Electrochemiluminescence의 면역에 의한 혈청 심장 마이 오신 결합 단백질-C의 결정에 대한 민감하고 구체적인 정량 방법

이 절차의 전반적인 목표는 혈청 샘플에서 심장 미오신 결합 단백질 C와 심장 트로포닌 I을 동시에 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 플렉스 분석을 위해 96웰 플레이트를 심장 미오신 결합 단백질 C 항체로 코팅하거나 사전 코딩된 threeplex 분석을 사용하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 코팅된 플레이트를 캘리브레이터 및 혈청 샘플과 함께 배양합니다.

다음으로 라벨링된 검출 항체가 최종 단계에서 추가되고, 플레이트 리더에 의해 검출되는 화학발광 신호가 생성됩니다. 궁극적으로, 혈청 샘플에 존재하는 관심 심장 단백질의 수준은 단일 또는 다중 면역 분석으로 측정할 수 있습니다. 실험 전날, 30 마이크로 리터의 젤라틴이없는 마우스 단일 클론 항 심장 미오신 결합 단백질 C 항체를 96 Well 된장 스케일 발견 베어 표준 플레이트의 각 웰 하단 모서리에 피펫으로 만듭니다.

그런 다음 플레이트의 측면을 두드려 각 웰의 바닥에 항체 용액을 펴 바릅니다. 밀봉 후 흔들리지 않고 섭씨 4도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날 아침, 용액을 싱크대 위에 두드린 다음 종이 타월 더미에 두드리십시오.

그런 다음 PBS의 1%blocker A 150마이크로리터를 각 웰에 추가하여 비특이적 결합을 차단합니다. 차단 단계에서 700RPM으로 진탕하면서 실온에서 밀봉된 플레이트를 1시간 동안 배양하고, 재조합 심장 미오신 결합 단백질 C 단편을 PBS의 1% 차단제 A에서 밀리리터당 2000나노그램의 시작 농도로 희석합니다. 그런 다음 이 용액을 5배로 연속적으로 희석하여 총 7개의 표준물질을 만듭니다.

이제 시연된 대로 차단 용액을 제거한 다음 PBS에서 0.05%tween 20의 150마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척합니다. 세 번째 세척 후 싱크대 위에서 접시를 세게 두드린 다음 완전히 마를 때까지 종이 타월 층으로 접시를 단단히 두드립니다. 다음으로, 각 표준물질 25마이크로리터를 피펫팅하고 적절한 웰에 시료를

그런 다음 밀봉 된 플레이트가 실온에서 1 시간 동안 셰이커에서 배양하는 동안 PBS의 1 % 차단제 A에서 1 밀리리터 당 1 마이크로 그램으로 황산 오그로 표시된 맞춤형 심장 미오신 결합 단백질 C 검출 항체를 희석합니다. 방금 시연한 대로 플레이트를 조심스럽게 세척한 후 각 웰에 25마이크로리터의 검출 항체 용액을 첨가한 다음 밀봉된 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하면서 배양 기간 동안 흔들면서 밀봉된 플레이트를 배양하고 LED 조명으로 데모 플레이트를 실행하여 섹터 이미저 및 소프트웨어의 적절한 기능을 보장하고 이때에도 Reid Buffer를 희석합니다. 앞서 설명한 대로 플레이트를 조심스럽게 세척한 후 멀티 채널 피펫을 사용하여 기포를 방지하기 위해 주의하면서 각 웰에 150마이크로리터의 Reid Buffer를 추가한 다음 threeplex 분석을 시작하기 전에 섹터 이미저에서 플레이트를 즉시 스캔합니다.

96웰 쓰리플렉스 플레이트와 희석제 용액이 실온과 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 그런 다음 PBS의 1%blocker A 25마이크로리터를 플레이트에 추가하여 전체 웰이 용액으로 덮여 있는지 확인하고 밀봉된 플레이트를 흔들면서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그 동안, PBS에서 1% 차단제 A에 재조합 심장 미오신 결합 단백질 C-C-K-M-B와 심장 트로포닌 I을 함께 희석하여 심장 미오신 결합 단백질 C 1밀리리터당 2000나노그램, CKMB 밀리리터당 100나노그램 및 심장 트로포닌 밀리리터당 25나노그램을 포함하는 표준을 생성합니다.

그런 다음 이 혼합물을 PBS에서 1% 차단제 A로 두 번 두 번 희석한 각 표준 샘플에 대해 최소 100마이크로리터의 최종 부피로 5배 희석합니다. 다음으로, 3 개의 플렉스 플레이트의 웰에 이미 존재하는 25 마이크로 리터의 차단 버퍼에 2 개의 25 마이크로 리터 표준 기술 복제물과 샘플을 추가하고, 흔들면서 밀봉 된 플레이트를 배양 한 후에 만 희석제 블랭크를 포함하고, 2 시간 후에 3 개의 SUL oag 검출 항체를 1 % 용액 차단제 A와 PBS에서 각각 밀리리터 당 1 마이크로 그램의 최종 농도로 함께 희석합니다. 방금 설명한 대로 플레이트를 세척한 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 각각에 25마이크로리터의 검출 항체 용액을 추가합니다.

배양 기간 동안 700RPM으로 흔들면서 밀봉된 플레이트를 1시간 동안 잘 배양합니다. 데모 플레이트를 실행하고 방금 설명한 대로 Reid 버퍼를 희석합니다. 그런 다음 PBS에서 0.05% 트윈 20으로 플레이트를 세척한 후 멀티채널 피펫을 사용하여 기포를 방지하는 각 웰에 150마이크로리터의 리드 버퍼를 추가하고 섹터 이미저에서 플레이트를 즉시 스캔합니다.

이 그림에서는 플렉스 분석에서 심장 미오신 결합 단백질 C의 표준 곡선을 3 플렉스 분석에서 심장 미오신 결합 단백질 C의 표준 곡선과 비교합니다. 두 분석 모두 매우 높은 감도와 높은 동적 범위를 보여줍니다. 분석의 검출 영역은 plex 및 three plex 모두 회색으로 표시됩니다.

심장 미오신 결합 단백질 C 표준 곡선은 유사합니다. 검출 하한선, 정량화 하한선 및 정량화 수준의 상한은 plex 및 threeplex 어세이 모두에서 비슷합니다. 이 그래프는 삼각판의 심장 트로포닌 I 및 CKMB 표준 곡선을 보여줍니다.

두 캘리브레이터 모두 높은 감도와 넓은 다이나믹 레인지를 보여주었습니다. 분석의 검출 영역은 회색으로 표시됩니다. 다른 두 개의 캘리브레이터와 검출 항체의 교차 반응은 세 캘리브레이터 모두의 개별 표준 곡선을 단일 검출 항체로 배양하여 연구되었으며, CKMB 캘리브레이터와 심장 트로포닌 I 및 심장 미오신 결합 단백질 C 검출 항체 사이에는 적은 양의 교차 반응만 관찰되었습니다.

심장 손상 감지를 위한 분석의 적용 가능성에 대한 증거로 다른 캘리브레이터와 검출 항체 간에 교차 반응은 관찰되지 않았지만, 심근 경색이 있는 16명의 피험자의 혈청 수치를 심장 미오신 결합 단백질 C-C-K-M-B 및 심장 트로포닌의 3가지 플렉스 플레이트 혈청 수치를 사용하여 대조군과 비교했습니다. 저는 심근경색 환자에서 세 가지 바이오마커가 모두 대조군에 비해 증가한 것으로 확인되었습니다.