Name: Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 심근경색 진단을 위한 전기화학발광 면역분석법으로 혈청 내 심장 마이오신 결합 단백질-C와 심장 트로포닌 I을 정량하는 방법입니다. 이 기술은 임상 현장에서 높은 민감도와 특이성을 제공합니다.

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이 연구는 건강 보조금 국립 연구소 R01HL105826 및 K02HL114749 (박사 Sadayappan)와 미국 심장 협회 중서부 장학금에 의해 투자되었다; 11PRE7240022 (씨 Barefield)와 13POST14720024 (박사 Govi​​ndan). 저자는 기꺼이 분석을 개발하고 그들의 우수한 기술과 문학 지원을위한 박사 지미 페이지, 질 Clampit 박사 존 허드슨, MSD의 도움을 인정합니다.

1. Uniplex cMyBP-C의 분석 <ol><li> 캡처 항체 실험, 코트는 96 - 웰 MSD 베어 표준 플레이트 전날. cMyBP-C의 경우, 5 ㎍ / 인산에 희석 ML의 농도로 마우스 단일 클론 항 cMyBP-C 항체 (젤라틴 무료)의 30 μL 볼륨을 사용 (PBS) 염분 버퍼. </li><li> 잘 소수성이기 때문에, 잘 하단 모서리에 솔루션을 피펫, 다음 전체도에 걸쳐 솔루션을 확산 판의 측면을 누릅니다. </li><li> 플레이트는 플레이트 봉인으로 덮여 떨고없이 ° C 4에서 O / N을 배양한다. </li><li> 싱크대 후 종이 수건의 스택에 해결책을 눌러 캡처 항체 솔루션을 제거합니다. 판에 비 특정 바인딩은 5 % (W / V) 차단 각각의 well에 PBS에서 A (고급 BSA) 용액 150 μl를 추가하여 차단됩니다. </li><li> 700 rpm으로 흔들어 RT에서 1 시간 동안 접시와 부화를 밀봉하십시오. </li><li> 차단 단계에서 표준을 준비하고의불가능한 명령어. 1 % 2,000 NG / ML (W / V) 차단 PBS /의 시작 농도 - 재조합 cMyBP-C 단백질 조각 (271 아미노산 1)을 희석하여 표준 시리즈를 확인합니다. 다음 직렬 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에 5 배 희석. 7 기준 총 + 1 빈 (1 % (W / V) 차단기 A / PBS 만)을 사용 하였다. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 150 μL 0.05 % (v / v)의 Tween-20/PBS와 배 접시를 씻으십시오. 때마다, 싱크대 위의 반전 플레이트 세척 용액을 제거. 세 번째 세척 단계 후, 적극적으로는 싱크대 접시를 가볍게하고 완전히 건조 될 때까지 종이 타월 레이어에 적극적으로 판을 두드려. 배양 볼륨이 작아서 이것은 중요한 단계이며, 나머지 세척 솔루션은 크게 다음의 배양을 희석합니다. </li><li> 우물에 표준 시료의 피펫 25 μL. 1 시간 동안 700 rpm으로 흔들어 동안 RT에서 접시와 부화를 밀봉하십시오. </li><li> 1 % 차단 / PBS에 1 ㎍ / ㎖에서 검출 항체 솔루션을 준비합니다. CUMSD 설포-TAG 라벨 검출 항체의 역할에 - STOM은 cMyBP-C 항체 (14 항원 아미노산 2)를 만들었다. 키트는 어떤 항체를 레이블링하는 비교적 간단한 절차를 만들고, 설포-TAG 라벨에 사용할 수 있습니다. </li><li> 로 단계 1.4에서 설명한 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 각각의 well에 탐지 항체 용액 25 μl를 추가, 쉐이커 700 rpm으로 설정 한 접시에 1 시간 동안 RT에서 플레이트와 부화를 밀봉하십시오. </li><li> 배양 기간 동안 부문 영상 및 소프트웨어 (시약 섹션 참조)의 적절한 기능을 보장하기 위해 MSD의 데모 플레이트 (LED 조명 플레이트)를 실행합니다. 또한, 15 ML 증류수에 배속 읽기 버퍼의 5 ML을 추가하여 MSD에 의해 제공됩니다 읽기 버퍼, 희석. </li><li> 로 단계 1.4에서 설명한 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 well에 읽기 버퍼 150 μl를 추가합니다. 기포 (역 피펫은 적절한 방법이다)을 방지해야합니다. 읽기 버퍼를 첨가 한 후, 즉시 분야에서 접시를 스캔영상. </li></ol> 2. 3 복잡한 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 분석 <ol><li> 96 - 웰 3 - 플렉스 플레이트와 희석제 솔루션은 사용하기 전에 RT 평형을 할 수 있습니다. 이 판은 MSD에 의해 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 대한 캡처 항체 사전 코팅. </li><li> 1 % (w / v)의 차단 각각의 well에 A / PBS의 25 μl를 추가합니다. 전체도이 솔루션이 포함되어 있는지 확인하기 위해 접시의 측면을 누릅니다. </li><li> 플레이트 봉인 플레이트를 밀봉 판 뿌리에 접시를 놓고 30 분간 700 rpm으로 흔들어. </li><li> 한편, 개별 교정기의 희석 시리즈는 준비가되어 있습니다. 각 잘 개의 캡처 항체를 가지고 있기 때문에 세 교정기는 혼합 수와 직렬로 사용하기 전에 희석해야합니다. 2000 NG / ML cMyBP-C, 100 NG / ML로 하나의 샘플을 만드는 1 %에 함께 재조합 cMyBP-C, CK-MB (MSD) 및 cTnI는 (MSD) (W / V) 차단기 A / PBS에 희석 CK- MB, 25 NG / ML cTnI는 (샘플). </li><li> 최소 100 μL의 최종 볼륨은 각 표준에 대한 준비가되어 있습니다. 에표준 시리즈를 완료 순차적으로 샘플 5 배 희석 있습니다. 시료 25 μl를 사용하여 100 ㎕의 1 % (W / V) 차단제 샘플 C를 만들려면 100 ㎕의 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에서 샘플 B의 25 μl를 사용하는 다음 예제 B.를 만들 수있는 A / PBS에 , 등등. MI 16 과목과 16 명의 대조군에서 혈청 샘플은 cMyBP-C, CK-MB 및 cTnI는 수준을 측정하는 데 사용되었다. 이러한 샘플은 1 % (W / V) 차단기 A / PBS에 2 배 희석 하였다. </li><li> 3 플렉스 플레이트의 우물에 이미 25 μL를 기준 희석 한 시료 25 μl를 추가합니다. 또한 빈 (전용 희석제)를 포함하는 것이 중요합니다. 방법을 설정하려면, 샘플 기술 triplicates로드됩니다. 그렇지 않으면, 중복 충분하다. </li><li> 다시 플레이트를 밀봉 (플레이트 봉인을 재사용 할 수 있습니다) 2 시간 동안 RT에서 접시 흔드는 (700 RPM)에 품어. </li><li> 부화가 완료되기 전에, 탐지 항체 솔루션이 준비되어 있습니다. 사용 희석제는 PBS에 1 % (w / v)의 차단이다. 모든 THR전자 설포 태그가 검출 항체 1 ㎍ / ㎖ 각각의 최종 농도에 함께 희석된다. 탐지 항체는 일반적으로 50X 주식 농도에 제공됩니다. </li><li> 전체 96 - 웰 플레이트에 대해 총 희석 용액 2,700 μL를 (에러 포함 피펫과)가 필요합니다. 2,538 ㎕의 1 % (w / v)의 차단 PBS / 각 검출 항체의 54 μl를 추가합니다. </li><li> 2 시간 후, 적극적으로 싱크대 위에 접시를 가볍게 치면 솔루션을 제거합니다. 0.05 % PBS에서 트윈-20의 150 μL와 우물 배를 씻으십시오. 에 탐지 항체 솔루션의 25 μl를 추가하는 각 잘 멀티 채널 피펫을 사용하고 접시의 측면은 전체도이 솔루션이 적용되도록 탭합니다. </li><li> 플레이트를 밀봉하고 700 rpm으로 흔들어 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 배양 기간 동안 부문 영상 및 소프트웨어의 적절한 기능을 보장하기 위해 MSD의 데모 플레이트 (LED 조명 플레이트)를 실행합니다. 또한의 배속 읽기 5 mL를 추가하여 MSD에 의해 제공됩니다 읽기 버퍼, 희석15 ML 증류수로 버퍼입니다. </li><li> 단계 2.8에서 설명한 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 읽기 버퍼 150 μl를 추가합니다. 공기 방울을 피하는 것이 중요하다 (역 피펫은 적절한 방법입니다.) 읽기 버퍼를 첨가 한 후, 즉시 분야 영상의 플레이트를 검사합니다. </li></ol>

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</ol>

인간의 체액에 cMyBP-C 저하 및 배출과 관련된 위험 요인을 결정하는 : 전체 특허 출원 (05/04/12. 응용 프로그램 일련 번호 464분의 13, 466, 펍 번호 미국 2012 / 0282618 A1) 및 Date (날짜) 보류 인간의 체액에 cMyBP-C의 수준을 정량.

본 연구에서는 환자의 혈청에서 여러 심장 바이오 마커의 검출을위한 다중 면역의 적용을 보여줍니다. 이 기술은 기존의 ELISA를 통해 많은 장점이 있습니다. 첫째, 분석 키트 ECL은 비색 검출 대신 사용됩니다. ECL에서 전기 신호, 따라서 배경 14 감소 신호의 자극 이벤트를 연결을 풀기, 측정 속성 (빛)의 현지 생산을 자극한다. 이 표 2에서 볼 수 있듯이, 높은 감도 수 있습니다. 분석을 다중화하여 그림 2와 표 2에서 볼 수 있듯이, cMyBP-C의 검출 감도의 손실이 발생하지 않습니다. uniplex 측정 cMyBP-C는 CK-MB 및 cTnI는 13으로 동시에 측정 cMyBP-C에 비해 감도 및 감지 범위를 보여 주었다. 동시 측정은 실질적으로 measuremen에 필요한 시료의 양을 줄일 수희귀 생물 학적 샘플 작업뿐만 아니라 시간을 단축 할 때 중요한 요소가 ...

같은 혈청과 같은 복잡한 생물 학적 샘플, 단백질의 낮은 양의 측정은 환자의 관리뿐만 아니라 기초 과학에 대한 성장 임상 중요하다. 예를 들어, 임상 환경에서 이러한 트로포 닌 I와 같은 심장 바이오 마커의 혈청 수준에있는 증가는 급성 심근 경색 (MI) 1과 일치한다. 그것은 높은 감도를 가지고 있으며, 분석의 절대 정량을 허용으로 혈청에있는 단백질을 검출하는 표준 효소 결합 면역 분석 (ELISA)는 가장 자주 사용되는 기술이다. 그러나 전통적인 ELISAs는 샘플 상대적으로 많은 양의 (일반적으로 100 μL) 필요로하는 일부 생물학적 체액에서 높은 배경 신호를 가지고 있고, ELISA 2 당 하나의 분석의 측정으로 제한됩니다. 최근 새로운 면역 기술은 이러한 단점을 많이 우회하는 도입되었습니다. 이 수정 된 분석은, MSD에 의해 개발, electrochemiluminesc를 사용작은 샘플 볼륨의 사용을 가능하게 매우 낮은 배경과 감도를 증가 수 있습니다 신호 검출을위한 레퍼런스 (ECL). Electrochemiluminescence이 검출 항체에 부착 기자 분자 루테늄 (II) trisbipyridal을 기반으로하고 있습니다. 이 기자 분자들을 3에 통합 된 탄소 전극을 가지고 96 - 웰 플레이트의 바닥의 전기 자극에 620 nm의 빛을 방출한다. 또한, 현장 코팅을 사용하여 여러 개의 캡처 항체는 하나의 견본에 다른 단백질의 동시 정량 있도록 잘 하나 (최대 10 96 - 웰 플레이트에)으로 코팅 할 수 있습니다. 이 기술은 최근 혈청 5,6에서 염증성 사이토 카인 프로파일을 측정하는 데 사용되었습니다. MSD에서 멀티 플레이트는 호의적 ​​다른 멀티 플렉스 분석 플랫폼 7 비교합니다. 기본 분석 플랫폼으로 MSD 사용하여, 우리는 또한 3 플렉스 플레이트를 만든 사용자 지정을 개발하는 C동시에 심장 미오신 결합 단백 C (cMyBP-C), 크레아틴 키니 아제 MB (CK-MB), 및 심장 트로포 닌 I (cTnI는)의 수준을 정량화하고, 결과는 cMyBP-C의 monoplex 감지 하였다. CK-MB 및 cTnI는 미시간 잘 확립 된 생체 있습니다. 그러나 이러한 생체의 증가는 예를 들어, 심근염이나 신장 장애 8, MI 이외의 병리에 의해 발생할 수 있습니다. 이 MI 진단의 특이도를 높이기 위해 추가로 생체의 추가를 위해 주장하고있다. 우리는 최근 cMyBP-C는 MI 9에 대한 잠재적 인 바이오 마커 것으로 나타났습니다. cMyBP-C은 심장 아니라 골격이나 부드러운 근육에 10-12로 표현 두꺼운 필라멘트 연관된 단백질이다. 따라서, 순환 시스템의 cMyBP-C의 증가 수준은 심장 손상 13의 특정 지표입니다. 본 연구에서는 혈청 수준을 측정하기 위해 사용자 지정 3 복잡한 분석의 사용과 cMyBP-C의 uniplex 검출 비교cMyBP-C, CK-MB, 및 MI 환자의 혈청 cTnI는. 미래에이 서명 기법은 응급실에서 흉통 함께 제시 환자에서 MI를 진단하는 데 사용할 수 있습니다. Loyola 대학 시카고의 기관 심의위원회 (IRB)는 deidentified 인간의 샘플의 사용과 면역의 사용 (LU # 20392)에 대한 연구를 승인했다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>R92TC-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>아크로스</td><td>9005-64-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSD 차단제 A</td><td>메소 스케일 디스커버리</td><td>R93BA-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 10X</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399-4</td><td>사용 전 필터</td></tr><tr><td>Myosin 결합 단백질 C 항체, 마우스 단클론 (E7), 젤라틴 무료</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-137180L</td><td>코팅을 위해 항체는 젤라틴이 없어</td></tr><tr>야 합니다<td colspan="4">Plates and Equipment</td></tr><tr><td>Multi-Array 96-well standard plate</td><td>Meso Scale Discovery</td><td>L15XA-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cMyBP-C, cTnI 및 CK-MB</td><td>메소 스케일 디스커버리</td><td>N452A-1</td><td>을</td> 갖춘 프로토타입 3-플렉스, 4-스폿, 96웰 플레이트;</tr><tr><td>ThermaSeal 밀봉 필름</td><td>생명 과학 제품 Inc.</td><td>세인트-3098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400A</td><td>메조 스케일 디스커버리</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MTS 2/4 디지털 마이크로타이터 쉐이커</td><td>IKA</td><td>3208001</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-c의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

바이오 마커뿐만 아니라 기초 과학, 의사 결정 임상에서 점점 더 중요 해지고 있습니다. 진단 심근 경색 (MI)는 주로 심근 손상의 지표로 환자의 혈청 또는 혈장 내 심장 특정 단백질을 감지하여 구동된다. 최근 심장 미오신 결합 단백 C (cMyBP-C)은 MI 후 혈청에서 감지 할 수 있다는 것을 보여 한, 우리는 MI에 대한 잠재적 인 바이오 마커로 제안했다. 바이오 마커는 일반적으로 전통적인 샌드위치 효소 결합 면역 분석에 의해 감지됩니다. 그러나,이 기술은 큰 샘플 볼륨을 필요로하는 작은 동적 범위를 가지고 있으며, 한 번에 하나의 단백질을 측정 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 3 개의 심장 단백질은 높은 감도를 동시에 측정 할 수있는 멀티 플렉스 면역을 보여줍니다. 크레아틴 키나제 MB와 심장 트로포 닌과 uniplex 또는 함께 cMyBP-C를 측정하는 나는 비교 감도를 보여 주었다. 이 기술은 메조 스케일 검색을 사용하여검출 electrochemiluminescence과 함께 96 - 웰 플레이트에 멀티플렉싱 (MSD) 메소드. 단지 작은 샘플 볼륨이 필요하지만, 높은 감도와 넓은 다이나믹 레인지를 얻을 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 cMyBP-C, 크레아틴 키나제 MB와 심장 트로포 닌 MI 16 과목에서 혈청 샘플에서 나는 수준을 측정하고 16 대조군과 결과를 비교 하​​였다. 우리는이 샘플에서 세 마커를 감지 할 수 있었고, MI 후 증가 할 세 가지 바이오 마커를 발견했다. 이 기술은 따라서 혈청 샘플에서 심장 생체의 과민 한 탐지에 적합합니다.

3 복잡한 분석의 기본 원칙과 워크 플로우는 그림 1에 표시되며 전체 워크 플로우는 표 1에 설명되어 있습니다. Uniplex의 분석은 전체 바닥이 잘 한 캡처 항체로 코팅 된 것을 제외하고는 동일한 원리에 따라 작동합니다. 신호 검출 전기 신호가 잘 하단에 적용되는 ECL에 의해 이루어집니다. 이것은, 차례로, 검출 항체에 설포-TAG 레이블 읽기 버퍼의 화학 반응을 통해 빛의 현지 생산을 시작합니다. 이 낮은 배경 및 분석의 높은 감도로 연결됩니다. 그림 2에서 uniplex 분석에 cMyBP-C의 표준 곡선은 3 복잡한 분석에 cMyBP-C의 비교됩니다. 두 분석은 매우 높은 민감도와 높은 동적 범위를 보여줍니다. 탐지 수준 및 정량화 수준은 표 2와 uniplex 3 - 플렉스 분석 모두에서 비교할 수 있습니다. cTnI는 및 CK-MB에 대한 탐지 수준은 ALS 수 있습니다O는 그림 ...

복잡한 생물학적 시료의 측정 생체 점점 의사 결정 임상 지침입니다. 우리는 동시에 심장 미오신 결합 단백 C, 크레아틴 키나제 MB, 심근 경색 및 건강한 대조군과 과목에서 혈청 샘플에서 심장 트로포 닌 I를 측정하는 매우 민감한 방법을 설명합니다.

Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

이 절차의 전체적인 목적은 혈청 샘플 내의 심장 마이오신 결합 단백질 C와 심장 트로포닌 I를 동시에 정량하는 것입니다. 이는 먼저 96-웰 플레이트를 plex 분석용 심장 마이오신 결합 단백질 C 항체로 코팅하거나, 미리 코딩된 threeplex 분석 키트를 사용하여 수행합니다. 두 번째 단계에서는 코팅된 플레이트를 캘리브레이터 및 혈청 샘플과 함께 배양합니다.마지막 단계에서 표지된 검출 항체를 첨가하면 화학 발광 신호가 생성되며, 이를 플레이트 리더로 검출합니다. 최종적으로, 단일 또는 다중 면역 분석법을 통해 혈청 샘플에 존재하는 표적 심장 단백질의 수치를 결정할 수 있습니다. 실험 전날, 96-well Meso Scale Discovery bare standard plate의 각 웰 바닥 모서리에 젤라틴 프리 마우스 단일클론 항-심장 myosin binding protein C 항체 30 µL를 피펫팅합니다.그 다음 플레이트의 측면을 가볍게 두드려 항체 용액이 각 웰의 바닥에 골고루 퍼지게 합니다. 밀봉 후, 흔들지 않은 상태로 4 °C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다. 다음 날 아침, 싱크대와 종이 타월 더미 위에 용액을 두드려 쏟아냅니다.그런 다음 비특이적 결합을 차단하기 위해 각 웰에 1%blocker A in PBS 150 µL를 추가합니다. 차단 단계 동안 700 RPM으로 흔들어 주면서 밀봉된 플레이트를 상온에서 1시간 동안 배양하고, recombinant cardiac myosin binding protein C fragment를 1%blocker A in PBS에서 시작 농도 2000 ng/mL가 되도록 희석합니다. 이어서 이 용액을 5배씩 단계적으로 희석하여 총 7개의 표준물을 준비합니다.방금 시연한 것과 같이 블로킹 용액을 제거한 다음, 0.05% tween 20이 포함된 PBS 150 µL로 플레이트를 3회 세척합니다. 세 번째 세척 후, 플레이트를 싱크대 위에서 강하게 털어낸 다음, 종이 타월 위에 대고 플레이트를 단단히 두드려 완전히 건조시킵니다. 다음으로, 각 표준 시료와 샘플 25 µL를 해당 웰에 피펫으로 분주합니다.밀봉된 플레이트를 쉐이커에서 실온으로 1시간 동안 배양하는 동안, sul oag가 표지된 맞춤 제작 cardiac myosin binding protein C 검출 항체를 PBS 내 1% blocker A로 1 µg/mL가 되도록 희석합니다. 앞서 시연한 대로 플레이트를 주의 깊게 세척한 후, 각 웰에 검출 항체 용액 25 µL를 첨가하고 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 배양 기간 동안 LED 조명을 사용하여 데모 플레이트를 실행함으로써 sector imager와 소프트웨어가 적절히 작동하는지 확인하고, 이때 Reid Buffer도 함께 희석합니다. 이전과 같이 플레이트를 주의 깊게 세척한 후, 멀티 채널 피펫을 사용하여 기포가 생기지 않도록 주의하며 각 웰에 Reid Buffer 150 µL를 첨가하고, threeplex assay를 시작하기 전에 즉시 sector imager에서 플레이트를 스캔합니다.96웰 3종 복합 플레이트와 희석액을 실온에서 평형 상태가 되도록 둡니다. 그 다음, PBS에 포함된 1% blocker A 25 microliters를 플레이트에 추가하여 웰 전체가 용액으로 덮이도록 하고, 밀폐된 플레이트를 흔들어주며 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그동안, recombinant cardiac myosin binding protein C, CK-MB 및 cardiac troponin I를 PBS에 포함된 1% blocker A로 함께 희석하여 cardiac myosin binding protein C 2000 nanograms per milliliter, CKMB 100 nanograms per milliliter, cardiac troponin 25 nanograms per milliliter가 포함된 표준물을 제조합니다.그 다음, 각 표준물질 희석 시료의 최종 부피가 최소 100 µL가 되도록 PBS 내 1% blocker A를 사용하여 이 혼합물을 5배씩 두 번 연속 희석합니다. 이어서, 3-plex 플레이트의 웰에 이미 들어 있는 25 µL의 블로킹 버퍼에 표준물질과 시료를 각각 25 µL씩 2개의 기술적 반복구(technical replicates)로 첨가하며, 희석액만 포함된 공시료(blank)도 포함합니다. 밀봉된 플레이트를 흔들어주며 배양한 후, 1% solution blocker A와 PBS에서 세 가지 SUL oag 검출 항체를 각각 최종 농도가 1 µg/mL가 되도록 함께 희석합니다. 2시간 후, 앞서 시연한 대로 플레이트를 세척한 다음, 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 검출 항체 용액 25 µL를 첨가합니다.밀봉된 플레이트를 700 RPM으로 흔들며 1시간 동안 배양합니다. 데모 플레이트를 실행하고 앞서 시연한 대로 Reid buffer를 희석합니다. 그런 다음 0.05% tween 20가 포함된 PBS로 플레이트를 세척하고, 멀티채널 피펫을 사용하여 공기 방울이 생기지 않도록 각 웰에 150 µL의 Reid Buffer를 분주한 후, 즉시 섹터 이미저(sector imager)로 플레이트를 스캔합니다.이 그림에서는 plex 분석법의 cardiac myosin binding protein C 표준 곡선과 three plex 분석법의 cardiac myosin binding protein C 표준 곡선을 비교하여 보여줍니다. 두 분석법 모두 매우 높은 민감도와 넓은 동적 범위를 나타냅니다. plex 및 three plex 분석법의 검출 영역은 회색으로 표시되어 있습니다.심장 myosin binding protein C 표준 곡선은 서로 유사합니다. 검출 하한, 정량 하한 및 정량 상한 수준은 plex 및 threeplex 분석 모두에서 비슷하게 나타납니다. 이 그래프들은 threeplex 플레이트의 심장 troponin I 및 CKMB 표준 곡선을 보여줍니다.두 보정물 모두 높은 민감도와 넓은 동적 범위를 나타냈습니다. 분석의 검출 영역은 회색으로 표시되어 있습니다. 다른 두 보정물에 대한 검출 항체의 교차 반응성을 조사하기 위해 세 가지 보정물 모두의 개별 표준 곡선을 단일 검출 항체와 함께 배양하였으며, CKMB 보정물과 cardiac troponin I 및 cardiac myosin binding protein C 검출 항체 사이에서만 낮은 수준의 교차 반응성이 관찰되었습니다.심장 손상 검출에 대한 본 분석법의 적용 가능성을 입증하기 위해 다른 캘리브레이터와 검출 항체 사이에서 교차 반응성이 관찰되지 않았음을 확인하였으며, 3-plex 플레이트를 사용하여 심근경색 환자 16명과 대조군의 혈청 내 cardiac myosin binding protein C-C-K-M-B 및 cardiac troponin I 수치를 비교하였습니다. 분석 결과, 심근경색 환자군에서 대조군에 비해 세 가지 바이오마커 모두 수치가 증가한 것으로 나타났습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

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