인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

본 절차의 전반적인 목표는 hematoxylin 및 eosin 염색과 면역조직화학 염색을 사용하여 인간 췌장 섬을 특성화하는 것입니다. 이는 파라핀 블록에 매립된 췌장 샘플로부터 연속 절편을 제작함으로써 수행됩니다. 이후 절편들을 원래의 방향대로 슬라이드 위에 배치합니다.

슬라이드의 일부는 hematin과 eoin으로 염색하고 나머지 슬라이드는 면역조직화학 염색을 수행하며, 마지막 단계로 염색된 슬라이드를 스캔하여 증례별로 정리합니다. 최종적으로, 이러한 이미지들을 온라인 병리 데이터베이스에 업로드하여 해당 분야의 다른 연구자들이 확인할 수 있도록 할 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 슬라이드의 원래 방향을 유지하면서 연속적으로 염색할 수 있다는 점입니다.

시연은 제 실험실의 조직 기술자인 Linda Snyder, 생물 과학자인 Emily Montgomery, 그리고 실험실 기술자인 Tiffany Hippo가 진행하겠습니다. 먼저 파라핀 미세절편 제작의 표준 절차에 따라 항온수조와 마이크로톰을 설정하십시오. 그다음 양전하 슬라이드에 사례 번호, 췌장 부위 및 슬라이드 번호를 표시하십시오.

모든 준비가 완료되면, 카세트 라벨이 왼쪽에 오도록 파라핀 블록을 마이크로톰 척에 고정하십시오. 일반적인 마이크로토미 절편 제작 절차에 따라 조직이 균일하게 노출될 때까지 블록을 절단하십시오. 조직이 고르게 나타나면, 두께 약 4 µm의 연속 절편 리본을 제작하십시오.

초기 염색이 필요한 횟수에 따라 3~6개의 절편이 필요합니다. 다음으로, 리본 형태의 절편들을 분리합니다. 각 절편을 순서대로 집어 슬라이드 위에 올립니다.

연필로 섹션 번호를 기록하십시오. 섹션을 사용할 수 없는 경우, 해당 번호는 건너뛰고 정확한 순서대로 섹션 번호를 계속 매기십시오. 슬라이드 라벨이 왼쪽을 향하도록 하여 카세트에서 확인한 것과 동일한 방향으로 슬라이드에 배치하는 것에 주의하십시오.

다음으로, 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓고 하룻밤 동안 건조시킵니다. 실온에서 파라핀 블록의 표면을 얇은 파라핀 층으로 다시 밀봉하여 조직을 보존하고, 이를 실온 또는 -20 °C에서 보관합니다. 다음 샘플에 대해서도 이 절차를 반복합니다.

위의 H&E 염색 예시와 같이 각 단계별 연속 절편의 번호를 유지하는 것이 중요합니다. 각 블록에서 추출한 첫 번째 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣은 다음, 랙을 자동 염색기의 첫 번째 트레이에 배치합니다. 표준 HE 프로그램을 선택하고 염색 과정을 시작합니다.

염색이 완료되면 자동 염색기에서 슬라이드를 꺼내 커버글라스를 덮기 위해 후드 내에 둡니다. 표준 기술을 사용하여 각 슬라이드에 커버글라스를 덮습니다. 마지막으로, 인쇄된 라벨을 사용하여 슬라이드에 표시하고 후드 내에서 완전히 건조시킵니다.

자동 염색기를 설정하고 필요한 모든 시약을 준비하는 것으로 시작하십시오. 이중 염색의 경우 Daco 프로그램을 선택하십시오. 슬라이드 수와 각 슬라이드에 적용할 처리 방법을 입력하십시오.

제조사의 권장 사항에 따라 모든 시약을 자동 염색기에 로드하십시오. 다음으로, 실험 절차에 필요한 TBST 및 시트르산 완충액, 항체 및 기타 시약을 준비하십시오. 슬라이드를 자일렌에 5분 동안 담가 탈파라핀 처리하십시오.

슬라이드가 마르지 않도록 주의하십시오. 슬라이드가 탈파라핀화되는 동안 마르게 되면 배경 및 기공 염색이 과도하게 나타날 수 있습니다. 사용 전, 시트르산 완충액을 스티머에 부어 예열하십시오. 그다음, 탈파라핀화된 슬라이드를 일련의 에탄올 세척 과정에 넣으십시오.

슬라이드를 탈이온수로 마지막으로 헹굽니다. 예열된 시트레이트 완충액에 슬라이드를 넣고 30분 동안 증기 처리합니다. 이 시간이 지나면 슬라이드를 즉시 상온의 수조로 옮겨 완전히 식을 때까지 둡니다.

냉각 후, 슬라이드의 순서가 바뀌지 않도록 주의하며 Dayco 자동 염색기 랙으로 옮깁니다. 마지막으로, 이전에 로드한 이중 염색 프로그램을 실행합니다. 이중 염색 프로그램이 완료되면, 자동 염색기에서 슬라이드를 꺼내 탈수시키기 전 최소 1시간 동안 건조시킵니다.

탈수를 계속하기 위해, 슬라이드를 80%ethanol에 1분 동안 옮겨 둡니다. 슬라이드를 95%ethanol과 100%ethanol에 차례로 담가 탈수를 계속 진행합니다. 마지막으로, 슬라이드를 xylene에 1분 동안 담급니다.

절차를 완료하기 위해 cyto seal을 사용하여 즉시 커버 슬립으로 슬라이드를 마운팅하십시오. 장기 및 블록 번호, 염색 유형 및 날짜를 포함한 케이스 정보가 담긴 라벨을 출력하십시오. 염색 슬라이드를 스캔하기 위해 각 슬라이드에 라벨을 부착하십시오.

슬라이드를 스캐너 트레이에 놓고 표준 절차를 따르십시오. 염색된 슬라이드는 실온에 보관하고, 남은 미염색 슬라이드는 향후 사용을 위해 -20 °C에서 보관하십시오. 마지막으로, 염색된 이미지를 공여자 및 확인된 조직 유형별로 정리하십시오.

저배율과 고배율 모두에서 KI 67 및 인슐린 염색이 이루어진 예시입니다. 염색된 췌장 절편의 이미지는 온라인 병리 데이터베이스에 제출되어 가상 바이오뱅크를 구축합니다. 연구자들은 이 데이터베이스를 사용하여 연구 및 1형 당뇨병에 필요한 정보에 빠르게 접근할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 인간 췌장으로부터 고품질의 슬라이드를 제작하고 염색하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.