : 30 분 1:300 희석시 biotinylated 염소 안티 기니 돼지에서 품어 슬라이드. TBST로 두 번 씻는다. 표준했습니다 함께 알을 품다30 분 ctor ABC-AP 시약. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 글루카곤 : 30 분 동안 염소 항 마우스 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (서울 = 연합 뉴스) 폴리머이어서 30 분 동안 버퍼에 품어 슬라이드. TBST로 두 번 씻는다. </li><li> 슬라이드가 conjugates에 incubated하는 동안 실온으로 LPR 버퍼를 따뜻하게. Dako 시약 선반에서 사용 장소 전에 즉각 세 ML 버퍼 당 액체 영구 레드 1 방울 (LPR)를 추가합니다. 4 분간 LPC에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻는다. </li><li> 1 분 hematoxylin에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻어. </li><li> 1 분 TBS 산도 7.6에서 슬라이드를 품어. 물로 두 번 씻어. </li><li> DAKO Autostainer에서 슬라이드를 언로 드합니다. </li><li> 즉시 폴리펩티드 췌장에 대해 묻다 슬라이드를 탈수. 모든 이중 스테인드 슬라이드 들어, 최소 1 시간 동안 건조한 후 탈수. </li></ol> 7. 탈수 <ol><li> 장소는 1 분 80 % 에탄올에 슬라이드. </li><li> 95 % 에탄올에 슬라이드를 찍어. </lI&gt; <li> 30 초 동안 95 %의 에탄올에 슬라이드를 잡아. </li><li> 100 % 에탄올로 슬라이드를 전송하고 1 분 누르고 있습니다. 반복합니다. </li><li> 크실렌의 딥 슬라이드. </li><li> 1 분 크실렌에 슬라이드를 잡아. 반복합니다. </li><li> 즉시 cytoseal를 사용하여 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. </li></ol> 8. 슬라이드 레이블 <ol><li> 오르간과 블록 번호, 얼룩, 날짜 및 인쇄를 포함하여 케이스 식별 정보를 입력합니다. 시리얼 섹션 번호는 각 블록의 첫 번째 슬라이드 얼룩을위한 선택 사항입니다. 후속 수준은 번호로 표시됩니다. </li><li> 슬라이드에 레이블을 배치합니다. </li></ol> 9. 슬라이드 스캔 <ol><li> 스캐너 트레이에 스테인드 슬라이드를 삽입하고 장비에 따라 검사합니다. </li><li> 기증자와 조직 유형 (췌장의 머리, 몸, 꼬리, 비장)에 의해 슬라이드를 구성합니다. </li><li> -20 ° C에서 실내 온도와 나머지 흠없는 슬라이드에서 보관 스테인드 슬라이드가 사용까지. </li></ol> 10. Representative 결과 이러한 염색법 절차는 파라핀 및 신선한 냉동 블록의 기본적인 특성을 제공하는 당뇨병 (nPOD)과 췌장 장기 기증자에 대한 JDRF 네트워크를 위해 개발되었다. 각 기증자는 기본적인 특성을 가지고이 각각 췌장 영역에서 블록 (머리, 몸, 그리고 꼬리)와 비장 (그림 1도 사례 제출 양식 부록 1 참조)을 더럽히는 것 구성되어 수행했습니다. H &amp; E 염색법은 전체에서 사용되는 임상 수준의 솔루션과 임상 시설에 관해서는 프로그래밍 autostainer를 사용하여 진행됩니다. 추가 공여 블록 sectioned있는 바와 같이, 각각의 조직 형태를 보여주 H &amp; E를 위해 찍은 슬라이드를 가지고 있습니다. 블록이 다시 sectioned가되면, 조사관에게 배포으로 깊은 수준은 또한뿐만 아니라 각 수준에서 시리얼 부분을 번호로 전체 블록의 조직 형태를 문서화하는 대표적인 H &amp; E 슬라이드에 대한 슬라이드를 촬영한 것입니다. 스테인드 슬라이드는으로 표시됩니다케이스 식별, 췌장 영역, 블록 번호, 얼룩 및 날짜 (그림 2)와 온라인 병리 정보 관리 시스템에 스캔. 제어 기증자의 대표 이미지는이 절차에 따라 예상되는 결과를 보여 낮은과 높은 배율 모두에서 그림 3에 표시됩니다. 검정 수동으로 수행하고 hematoxylin counterstain의 감소 더럽히는 것 강도를 보여줍와 폴리펩티드 췌장 (D, H)과 슬라이드 스테인드은 서로 다른 날짜에 assayed되었다. 일차 항체의 강도를 더럽히는 것의 차이 또는 assays 사이 counterstain 특히 개별적인 색상 보정이 동일한 셀 영역이나 카운트를 달성하도록 요구와 이미지 분석을 통해 별도로 슬라이드면 피해야하는 것입니다. 각 연구실은 많은 투 많은 편차 및 기타 시약 및 조건 염색법 강도와 특이성에 영향을 미칠 수 있으므로 항체 농도를 최적화 것으로 기대한다. 신규 정말이에요 취득과 함께신사는 염색법 절차 전 시약과 마찬가지로 얼룩 강도의 동일한 수준을 달성하는 것으로 알려져 긍정적이고 부정적인 컨트롤 샘플 확인하고 있습니다. nPOD 병리 코어에 최적화된 추가 항체는 참조 소스로 표 2에 제공되며 공촛점 현미경을위한 immunofluorescence assays를 multilabeling 사용되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. Dako의 염색법의 격자.이 도식은 Dako의 autostainer에서 수행 nPOD 기증자 췌장에서 일상적인 분석을 묘사. nPOD 기증자는 4 자리 식별​​ 번호로 코딩하고 있습니다. 두 슬라이드 트레이는 얼룩 주최 슬라이드로 표시됩니다. 대체 슬라이드 구성은 기증자 슬라이드의 숫자에 따라 예상된다. 긍정적인 컨트롤은 두 개의 더블 얼룩 및 KI-67 인 경우에는 3 번 CD를위한 기증자 비장에 대한 알려진 긍정적인 기증자의 포함을 포함합니다. 음성 제어 이배가 두 SLI를 포함데스 인슐린과 글루카곤을위한 기증자 비장의 기본 항체 두 슬라이드의 호스트 종에서 면역 글로불린 (IG)와 incubated 한 사람 거였어요의 췌장 블록에서. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 디지털 스캔 작업이 수행되기 전에 대표적인 두 스테인드 슬라이드. 전형적인 완성된 슬라이드는 슬라이드 라벨링 매개 변수와 조직 배치와 함께 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 대표 H &amp; E와 췌장 섹션에 IHC 얼룩. 성인 여성의 장기 기증 (6096-04 팬헤드야)의 췌장에서 구간은 스테인드와 같은 프로토콜에 설명된 실시 디지털 스캔했다. 이미지가 전체 섹션 (AD)의 한 섬 (EH)에서 ImageScope 보는 프로그램을 사용하여 획득했다. 인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드에 대한 예상 섬 얼룩 농도입니다이 췌장 헤드 블록은 모든 islets은 주로 췌장 폴리펩티드-긍정 세포를 포함하는으로 uncinate 지역이나 복부 췌장 엽의 일부가 포함된 섹션 차원 delineates로 섹션 BD에 대해 관찰했다. hematoxylin는 B와 C의 농도가 최적입니다 counterstain 동안 패널 D에서 hematoxylin counterstain가 너무 가벼운 것이 있습니다. EH 패널은 β-세포와 α-세포 예상 분포와 지느러미 엽의 섬을 보여줍니다. 몇 췌장 폴리펩티드 세포 섬 (H)의 왼쪽 하단 부분에서 발견된다. , E-H &amp;E; B, F-Ki67 + 인슐린, C, G-인 경우에는 3 번 CD + 글루카곤, D, H, 췌장 폴리펩티드. 광고, 0.2x, EH-12.8x.

<ol><li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li>
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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

시간의 경과에 슬라이드 다수에 걸쳐 컴퓨터 기반 알고리즘을 사용하여 특히 때 IHC 절차의 표준화, 이미지 분석을 위해 중요합니다. 이 보고서에 설명된 IHC 염색법의 절차는 8 시간 노동 일 이내 autostainer를 사용하여 주어진 기증자의 샘플 배치 분석을 허용할 것이며, 이전의보고 5에서 수정됩니다. 각 스테인드 슬라이드 디지털 전체 슬라이드 이미지가 웹 기반의 온라인 병리 시스템을 통해 nPOD - 제휴 조사관에게 제공했다. 수사 당국은 슬라이드와 함께 기증자 인구 통계, 실험실 데이터 및 기타 관련 임상 기록을 검토하고 (참조 학업을위한 블록이 가장 적합한 선택하실 수 있습니다 수 <a href="http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php" target="_blank">http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php을</a> 자세한 정보) . 이러한 온라인 병리 시스템은 &quot;가상 biobank&quot;로 제공합니다. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 30 % 과산화수소 (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> 내생 퍼옥시데이즈 차단 </td></tr><tr><td> ABC-알칼리 인산 분해 효소 (서울 = 연합 뉴스) </td><td> 벡터 </td><td> AK-5000 </td><td> AP 켤레축 </td></tr><tr><td> 항체 희석액 </td><td> Invitrogen </td><td> 003,218 </td><td> 일차 항체 </td></tr><tr><td> 아비딘 차단기 </td><td> 벡터 </td><td> SP-2001 </td><td> 내생 비오틴 차단 </td></tr><tr><td> Biotinylated 염소 안티 기니 돼지 </td><td> 벡터 </td><td> BA-7000 </td><td> 이차 항체 </td></tr><tr><td> 시약을 청소법 </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> Leica autostaineR </td></tr><tr><td> 구연산 버퍼, 산도 6.0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> 항원 검색 </td></tr><tr><td> Clarifier 일 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Coverslip mountant </td></tr><tr><td> DAB </td><td> 벡터 </td><td> SK-4100 </td><td> HRP chromogen </td></tr><tr><td> DEEB </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td> 내생 AP는 시약을 차단 </td></tr><tr><td> 알콜 Eosin Y </td><td> FisherScientific </td><td> 71,204 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Ethanols-백퍼센트 95 % 90 % 70 % </td><td> FisherScientific </td><td> 여러 </td><td> Deparaffinization 및 coverslipping </td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako autostainer </td></tr><tr><td> Hematoxylin 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> IgG (일차 항체에 대한 모든 호스트 종) </td><td> 여러 </td><td> 여러 </td><td> 예비 선거에 대한 부정적인 컨트롤 </td></tr><tr><td> 액체 영구 레드 (LPR) </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP chromogen </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare 의료 </td><td> MALP521L </td><td> 염소 항 마우스 AP 켤레축 </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare 의료 </td><td> MHRP520L </td><td> 염소 항 마우스 HRP 켤레축 </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare 의료 </td><td> RHRP520L </td><td> 염소 항 마우스 HRP 켤레축 </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> FisherScientific </td><td> 여러 </td><td> H 2 O 2 희석제 </td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 </td><td> 벡터 </td><td> S-1000 </td><td> IHC 차단 시약 </td></tr><tr><td> 저격병 </td><td> Biocare 의료 </td><td> BS966M </td><td> IHC 차단 시약 </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHC 버퍼 </td></tr><tr><td> Triology 20x </td><td> 세포 나포 </td><td> 920P-06 </td><td> 항원 불러오기 </td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> FisherScientific </td><td> 여러 </td><td> Deparaffinization 및 coverslipping </td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약. <table border="1"><tbody><tr><td> 일차 항체 </td><td> 호스트 종 </td><td> 공급 업체 </td><td> 고양이. # </td><td> 코멘트와 항원 불러오기 </td></tr><tr><td> 파라핀 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아밀라아제 </td><td> 마우스 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-46657 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Amylin </td><td> 마우스 </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 탄소 anhydrase 19.9 </td><td> 마우스 </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Caspase-3, 죽습 </td><td> 토끼 </td><td> 세포 시그널링 </td><td> 9961 </td><td> 구연산 또는 부작 </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td> 구연산 또는 부작 </td></tr><tr><td> 인 경우에는 3 번 CD </td><td> 토끼 </td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> 마우스 </td><td> 세포 시그널링 </td><td> 3569 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td> 구연 산염 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> CD45 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 를 Chromogranin </td><td> 토끼 </td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> C-펩타이드 </td><td> 토끼 </td><td> 세포 시그널링 </td><td> 4593 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Foxp3 </td><td> 쥐 </td><td> 전자 Bioscience </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Ghrelin </td><td> 염소 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td> Ghrelin </td><td> 토끼 </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> 글루카곤 </td><td> 토끼 </td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> 글루카곤 </td><td> 마우스 </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 글루카곤 </td><td> 기니피그 </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> GLUT-1 </td><td> 마우스 </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> 삼부작 </td></tr><tr><td> GLUT-2 </td><td> 토끼 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-9117 </td><td> 인간 islets로 표현되지 않음 </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 기니피그 </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> KI-67 </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Mafa </td><td> 토끼 </td><td> Novus 생물 </td><td> NB400-137A </td><td> 삼부작 </td></tr><tr><td> 폴리펩티드 췌장 </td><td> 토끼 </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Pdx-1 </td><td> 기니피그 </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> 구연산 또는 부작 </td></tr><tr><td> Proinsulin </td><td> 마우스 </td><td> Novocastra </td><td> NCL-proin-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> Proinsulin </td><td> 마우스 </td><td> 발달 연구 하이 브리 도마 은행 </td><td> GS-9A8 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> 토끼 </td><td> 시그마 </td><td> 고전력 증폭기 006,641 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 부드러운 근육 actin </td><td> 토끼 </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Somatostatin </td><td> 토끼 </td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptophysin </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td> 구연 산염 </td></tr><tr><td> 냉동 신선한 </td><td> 호스트 종 </td><td> 공급 업체 </td><td> 고양이. # </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> 쥐 </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> 4 % PF으로 수정 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> 토끼 </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> 마우스 </td><td> Novus 생물 </td><td> NB 600-564 </td><td> 파라핀 섹션에 대한 하룻밤 배양을 사용하여 </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> 마우스 </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> 아세톤으로 고정 </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> 마우스 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC-130569 </td><td> 4 % PF으로 수정 </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> 마우스 </td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td> 아세톤 또는 4 %의 PF으로 수정 </td></tr></tbody></table> 표 2. 일차 항체. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Aperio Scanscope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> 디지털 슬라이드 스캐너 </td></tr><tr><td> DAKO Autostainer 플러스 </td><td> DAKO </td><td></td><td> IHC의 얼룩 </td></tr><tr><td> 라벨 매트릭스 인쇄 소프트웨어 </td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td> 슬라이드 레이블 소프트웨어 </td></tr><tr><td> Leica XL Autostainer </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E 얼룩 </td></tr><tr><td> 프리미엄 Coverglass </td><td> FisherScientific </td><td> 12-548-5J </td><td> Coverslip </td></tr><tr><td> 스펙트럼 정보 관리자 </td><td> Aperio </td><td></td><td> 스캐너 소프트웨어 </td></tr><tr><td> Superfrost 플러스 슬라이드 </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> 적극적으로 청구 슬라이드 </td></tr><tr><td> 야채 기선 </td><td> 검정과 데커 </td><td> 여러 </td><td> 항원 검색 </td></tr><tr><td> 얼룩말 TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> 슬라이드 라벨 ​​프린터 </td></tr></tbody></table> 표 3. 특정 물품 및 장비.

인간의 췌장 islets위한 염색법 프로토콜

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

섬 지역과 숫자, 성인 인간의 췌장의 내분비 세포 성분의 예측은 몇 십만에서 500에서 1,500 밀리그램 1-3으로 수백만 및 베타 질량 범위에 따라 다릅니다. 이 알려진 이질로 표준 처리 및 염색법 절차는 췌장 영역이 명확하게 정의되고 islets가 엄격한 조직 병리학 및 immunolocalization 시험을 사용하여 특징되었습니다 있도록 개발되었습니다. 장기 기증자에서 발견한 인간의 췌장을 처리를위한 표준화된 절차는이 시리즈의 파트 1에 설명되어 있습니다. 췌장은 가로 섹션 뒤에 세 주요 영역 (머리, 몸, 꼬리)로 처리됩니다. 췌장의 머리에서 가로축 부분이 더 나뉩니다 같은 크기에 따라 표시하고, 하위 섹션을 나타냅니다하기 가나다순으로 정리. 이러한 표준화가 이루어진 islets을 포함 uncinate 지역을 포함한 헤드 지역의 전체 교차 단면 분석을 위해 수주로 꼬리 지역에 췌장 폴리펩티드의 세포. 현재의 보고서는이 시리즈의 일부 2를 구성하고 섬 내분비 세포, 복제, 그리고 T 세포 infiltrates에 대한 강조와 함께 췌장 파라핀 섹션의 시리얼 sectioning 및 histopathological 특성화에 사용되는 절차를 설명합니다. 췌장 섹션의 병리는 두 exocrine, ductular 및 내분비 구성 요소를 특성화하기위한 것입니다. exocrine 구획은 특히 췌장 intraductal neoplasia 4의 존재에 대한 관계에서, pancreatitis의 존재 (활성 또는 만성), 위축증, 섬유증, 그리고 지방뿐만 아니라 덕트 시스템에 대해 계산됩니다. Islets은 형태, 크기, 밀도, 내분비 세포, 염증, 섬유증, 아밀로이드, 그리고 H &amp; E와 IHC 얼룩을 사용하여 복제 또는 apoptotic 세포의 존재를 평가하고 있습니다. 파트 2에서 설명한 마지막 구성 요소는 스테인드 슬라이드의 제공입니다디지털 전체 슬라이드 이미지로의. 디지털 슬라이드는 가상 biobank를 만들어 온라인 병리 데이터베이스의 경우, 췌장 영역으로 구성됩니다. 이 온라인 컬렉션에 대한 액세스는 현재 제 1 형 당뇨병 연구에 관련된 200 개 이상의 임상의와 과학자에게 제공됩니다. 온라인 데이터베이스는 파라핀 또는 냉동 시리얼 섹션에 대한 블록을 선택하는 신속하고 완벽한 데이터 공유 및 수사를위한 수단을 제공합니다.

이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H &amp; E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H &amp; E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역은 췌장 폴리펩티드에 대한 IHC를 사용하여 지역화된됩니다.

인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

성인 인간 췌장의 췌도 면적 및 개수, 내분비 세포 구성에 대한 추정치는 수십만 개에서 수백만 개까지 다양하며...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 헤마톡실린-에오신(hematoxylin and eosin) 염색 및 면역조직화학법을 사용하여 인간 췌장 섬을 특성화하는 것입니다. 이는 파라핀 블록에 매립된 췌장 샘플로부터 연속 절편을 제작함으로써 수행됩니다. 이후 제작된 절편들을 원래의 방향대로 슬라이드 위에 배치합니다.슬라이드의 일부는 hematoxylin과 eosin으로 염색하고 나머지 슬라이드는 면역조직화학염색으로 염색하며, 마지막 단계로 염색된 슬라이드를 스캔하여 증례별로 정리합니다. 최종적으로, 이 이미지들을 온라인 병리 데이터베이스에 업로드하여 해당 분야의 다른 연구자들이 확인할 수 있도록 할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 슬라이드의 원래 방향을 유지하면서 연속적으로 염색할 수 있다는 점입니다.본 절차의 시연은 저희 실험실의 조직 기술자인 Linda Snyder, 생물학자인 Emily Montgomery, 그리고 실험실 기술자인 Tiffany Hippo가 진행하겠습니다. 우선 파라핀 미세절편 제작의 표준 절차에 따라 항온수조와 마이크로톰을 설정하십시오. 그다음 양전하 슬라이드에 사례 번호, 췌장 부위 및 슬라이드 번호를 표기하십시오.모든 준비가 완료되면 파라핀 블록의 카세트 라벨이 왼쪽에 오도록 마이크로톰 척에 고정합니다. 일반적인 박절 절차에 따라 조직이 균일하게 노출될 때까지 블록을 절단합니다. 조직이 고르게 나타나면 약 4 µm 두께의 연속 절편 리본을 제작합니다.초기 염색에 필요한 횟수에 따라 3~6개의 절편이 필요합니다. 다음으로, 리본 형태의 절편들을 분리합니다. 각 절편을 순서대로 집어 슬라이드 위에 올립니다.연필로 절편 번호를 기록하십시오. 사용할 수 없는 절편이 있는 경우, 해당 번호는 건너뛰고 절편 번호를 정확한 순서대로 계속해서 매기십시오. 슬라이드 라벨이 왼쪽을 향하도록 하여, 카세트 내의 슬라이드와 동일한 방향을 유지하도록 주의하십시오.다음으로, 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣고 하룻밤 동안 건조시킵니다. 실온에서 파라핀 블록의 표면을 얇은 파라핀 층으로 다시 밀봉하여 조직을 보존하고, 실온 또는 -20 °C에서 보관합니다. 다음 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다.위의 H&amp;E 염색 사례와 같이 각 단계에서 연속 절편의 번호를 유지하는 것이 중요합니다. 각 블록에서 추출한 첫 번째 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣은 다음, 랙을 자동 염색기의 첫 번째 트레이에 배치합니다. 표

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연구

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Medicine

의학

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연을위한 절차 : 수정된 자동화된 방법을 사용하여 (부분 I 소화 및 췌장 조직의 수집).

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집

당뇨병 연구 분야에 중요한 도전은 섬 β 세포 복제를 조절하고 β - 세포 재생을 자극하는 방법을 개발하는 분자 메커니즘을 이해한다. 여기서 높은 콘텐츠 스크리닝 방법 식별 및 작은 분자의 β 세포의 복제를 촉진 활성을 평가하기 제시된다.

높은 콘텐츠<em&gt; 체외</em&gt; 췌장 작은 섬의 β 세포 복제 디스커버리 플랫폼

여기에서는 β세포 증식에 대한 후속 면역형광 분석을 통해 배양에서 온전한 마우스 섬에 관심 부하가 있는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세구의 화합물을 생성하고 관리하는 방법론을 제시합니다. 이 방법은 후보 β세포 유사분열제의 효능을 측정하는 데 적합합니다.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

이 프로토콜은 섬 분리 및 정제를 위한 돼지 췌장 조달을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

Islet 격리를 위한 돼지 췌장의 외과적 관류 및 격리

이 연구는 췌장섬에서 사이토카인 유도 세포사멸 및 세포 특이적 사멸을 평가하기 위해 컨포칼 현미경과 결합된 세포 사멸 및 세포자멸사에 대한 다중 염색 형광 기반 마커β 활용합니다. 그것은 세포 외 자극에 대한 반응으로 세포 사멸과 세포 사멸의 공간적, 시간적 변화를 보여줍니다.

Isolated Pancreatic Islet Treatment 및 Apoptosis 측정

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

배우세요 인간 췌장 Islets의 H&E 및 면역조직화학 염색법을 통한 특성 분석 기법을. 이 방법은 내분비 구성, 세포 증식 및 염증 반응을 평가하여 당뇨병 연구에 활용됩니다.

인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

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