췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

이 방법은 과학자들이 췌장섬의 생산적인 사용을 극대화하여 천연 조직 구조에서 각 샘플에 대한 여러 결과를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 새로운 포매팅 방법의 주요 장점은 섬이 잘 정의된 지역에 고르게 분포되어 있어 이 저농도 물질로부터 실험 수율을 최적화하는 단면 평면에 많은 섬을 배치한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구원인 Yahui Kong 박사입니다.

이 절차를 시작하려면 실체 현미경 하에서 낮은 결합 p200 피펫 팁과 보정된 그리드를 사용하여 250개의 섬에 해당하는 것을 직접 선택합니다. 각 1.5ml 저결합 마이크로분리관으로 옮깁니다. 섬이 마이크로분리 튜브의 바닥에 가라앉도록 합니다.

그런 다음 새 p200 팁이 있는 피펫을 사용하여 대부분의 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 섬을 제거하지 않도록 합니다. 속도가 중력의 200배에 도달할 때까지 스윙 버킷 원심분리기에 PBS 1ml와 원심분리기를 추가한 다음 스핀을 멈춥니다.

상층액을 제거합니다. 총 두 번의 세탁 주기에 대해 이 전체 PBS 세탁 과정을 반복합니다. 다음으로, 500 마이크로 리터의 10 % 포르말린 용액 또는 4 % 갓 만든 파라 포름 알데히드를 첨가하십시오.

샘플을 실온에서 30분 동안 고정시킵니다. 그런 다음 p200 팁이 있는 피펫을 사용하여 정착액을 제거하십시오. 속도가 200 시간 중력에 도달 할 때까지 1 밀리리터의 PBS와 원심 분리기를 추가 한 다음 스핀을 멈 춥

상층액을 제거한 다음 전체 PBS 세척 과정을 한 번 더 반복하여 총 두 번의 세척 주기를 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 원하는 겔을 준비합니다. 다음으로, 이 마이크로 원심분리기 튜브를 섭씨 70도의 열 블록에 넣어 젤을 데웁니다.

절단된 마이크로피펫 팁을 사용하여 샘플당 10마이크로리터의 아가로스 블루 비드를 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. PBS 1ml를 비드에 첨가한 다음 800배 중력에서 1분 동안 원심분리합니다. PBS를 제거하고 이 세척을 한 번 더 반복합니다.

두 번째 세척 후 적절한 양의 PBS로 비드를 다시 현탁합니다. 속도가 중력의 200배에 도달할 때까지 섬이 들어 있는 튜브를 원심분리한 다음 스핀을 멈춥니다. 대부분의 상층액을 제거합니다.

가위를 사용하여 각 샘플에 대해 하나의 10 마이크로 리터 마이크로 피펫 팁 끝을 자릅니다. 각 샘플에 대해 깨끗하게 절단된 팁을 사용하여 각 섬 튜브에 10마이크로리터의 비드를 추가합니다. 그런 다음 속도가 중력의 200배에 도달할 때까지 원심분리기를 합니다.

그런 다음 자르지 않은 200마이크로리터와 10마이크로리터 팁을 사용하여 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. 샘플 식별을 위해 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 데운 젤과 함께 히트 블록 근처의 벤치에 놓습니다. 가위를 사용하여 샘플당 몇 개의 저결합 마이크로피펫 팁 끝을 자릅니다.

절단 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 섬과 구슬이 들어 있는 튜브에 따뜻한 젤을 추가합니다. 거품이 생기지 않도록 즉시 혼합하십시오. 이 혼합물을 슬라이드에 적용하여 슬라이드 가장자리 근처에 디스크를 형성하고 외부 젤 링을 위한 공간을 남겨둡니다.

그런 다음 슬라이드를 몇 번 부드럽게 두드려 섬과 구슬을 가라앉힙니다. 샘플 튜브에 20마이크로리터의 따뜻한 젤을 추가하고 새 젤을 남아 있는 섬 및 비드와 혼합합니다. 이 혼합물을 원본 디스크를 둘러싼 동일한 슬라이드에 적용합니다.

디스크가 원하는 크기와 두께가 될 때까지 각 응용 프로그램에 대해 미리 절단된 새로운 팁을 사용하여 필요에 따라 반복합니다. 각 디스크를 개별적으로 준비하고 양쪽에 여러 디스크를 배치하는 경우 샘플 순서를 추적해야 합니다. 다음으로, 젖은 얼음의 평평한 표면에 슬라이드를 놓고 덮습니다.

10분 동안 또는 젤이 굳을 때까지 슬라이드를 그대로 두십시오. 그런 다음 슬라이드를 제거하고 각 슬라이드의 뒷면을 말리십시오. 각 샘플에 대해 생검 처리 및 삽입 조직 카세트에 라벨을 붙입니다.

면도날의 뭉툭한 모서리를 사용하여 디스크를 각 방향에서 부드럽게 밀어 유리에서 빼냅니다. 디스크가 쉽게 미끄러지면 디스크를 슬라이드에서 천천히 밀어내고 디스크를 평평한 면이 아래로 향하게 하여 용지에 직접 놓습니다. 유리 슬라이드에서 종이로 슬라이드하는 동안 고유한 디스크를 그대로 유지하는 것이 어려울 수 있습니다.

디스크에 주름이 생기면 원래 위치로 되돌려 놓고 젤을 더 넣고 슬라이드를 다시 젤화하십시오. 디스크 주위의 종이를 접어 움직이지 않도록 합니다. 이것을 카세트로 옮긴 다음 카세트를 닫으십시오.

PBS로 채워진 비커에 카세트를 담그십시오. 이 연구에서는 변형된 겔 디스크 기반 임베딩 방법을 사용하여 섹션당 높은 수율의 섬을 효율적으로 생성합니다. 설치류 섬의 형태는 섬 매체에서 분리 후 복구 후 눈에 띄게 더 손상되지 않았으며 매끄럽고 둥근 표면과 조밀한 구형을 나타냅니다.

인간 섬의 형태가 비슷하다는 사실은, 그것이 도착 당일에 매립되어 있든 하룻밤 사이에 선적 후 회복된 후에 묻혀 있든 상관없이, 섬이 선적 전에 격리 스트레스에서 회복되기 때문일 수 있습니다. 이에 비해 기존 마이크로 튜브 기술을 통해 얻은 파라핀 단면은 단면당 섬이 더 적고 조밀하게 채워진 섬과 비드가 있는 더 작은 조직 단면적을 갖는 것으로 보입니다. 여기에서 볼 수 있듯이 이 기술은 조직학적 및 면역형광 염색을 위한 고품질 섬 절편을 생산할 수 있습니다.

인슐린과 글루카곤 염색은 인간, 쥐 및 쥐 섬 간의 알려진 건축 차이를 보여주는 섬 건축의 다양한 구성과 이질성을 보여줍니다. 이 이미지들은 또한 같은 섬들의 연속적인 부분들을 나타낸다. 이 기술이 동일한 섬에서 여러 섹션을 얻을 수 있음을 보여줍니다.

이 기술을 완전히 익히면 마이크로 원심분리기 기술보다 시간을 절약할 수 있습니다. 디스크를 튜브가 아닌 평평한 표면에 형성하면 디스크를 물리적으로 카세트로 옮겨 처리하는 것이 더 쉬워집니다. 이 방법은 섬 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 절단하기 어려운 다른 세포 블록이나 부서지기 쉬운 조직에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 작은 부피의 젤을 사용하여 작은 영역에 조직을 집중시키고 평평한 표면에 디스크를 형성하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 조직 수율을 개선하기 위해 결합력이 낮은 미세 원심분리 튜브와 피펫 팁을 사용하는 것도 중요합니다. 이 기술은 섬 생물학 분야의 연구자들이 모국어 건축에서 전체 배양 섬의 세포 유형 구성 및 이질성, 세포 간 상호 작용 및 유전자 조절을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

단일 실험 조건에서 많은 섬을 포함하는 10개 이상의 단면을 생성할 수 있는 기능을 통해 동일한 물질에 대한 여러 결과를 정량화할 수 있어 실험 효율성이 향상됩니다. 이 기술을 제한된 존재 정도의 조직 샘플에 적용하면 다른 분야에도 이점을 제공할 수 있습니다. 이 절차의 요소는 사용자 요구에 맞게 수정해야 할 수 있습니다.

고정 강도와 분할을 최적화해야 합니다. 이 기술을 사용하여 더 두껍거나 더 큰 디스크를 생성할 수 있습니다. 임베딩을 위한 간단한 처리 단계를 중첩해야 할 수 있으며 최적화해야 합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 전체 배양된 췌장섬의 파라핀 절편을 위한 고품질 아가로스 세포 블록을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.