Name: 췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 학습하세요 췌장 섬 파라핀 섹션 제작 방법을 통해 당뇨병 연구에서 다양한 결과를 평가하는 효율적인 기술을 익히세요. 이 방법은 저량의 췌장 섬 재료에서 최적의 실험 수율을 달성합니다.

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우리는 기꺼이 도움이 조언과 토론에 대 한 우수 UMass 당뇨병 센터에서 베타 세포 생물학 그룹 인정합니다. 인간의 췌 장 독도 여는 NIDDK 자금 통합 섬 배포 프로그램 (IIDP) 희망의 도시에 제공 했다. 이 작품은 NIH/NIDDK에 의해 투자 되었다: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP)와 미국 당뇨병 협회에 의해 공동으로 아마 란 스의 순서 #1-15-학사-003 (LCA)을 부여.

동물 관련 된 모든 절차는 UMass 의료 학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다. 인간의 섬 연구는 인간을 대상의 사용을 포함 하지 않는 때문에 IRB 검토 또는 면제에 대 한 자격 하지 UMass 기관 검토 위원회에 의해 결정 했다.
1. 섬 격리와 문화
<ol><li>독도 분리 하 고 외 분 비 및 ductal 조직 선택의 방법을 사용 하 여 오염에서 분리. 참고:이 방법은 독도 콜라 ductal insufflation 및 Ficoll 분리12 (설치류) 또는 통합 섬 배포 프로그램 (IIDP13, 인간)에서 후 선적 독도 격리를 사용 하 여 최적화 되었다. 독도 P200 micropipette로 뽑아서 했다.</li>
	<li>섬 형태를 최적화 하려면 독도 10 mL 완전 한 섬 매체 (와 10 %FBS, 페니실린/스, 5.5 mmol/L 포도 당 RPMI) 37 ° c.에 5% CO2 를 포함 하는 습도 챔버에 밤새 복구 허용 이 단계는 섹션을 얻이 필요가 없습니다,는 독도 더 그대로 복구 기간 후 ( 그림 2참조).</li>
</ol>2. 섬 고정
<ol><li>낮은 바인딩 P200 팁을 사용 하 여, 약 250 섬 등가물 (IEQ)13 1.5 mL 낮은 바인딩 microfuge 관으로는 stereomicroscope에서 보정된 그리드를 사용 하 여 따. 낮은 바인딩 팁 및 튜브 섬 손실을 줄일.</li>
	<li>독도 microfuge 관의 바닥에 정착을 허용 합니다. 대부분 상쾌한 P200 피펫으로 팁, 어떤 독도 제거 하지 않도록 주의 복용 제거 합니다.</li>
	<li>PBS의 1 mL를 추가 합니다. 속도 200 x g에 도달할 때까지 튜브 스윙 양동이 원심 분리기에 원심 고 스핀을 중단. 제거는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한 PBS 세척을 반복 합니다.</li>
	<li>10% 포 르 말린 용액 또는 갓 만든 4% paraformaldehyde 500 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실내 온도에 수정. 이 방법에서는 테스트 결과 대 한 이러한 종류의 고정 방식이 구별할 수 없었다. 짧은 고정 또한 수 있습니다; 원하는 결과 대 한 고정 기간을 최적화 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>P200 팁 정착 액을 제거 합니다.</li>
	<li>PBS의 1 mL를 추가 합니다. 속도 200 x g에 도달할 때까지 튜브를 원심 고 스핀을 중단. 제거는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한 PBS 세척을 반복 합니다.</li>
	<li>즉시 다음 단계를 진행 합니다.</li>
</ol>3. 섬 디스크 (그림 1)의 준비
<ol><li>처음 사용에 70 ° C에서 (예를 들어, Histogel) 젤을 녹여 고 aliquots 1.5 ml에서 장기 저장용 microfuge 관. Aliquot 볼륨 aliquots 다시 사용 될 수 있기 때문에 중요 한, 아니다.</li>
	<li>배치 microfuge 관 70 ° c.에 설정 열 블록에 젤 약 수를 포함 하 여 70 ° C에서 젤 (샘플 당 약 100 µ L)를 따뜻한</li>
	<li>1.5 mL 깨끗 microfuge 관으로 블루 agarose 구슬 (10 µ L 각 샘플)를 전송 합니다. 철저 하 게 pipetting 전에 구슬 resuspend. 참고: 파란색 구슬 agarose 단추와 파라핀 블록에 포함 된 자료의 시각적 식별을 지원 하기 위해 독도와 혼합 됩니다. 사용 하는 파란 구슬 수 결과에 중요 한 하지만 과도 한 구슬 방지 (> 5 독도의 수 배) 섹션에서 독도의 최적의 배포를 허용 하도록.</li>
	<li>1 mL PBS와 함께 파란 구슬 두 번 씻는 다. 각 세척에 대 한 회전 구슬 800 x g에서 1 분. 두 번째 세척 후 10 µ L PBS, 여기서 n 은 샘플 튜브; 수 x (n+ 2) 구슬 resuspend 예를 들어 2 샘플 튜브, 구슬에 추가할 PBS 볼륨 40 µ L 것입니다.</li>
	<li>원심 microfuge 관 독도 (간단한 스핀 200 x g)을 포함 하 고는 상쾌한의 대부분을 제거 합니다. 가 위 또는 칼 10 µ L micropipette 팁의 끝을 잘라내어 각 샘플에 대 한 깨끗 한 팁을 사용 하 여 각 섬 튜브에 구슬의 10 µ L를 추가. ()을 피하기 위해 독도 잃고 혼합 하지 마십시오.</li>
	<li>독도 구슬 (200 x g 간단한 스핀) 원심. 포경 10 µ L micropipette 팁 가능한 많은 PBS를 제거 합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드 샘플 식별에 대 한 레이블을 지정 합니다. 2 ~ 3 샘플 각 슬라이드에 준비 될 수 있다. 따뜻하게 젤으로 열 블록 근처 벤치에 슬라이드를 놓습니다. 면도날 또는 위 샘플 당 20 µ L 낮은 바인딩 micropipette 팁 3 ~ 5의 끝을 잘라. 다른 하나에서 전환 급속 한 수 있도록 컷 팁 두 P20 micropipettes을 로드 합니다.</li>
	<li>첫 번째 micropipette를 사용 하 여, 추가 15-20 µ L 따뜻한 젤의 독도/구슬 microfuge 관; 즉시 혼합, 피하 거품; 형태로 슬라이드에 액체 한 천/독도/구슬 혼합물을 적용 한 < 1 cm 직경 디스크. 디스크 공간 외부 젤 링 슬라이드 가장자리 근처에 배치 (다음 단계). 부드럽게 몇 번 독도 비즈를 해결 하기 위해 슬라이드를 누릅니다.</li>
	<li>두 번째 micropipette를 사용 하 여 샘플 튜브를 따뜻한 젤의 20 µ L를 추가 합니다. 원본 디스크를 둘러싼 슬라이드에이 혼합물을 적용 다음 첫 번째 micropipette, 모든 나머지 독도/구슬, 응고, 시작 하는 경우 다시 열 블록에 온난화와 혼합 새로운 젤을 사용 하 여. 디스크는 원하는 크기와 두께 추가 미리 잘라 팁을 사용 하 여 필요에 따라 반복 합니다. 참고: 외부 반지는 약간 두꺼운 경우 쉽습니다 gelled 디스크 처리. 일반적으로, 젤의 3 x 20 µ L은 충분 합니다. 이 단계 튜브 세척 하 여 독도의 손실을 최소화 하 고 섬-가난한 agarose 디스크 처리를 촉진 하기 위하여 디스크의 바깥쪽에 추가 됩니다.</li>
	<li>각 디스크를 개별적으로 준비 하 고 끊임없이 주의의 샘플 주문 각 슬라이드에 여러 개의 디스크를 삽입 하는 경우.</li>
	<li>10 분 동안 또는 젤 굳은 때까지 슬라이드 커버, 젖은 얼음의 평평한 표면에 놓습니다. 그것은 더 밖으로 마른 경우 유리에서 디스크를 밀어 어렵다입니다.</li>
	<li>레이블 처리/포함 조직 카세트 샘플 하나씩 연필로 생 검. 블루 종이 일로 방지를 슬라이드의 뒤쪽을 건조.</li>
	<li>유리에서 그것을 각 방향에 있는 디스크를 밀어 부드럽게 면도날의 무딘 가장자리를 사용 하 여. 때 그것은 쉽게 슬라이드, 파란 티슈 페이퍼에 현미경 슬라이드에서 디스크를 밀어 천천히. 디스크, 편평한 측, 종이에 직접 놓습니다.</li>
	<li>디스크 유지 평면, 방지 운동, 디스크, 카세트에 접힌된 종이에 놓고 카세트를 닫습니다 디스크 주위 종이 접어. 디스크 유리에서 깔끔하게 슬라이드 하지 않습니다, 경우 더 많은 젤을 추가 및/또는 몇 가지 더 많은 분 동안 얼음에 슬라이드를 반환.</li>
	<li>비 커에 PBS에 카세트 잠수함 최적의 형태에 대 한 같은 날을 포함 하는 파라핀 프로세스.</li>
</ol>4. 파라핀 포함
참고: 프로세스 섬 젤 아래 설명 된 대로 약식된 탈수 시리즈를 사용 하 여 파라핀 블록을 디스크. 이 기술은 자동화 된 프로세서를 사용 하 여 최적화 되었습니다 하지만 수동 처리 비슷한 결과 생산 한다.
<ol><li>15 분 동안 85%의 에탄올에 카세트를 담가.</li>
	<li>15 분 동안 95% 에탄올에 카세트를 담가.</li>
	<li>15 분 동안 100% 에탄올에 카세트를 담가. 3 세척의 총 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>15 분 동안 크 실 렌에 카세트를 담가. 3 세척의 총 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>카세트 녹은 파라핀에 10 분 동안 담가.</li>
	<li>10-30 분에 대 한 신선한 녹은 파라핀에 카세트를 전송.</li>
	<li>신중 하 게 카세트를 열고 파란색 종이 풀 다. 종이를 평평한 표면 반대 했다 그의 추적을 유지 하는 젤 디스크를 제거 합니다. 아래로, 절단 표면에 평행한 평면 (섬 포함) 표면으로 작은 몰드에 디스크를 포함 합니다. 플러그인에 대 한 신중 하 게 카세트에서 그것을 제거 하 고 절단 표면 쪽으로 향하고 함께 작은 몰드에 포함.</li>
</ol>5입니다. 파라핀 단면화 및 얼룩
<ol><li>슬라이드 레이블 순차적으로 직렬 섹션 필요한 경우.</li>
	<li>경험 있는 histotechnologist에 의해 잘라 5 µ m 파라핀 단면도 있다. 수율을 최대화 하기 위해 물자를 포함 하는 모든 섹션을 저장 합니다. 일반적으로, 20 섹션 수집 자료의 대부분의 캡처 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 섹션을 저장 합니다. 섹션 (예: H & E) 일상적인 조직학 얼룩과 면역 형광 검사 (예: 인슐린, 글 루카 곤 및 DAPI) 의무가 있습니다. 필요한 경우 다른 항 원에 대 한 고정을 최적화 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+architecture%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li>
<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li>
<li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+demand+regulates+%CE%B2+cell+number+via+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li>
<li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Induces+Mouse+%CE%B2-Cell+Proliferation+via+IRS2%2C+MTOR%2C+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li>
<li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li>
<li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%3A+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Veterinary+Laboratory+Diagnosticians%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li>
<li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li>
<li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+cell+block+processing%3A+The+Cell-Gel+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li>
<li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+infusion+in+mice%3A+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li>
<li>Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://iidp.coh.org/">http://iidp.coh.org/</a> (2018).</li>
</ol>

저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 수정된 젤 디스크-기반 포함 메서드는 단순, 저렴 한, 및 섹션 당 독도의 높은 수율을 생성 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 평면 유리 표면에 젤 디스크 구성 동등한 배급에 퍼지는 독도 용이 하 게 잘 정의 된 영역. 평면 디스크에 독도 확산 섹션의 비행기에 많은 독도 배치 하 고, 수확량을 최적화 하 고 적은 독도 사용할 수 있도록의 이점을 제공 합니다. 디스크 두께 수 사관의 요구에 맞게 조정할 수 있습니다. 여러 섹션을 얻을 수 있습니다, 이후 같은 독도의 직렬 섹션 분석할 수 있습니다, 같은 실험 샘플에 측정할 수 있는 뚜렷한 결과의 수를 증가. 여기에 최적화 된 췌 장 독도 대 한, 비록 기술은 작은 조각, 어렵다면 자연, 또는 점성 샘플 과정 그렇지 않으면 어려울 것 이다을 포함 한 다른 낮은 풍부한 자료에 적용할 수 있습니다. 이 메서드는 신선한 고정 독도 대 한 최적화 하 고 다른 유형의 이전 냉동된 독도 등의 재료에 대 한 테스트 되지 않았습니다. 이 섹션은 또한 DNA 또는 RNA를 검출 하기 위하여 교...

췌 장 독도 Langerhans, 인슐린, 순환의 유일한 소스는 당뇨병 mellitus를 공부 하는 수 사관에 대 한 중요 한 조직. 어떤 주어진된 유기 체에서 독도 가변 크기, 셀 유형 주파수, 및 건축1,2,3있다. Vivo에서 구조와 췌 장 독도의 내 분 비 세포 구성 공부 하는 기존의 전략 췌 장 조직4,5단면입니다. 콘텐츠의 전체 췌 장 세포의 작은 일부만 구성 하는 독도, 이후 고립 된 독도에 분자 연구 수행 됩니다. 비보 전 섬 문화 영양소에 대 한 응답을 테스트, 실험 유전자 변조 (transfection, 변환), 또는 실험적 치료 내 분 비 세포 생존, 확산, 및 기능을 조절 하는 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공 5 , 6.
섬 실험 비보 전 종종 전체 독도의 분자 연구 또는 단층5,6에 성장 하는 분산 된 작은 섬 세포의 조직학 또는 분자 연구를 사용 하 여 분석 된다. 전체 독도의 분자 분석의 혼합과 세포 유형, 모든 개별 셀 형식을 추정 하는 경우 false 네거티브 또는 허위-긍정적인 결과 얻을 수 있는 심각한 경고를 소개 합니다. 이후 문화 현미경 검사 법에 대 한 coverslips에 셀 분산 셀 형식 관련 결과 측정, 있지만 섬 아키텍처, 개입에 대 한 응답을 변경할 수 있습니다 및 건축 관련 결과의 식별을 방해 방해. 또한, 일반적으로 단지 단일 결과 측정할 수 있다; 예를 들어 베타 세포 증식 및 동일한 조건 하에서 베타 세포 죽음을 측정, 두 개의 별도 실험 수행 해야 합니다. 이러한 방식을 간 섬 가변성, 분야에서 증가 관심의 영역에 눈도 있습니다. Cytometry 셀 형식 관련 분자 연구, 또는 단일 셀 RNA 연구에 의해 정렬 작은 섬 세포는 조직 풍부, 건축 근절, 그리고 일상적인 셀 문화 분석에 적합 하지 비싼, 시간이 걸리는 제한 하지만 우아한 5 , 7. 각 샘플에서 가져온 데이터 이며 단일 immunostaining8에 식별 가능한 결과 제한 confocal 영상 전체 마운트 immunostained 독도의 높은-품질 그대로 아키텍처 데이터를 제공 하지만 노동 집약, 이다.
-문화 전체 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하는 기능이이 관심사의 많은 주소 것 이다. 높은 비용, 낮은 풍부한 섬 조직 또는 인간 장기 기증자, 또는 독도 상태 게시물에 비보 또는 생체 외에서 실험 조작, 독특한 유전자 모델에서 귀중 한 있습니다. 같은 독도에서 여러 파라핀 섹션을 가져오는 동일한 실험에서 여러 셀 형식 관련, 그대로 건축 분석이 하게된다.
단면에 대 한 섬 펠 릿을 생성 하기 위해 기존 기술을 완벽 하지 않습니다. 조직학 최적화 agarose 어려운 과정9조각난 또는 작은 조직 샘플을 포함 하는 조직학 및 cytological 표본 처리에서 널리 이용 되는 수성 낮은 녹는점 젤입니다. 접근을 포함 한 섬 agarose microcentrifuge 튜브에서에 독도 일시 중단, 원심 작은 자료, agar 플러그를 검색 다음 처리 하 고10,11단면에 대 한 포함입니다. 튜브의 아래쪽에서 응고 샘플을 추출 시간이 많이 걸리며 어려운, 샘플의 가끔 조각화 및 신체 상해의 위험입니다. 독도이 방법에서 얻은 단원의 부적절 한 섬 분포 선도 플러그의 끝에 집중 된다. 플러그의 둥근 바닥 복잡 포함 되도록 섬-가난한 지역 단면 제시 될 수 있습니다. 전반적으로,이 방법은 낮은 수율 및 결과 섹션에서 이멀전의 섬 유통 리드.
이 새로운 방법은 섬 섹션의 준비에 대 한 단순 하 고 향상 된 접근 이다. 독도 작은 볼륨에 집중 하 고 단일 평면에 독도와 작은 디스크를 현미경 슬라이드의 매끄러운 표면에 배치. Histogel-섬 디스크 파라핀 단축된 탈수 및 자일 렌 침투 프로토콜에 대 한 이후 처리 됩니다. Microfuge 관의 하단에 독도 집중, 이전 접근은 또한 비교로 수행 됩니다. 이 새로운 기술은 섹션, 각 섹션에서 독도의 유통 당 독도의 수율 향상과 카세트 섬 블록 전송 하는 데 시간이 적게 걸립니다. 이 기술은 유용 섬 생물학 또는 생산성을 극대화 하고자 하는 조직의 작은 조각을 공부 하는 다른 과학자의 기본 조직 아키텍처에서 단일 샘플에 여러 결과 측정 하 여 낮은 풍부 조직 사용.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf 튜브</td><td>Norgen Bioteck Corp</td><td>P/N 10113&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ranin Classic 스타터 키트</td><td>ShopRanin</td><td>17008708</td><td></td></tr><tr><td>Ranin ClassicPipette PR-2</td><td>ShopRanin</td><td>17008648</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (1000 &mu; L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>낮은 바인딩 팁(200 &mu; L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>낮은 바인딩 팁(20 &mu; L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>낮은 바인딩 팁 (10 &mu; L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>10% 포르말린 용액</td><td>시그마</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>히트블록</td><td>VWR</td><td>949312</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 블루 비즈- Affi-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>조직 처리 카세트</td><td>Simport</td><td>M492-10</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Wraps</td><td>Leica-Surgipath</td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>Citadel 2000 조직 처리기</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올 200 증거</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>McCormick Scientific</td><td>39503002</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td>Finesse ME+</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 항체</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>글루카곤 항체</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 594 2차 항체</td><td>Life technologies</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 488 2차 항체</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr></tbody></table>

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

격리 된 췌 장 독도 사용 하 여 실험은 당뇨병 연구를 위한 중요 하지만 독도 비싸고 한정 된 풍부의. 독도 포함 영향을 함수, 구조화 된 아키텍처에 혼합된 셀 인구 그리고 인간의 독도 널리 셀 형식 구성에서 변수. 교양된 독도 공부를 현재 자주 사용 되는 방법 분자 연구 수행 전체 독도, 총괄 한 이종 섬 세포 유형, 또는 현미경 또는 섬 건축을 방해 하는 분산 된 작은 섬 세포에 분자 연구에 포함 됩니다. Vivo에서 섬 연구, 파라핀 끼워 넣어진 췌 단면 네이티브 췌 장 환경에서 셀 관련 결과 평가 하기 위해 강력한 기술입니다. 여러 가지 이점을 제공할 것 이라고 파라핀 단면에 의해 후 문화 독도 공부: 같은 독도 (도 잠재적으로 정확한 같은 독도, 직렬 섹션을 사용 하 여), 셀 형식 관련 측정 및 유지 관리 기본에 여러 결과의 검출 섬-셀 및 셀 층 상호 작용 실험 노출 시 및 분석을 위해. 그러나, 기존 기술을 포함 고립 독도 후 비효율적인, 시간 소모, 소재의 손실에 수 그리 다 문화와 일반적으로 부적당 한 섬 숫자 결과 측정 하는 데 유용 해야 섹션을 생산. 임상 병 리 실험실 셀 블록 준비 시설 기초 연구 실험실에 대 한 허무 하 고 액세스할 수 있습니다. 우리는 강력한 수율 및 독도의 배포 섹션을 생성 하는 개선, 벤치 탑 메서드를 개발 했습니다. 고정된 독도 따뜻한 조직학 agarose 젤에 resuspended 하 고는 독도 평면에서 배포 되는 표준 유리 슬라이드에 플랫 디스크에 pipetted. 표준 탈수 후에 포함, 여러 (10 +) 4-5 µ m 섹션 같은 섬 블록에서 잘릴 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 마우스, 쥐, 인간 시리즈에 조직학 및 immunofluorescent 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 교양된 독도에서 셀 형식 관련, 건축이 그대로 결과 평가 하는 효과적인, 저렴 한, 시간-절약 접근.

젤 디스크를 준비 하는 단계의 그림된 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 이 젤 디스크 메서드 결과 결과의 의미 있는 정량화를 허용 하는 단일 평면에 배포 하는 독도의 충분 한 수를 포함 하는 파라핀 섹션에서. 그림 2 는 독도 섹션 당 캡처 수를 설명 하기 위해 결과 섹션의 낮은 확대 이미지. 일반적으로, &gt; 250 IEQ 절차, 사용 되었다 때 각 섹션에서 35 독도 했다 표시 하 고 &gt; 10 섹션 (4-5 µ m) 독도 포함 하는 각 샘플에서 가져온. 독도 절차에 대 한 사용의 수를 증가 섹션에서 독도의 수 증가. 섹션에서 독도 구조적으로 다양 하 고 그 새로운 개념을 지 원하는 다양 한 크기의 고 기술 간 섬 차이에 장 님 보다는 섹션을 사용 하 여으로 데이터 흥미로운 얻을 수 있습니다. 방법은 동등 하 게 일 잘 설치류 독도 연구소 (쥐, 마우스)에...

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

이 방법은 과학자들이 췌장섬의 생산적인 사용을 극대화하여 천연 조직 구조에서 각 샘플에 대한 여러 결과를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 새로운 포매팅 방법의 주요 장점은 섬이 잘 정의된 지역에 고르게 분포되어 있어 이 저농도 물질로부터 실험 수율을 최적화하는 단면 평면에 많은 섬을 배치한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구원인 Yahui Kong 박사입니다.이 절차를 시작하려면 실체 현미경 하에서 낮은 결합 p200 피펫 팁과 보정된 그리드를 사용하여 250개의 섬에 해당하는 것을 직접 선택합니다. 각 1.5ml 저결합 마이크로분리관으로 옮깁니다. 섬이 마이크로분리 튜브의 바닥에 가라앉도록 합니다.그런 다음 새 p200 팁이 있는 피펫을 사용하여 대부분의 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 섬을 제거하지 않도록 합니다. 속도가 중력의 200배에 도달할 때까지 스윙 버킷 원심분리기에 PBS 1ml와 원심분리기를 추가한 다음 스핀을 멈춥니다.상층액을 제거합니다. 총 두 번의 세탁 주기에 대해 이 전체 PBS 세탁 과정을 반복합니다. 다음으로, 500 마이크로 리터의 10 % 포르말린 용액 또는 4 % 갓 만든 파라 포름 알데히드를 첨가하십시오.샘플을 실온에서 30분 동안 고정시킵니다. 그런 다음 p200 팁이 있는 피펫을 사용하여 정착액을 제거하십시오. 속도가 200 시간 중력에 도달 할 때까지 1 밀리리터의 PBS와 원심 분리기를 추가 한 다음 스핀을 멈 춥니 다.상층액을 제거한 다음 전체 PBS 세척 과정을 한 번 더 반복하여 총 두 번의 세척 주기를 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 원하는 겔을 준비합니다. 다음으로, 이 마이크로 원심분리기 튜브를 섭씨 70도의 열 블록에 넣어 젤을 데웁니다.절단된 마이크로피펫 팁을 사용하여 샘플당 10마이크로리터의 아가로스 블루 비드를 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. PBS 1ml를 비드에 첨가한 다음 800배 중력에서 1분 동안 원심분리합니다. PBS를 제거하고 이 세척을 한 번 더 반복합니다.두 번째 세척 후 적절한 양의 PBS로 비드를 다시 현탁합니다. 속도가 중력의 200배에 도달할 때까지 섬이 들어 있는 튜브를 원심분리한 다음 스핀을 멈춥니다. 대부분의 상층액을 제거합니다.가위를 사용하여 각 샘플에 대해 하나의 10 마이크로 리터 마이크로 피펫 팁 끝을 자릅니다. 각 샘플에 대해 깨끗하게 절단된 팁을 사용하여 각 섬 튜브에 10마이크로리터의 비드를 추가합니다. 그런 다음 속도가 중력의 200배에 도달할 때까지 원심분리기를 합니다.그런 다음 자르지 않은 200마이크로리터와 10마이크로리터 팁을 사용하여 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. 샘플 식별을 위해 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 데운 젤과 함께 히트 블록 근처의 벤치에 놓습니다. 가위를 사용하여 샘플당 몇 개의 저결합 마이크로피펫 팁 끝을 자릅니다.절단 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 섬과 구슬이 들어 있는 튜브에 따뜻한 젤을 추가합니다. 거품이 생기지 않도록 즉시 혼합하십시오. 이 혼합물을 슬라이드에 적용하여 슬라이드 가장자리 근처에 디스크를 형성하고 외부 젤 링을 위한 공간을 남겨둡니다.그런 다음 슬라이드를 몇 번 부드럽게 두드려 섬과 구슬을 가라앉힙니다. 샘플 튜브에 20마이크로리터의 따뜻한 젤을 추가하고 새 젤을 남아 있는 섬 및 비드와 혼합합니다. 이 혼합물을 원본 디스크를 둘러싼 동일한 슬라이드에 적용합니다.디스크가 원하는 크기와 두께가 될 때까지 각 응용 프로그램에 대해 미리 절단된 새로운 팁을 사용하여 필요에 따라 반복합니다. 각 디스크를 개별적으로 준비하고 양쪽에 여러 디스크를 배치하는 경우 샘플 순서를 추적해야 합니다. 다음으로, 젖은 얼음의 평평한 표면에 슬라이드를 놓고 덮습니다.10분 동안 또는 젤이 굳을 때까지 슬라이드를 그대로 두십시오. 그런 다음 슬라이드를 제거하고 각 슬라이드의 뒷면을 말리십시오. 각 샘플에 대해 생검 처리 및 삽입 조직 카세트에 라벨을 붙입니다.면도날의 뭉툭한 모서리를 사용하여 디스크를 각 방향에서 부드럽게 밀어 유리에서 빼냅니다. 디스크가 쉽게 미끄러지면 디스크를 슬라이드에서 천천히 밀어내고 디스크를 평평한 면이 아래로 향하게 하여 용지에 직접 놓습니다. 유리 슬라이드에서 종이로 슬라이드하는 동안 고유한 디스크를 그대로 유지하는 것이 어려울 수 있습니다.디스크에 주름이 생기면 원래 위치로 되돌려 놓고 젤을 더 넣고 슬라이드를 다시 젤화하십시오. 디스크 주위의 종이를 접어 움직이지 않도록 합니다. 이것을 카세트로 옮긴 다음 카세트를 닫으십시오.PBS로 채워진 비커에 카세트를 담그십시오. 이 연구에서는 변형된 겔 디스크 기반 임베딩 방법을 사용하여 섹션당 높은 수율의 섬을 효율적으로 생성합니다. 설치류 섬의 형태는 섬 매체에서 분리 후 복구 후 눈에 띄게 더 손상되지 않았으며 매끄럽고 둥근 표면과 조밀한 구형을 나타냅니다.인간 섬의 형태가 비슷하다는 사실은, 그것이 도착 당일에 매립되어 있든 하룻밤 사이에 선적 후 회복된 후에 묻혀 있든 상관없이, 섬이 선적 전에 격리 스트레스에서 회복되기 때문일 수 있습니다. 이에 비해 기존 마이크로 튜브 기술을 통해 얻은 파라핀 단면은 단면당 섬이 더 적고 조밀하게 채워진 섬과 비드가 있는 더 작은 조직 단면적을 갖는 것으로 보입니다. 여기에서 볼 수 있듯이 이 기술은 조직학적 및 면역형광 염색을 위한 고품질 섬 절편을 생산할 수 있습니다.인슐린과 글루카곤 염색은 인간, 쥐 및 쥐 섬 간의 알려진 건축 차이를 보여주는 섬 건축의 다양한 구성과 이질성을 보여줍니다. 이 이미지들은 또한 같은 섬들의 연속적인 부분들을 나타낸다. 이 기술이 동일한 섬에서 여러 섹션을 얻을 수 있음을 보여줍니다.이 기술을 완전히 익히면 마이크로 원심분리기 기술보다 시간을 절약할 수 있습니다. 디스크를 튜브가 아닌 평평한 표면에 형성하면 디스크를 물리적으로 카세트로 옮겨 처리하는 것이 더 쉬워집니다. 이 방법은 섬 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 절단하기 어려운 다른 세포 블록이나 부서지기 쉬운 조직에도 적용할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 작은 부피의 젤을 사용하여 작은 영역에 조직을 집중시키고 평평한 표면에 디스크를 형성하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 조직 수율을 개선하기 위해 결합력이 낮은 미세 원심분리 튜브와 피펫 팁을 사용하는 것도 중요합니다. 이 기술은 섬 생물학 분야의 연구자들이 모국어 건축에서 전체 배양 섬의 세포 유형 구성 및 이질성, 세포 간 상호 작용 및 유전자 조절을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.단일 실험 조건에서 많은 섬을 포함하는 10개 이상의 단면을 생성할 수 있는 기능을 통해 동일한 물질에 대한 여러 결과를 정량화할 수 있어 실험 효율성이 향상됩니다. 이 기술을 제한된 존재 정도의 조직 샘플에 적용하면 다른 분야에도 이점을 제공할 수 있습니다. 이 절차의 요소는 사용자 요구에 맞게 수정해야 할 수 있습니다.고정 강도와 분할을 최적화해야 합니다. 이 기술을 사용하여 더 두껍거나 더 큰 디스크를 생성할 수 있습니다. 임베딩을 위한 간단한 처리 단계를 중첩해야 할 수 있으며 최적화해야 합니다.이 동영상을 시청한 후에는 전체 배양된 췌장섬의 파라핀 절편을 위한 고품질 아가로스 세포 블록을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 여러 스토리지 형식으로 인간의 췌장을 처리를위한 해부 절차를 보여줍니다. 해부 학적 방향이 지역의 섬 조성 및 밀도의 정의를 허용하도록 췌장 영역에 걸쳐 유지됩니다.

인간의 췌장을위한 컬렉션 프로토콜

이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H &amp; E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H &amp; E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역은 췌장 폴리펩티드에 대한 IHC를 사용하여 지역화된됩니다.

인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

여기, 선물이 파라핀 단면 개선 하는 프로토콜. 이 메서드는 절단 하 고 종래의 방법에 필요한 전송 프로세스를 피하기 위해 간단한 온도 챔버를 사용 하 여 부동을 결합 합니다. 그 결과, 효율과 그대로 파라핀 섹션 수가 크게 개선 했다.

절단 및 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면에 대 한 부동 방법

이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.

근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

복강 내 약물 투여는 췌장 손상을 유발하기 위한 안전하고 효과적인 비침습적 접근법입니다. 이 연구는 다양한 정도의 췌장 손상을 유발하기 위해 마우스에 대한 5가지 고유한 복강 내 주사 프로토콜을 비교하고 중증 급성 췌장염(SAP)에 대한 병리학적 변화와 치료 전략을 조사하기 위해 중증 췌장 손상 모델을 설정했습니다.

Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

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쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

학습하세요 췌장 섬 파라핀 섹션 제작 방법을 통해 당뇨병 연구에서 다양한 결과를 평가하는 효율적인 기술을 익히세요. 이 방법은 저량의 췌장 섬 재료에서 최적의 실험 수율을 달성합니다.

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