Name: 멀티 플렉스 Fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 학습하세요 실험동물 혈청에서 다중 감염원 항체를 동시 검출하는 MFIA 기법을 활용한 면역학 분석 방법을. 이 기술은 기존 ELISA보다 적은 시료와 시간으로 효율적인 혈청학적 감시를 가능하게 합니다.

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여기에 제시된 연구는 찰스 강 (Charles River)에 의해 지원되었다.

<ol><li>MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href=" http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf"> http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf">http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf</a> (2007).</li>
<li>Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobson%2C+RH+%22Manual+of+Standards+for+Diagnostic+Tests+and+Vaccines%22">Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines</a>. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).</li>
<li>Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWright%2C+PF+%22Rev.+sci.+tech.+Off.+int.+Epiz%22">Rev. sci. tech. Off. int. Epiz</a>. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).</li>
<li>Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).</li>
<li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li>
</ol>

찰스 강 (Charles River) 래드, 동물 혈청학 시험 서비스와 시약의 주요 공급자에 대한 모든 작가 작동합니다.

MFIA 테스트 과정은 전통적인 singleplex 테스트보다 장비와 작은 샘플 및 시약 볼륨을 필요로하는, 매우 효율적입니다. 멀티 플렉스 시스템의 기능은 사용자에게 실험실 동물에 공통 에이전트의 여러 변종 또는 serotypes (즉, Coronavirus, parvoviruses 등)를 동시에 상영 할 수있는 유연성을 제공합니다. 이것은 또한 관심을 (예 : 특정 바이러스의 가족)의 영역에 따라 맞춤 비드 패널을 설계하기 위해 우리가 할 수 있으며 크린 시토 킨 및 기타 생체 분자 등의의 심사 다른 유형에 적용 할 수 있습니다. 또한, 우리가 샘플 및 시스템 적합성을 확인하기 위해 몇 가지 내부 통제의 assays를 통합함으로써 결과의 정확성을 보장 할 수 있습니다. 이러한 조직 제어 및 샘플 적합성을 평가하기 위해 IgG 방지 테스트 혈청 종 면역 글로불린 (αIg) 코팅 구슬 세트가 포함되어 있습니다. 조직 제어 구슬은 혈청 면역 글로불린의 비 특정 바인딩과 αIg 비드 제어 확인을 감지그 혈청을 추가하고 충분한 면역 글로불린 농도를 포함하고 있습니다. 혈청 종 면역 글로불린으로 코팅 다른 컨트롤 구슬은, 라벨 시약 및 분석 리더가 제대로 작동하고 있는지 보여줍니다. 기타 상업적으로 이용 가능한 멀티 플렉스 형식 serologic의 assays (예 : MicroArrays, ImmunoComb)는 결과 확인이 동일한 수준을 제공하지 않을 수도 있습니다. 이전 retesting에 대한 분석 실패의 가능한 소스를 좁힐 수있는 능력은 조사관 시간과 물질을 절약 할 수 있습니다. MFIA의 중요한 측면은 실패 샘플을 반복하기 전에 확인해야합니다. 검정은 주위 온도에서 실시되어 있기 때문에이 실험실 온도가 약 27 것을 확인해야합니다 ° C ± 2 ° C, 높은 온도가 컨트롤과 샘플 예상 점수보다 낮은 될 수 있습니다. 세탁은 아마도 분석에서 가장 중요한 단계입니다. 테스트 판이 제대로 씻어되어 일지, blotted 및 제거 할 수 있습니다 resuspended낮은 비드 카운트 (누적 구슬로 인해) 또는 부족 시약 추가 (테스트 판 필터 아래에서 wicking에 의해 손실)으로 인한 샘플링 오류의 대부분. 우리는 정기적으로 분석 당 25 구슬 (에이전트)를 계산하고 또한 접시 이상 읽기 시간에 이끌 비즈 높은 수를 계산하여 결과에 통계적 차이를 발견 없습니다. 우리는 알려진 긍정적이고 부정적인 혈청 샘플을 다수의 테스트하여 진단 정확성, 재현성 및 견고성을 입증하기 위해 일반적으로 사용되는 실험실 동물의 여러 종 (마우스, 쥐, 햄스터, 기니 돼지와 토끼)에 MFIA 종합 검증 연구를 수행하고,이 자신의 엘리사, IFA와 MFIA 결과를 비교. MFIA의 검출 한계 (즉, 표준 면역 혈청 적정 종점)에 비교했고, 경우에 해당 엘리사의 사람들, 능가. SPF 쥐 커로 측정 진단 특이성은 99 % 초과, 전체 통신 betweeN 엘리사와 MFIA 95 % 이상이었다 알려져 긍정적 알려진 부정적인 커 수행. 요약이 결과는 멀티 플렉스 MFIA는 singleplex 엘리사에게 좋은 대체하며, 실험실 동물 식민지의 일상 serosurveillance에서의 용도, 즉에 적합한 것을 증명.

멀티 플렉스 fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

생물 의학 연구에 사용되는 동물 모델의 품질을 보장​​하기 위해 우리는 동물 우발적 인 전염성 대리인 (mycoplasma 바이러스, 및 기타 까다로운 미생물)에 노출 된 경우 결정하기 위해 진단 테스트 전략 및 방법의 수를 개발했습니다. 면역 적격 동물의 감염은 일반적으로 과도 있으며, 아직 감염 혈청 항체 반응은 종종 주 일 이내에 감지 할 수 있으며 호스트의 수명이 다할 때까지 유지됩니다. 혈청학은 실험실 동물 모니터링하는이 기본 진단 방법입니다. 역사적으로 간접 효소 연결된 면역 분석 (엘리사)는 serosurveillance의 주요 심사 방법이었습니다. 엘리사는 하나 미생물 항원 항체 반응은 당 잘 측정되는, singleplex으로 수행됩니다. 비교 MFIA은 멀티 플렉스 분석으로 수행됩니다. 마이크로 100 고유 한 색상 세트에 온 이후, 많은 백 등 다양한 assays는 simultan을 수행 할 수 있습니다eously 하나의 microplate에 잘. 이 혁신은 물론 하나의 실험에서 얻은 정보의 양을 증가시키는 동시에 일상적인 테스트에 필요한 혈청, 시약 및 disposables의 양을 감소시킵니다. 또한, 샘플 및 시스템 적합성을 확인하기 위해 여러 내부 통제 비즈를 통합함으로써 결과의 정확성을 보장 할 수 있습니다. 이러한 조직 제어 및 샘플 적합성을 평가하기 위해 IgG 방지 테스트 혈청 종 면역 글로불린 (αIg) 코팅 구슬 세트가 포함되어 있습니다. 엘리사와 IFA에서와 같이, 조직 제어는 혈청 면역 글로불린의 비 특정 바인딩을 감지합니다. αIg 제어 (세럼 컨트롤)은 혈청이 추가되었습니다 확인하고 혈청 종 면역 글로불린으로 코팅 IgG 제어 구슬 (시스템 적합성 컨트롤), 레이블 시약 및 Luminex 독자가 제대로 작동을 증명하는 동안 충분한 면역 글로불린 농도가 포함되어 있습니다.

Luminex Corporation의 xMAP의 microsphere 기술을 사용, 우리는 다양한 실험실 동물 종의 serosurveillance에 대한 다중 Fluorometric 면역 분석법 (MFIA)를 개발했습니다. MFIA는 항원, 조직 제어 또는 면역 글로불린이 covalently 색으로 구분되는 폴리스티렌 마이크로에 연결되어 정지 microarray입니다. MFIA 테스트 방법뿐만 아니라 다양한 문제 해결 항목은 해결됩니다.

멀티 플렉스 Fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결

생의학 연구에 사용되는 동물 모델의 품질을 보장하기 위해, 당사는 ... 여부를 판단하기 위한 다수의 진단 테스트 전략 및 방법을 개발하였습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 실험 동물 내의 외래성 감염원에 대한 항체를 검출하는 것입니다. 이는 테스트 혈청을 항체가 코팅된 미세구체와 함께 배양함으로써 수행됩니다. 그 다음, 항원-항체 면역 복합체를 검출하기 위해 혈청을 비오틴 표지된 종 특이적 항-면역글로불린과 함께 배양합니다.그 다음, 비오틴화된 면역글로불린을 검출하기 위해 스트렙타비딘 표지 FICO eryn Fluor force 용액을 첨가하며, 멀티플렉스 형광, 면역 분석 순 점수, 형광 샘플 값을 기반으로 실험실 설치류의 일반적인 병원체에 대한 항체 양성 또는 음성 상태를 나타내는 결과를 얻습니다. ELISA와 같은 기존 방법보다 이 기술을 사용할 때 얻는 주요 장점은 MFIA가 멀티플렉스 분석법이라는 점입니다. 이를 통해 연구자는 단 한 번의 테스트로 최대 100가지의 서로 다른 분석 항목을 스크리닝할 수 있습니다.이 기술은 기존 방식에서 사용되는 혈청 부위와 일회용 소모품의 양을 줄이는 동시에, 단일 테스트에서 생성되는 정보의 양을 늘려줍니다. 저희는 처음에 다수의 혈청 샘플을 대상으로 여러 병원체를 테스트하면서 노동력과 테스트 시간을 단축하고자 했을 때 이 방법의 사용을 고안했습니다. 실험 절차 시연은 저희 실험실의 수석 기술자인 Donna Cohen이 진행하겠습니다. 먼저, 다중 형광 면역 분석법(MFIA) 절차에 필요한 두 가지 버퍼를 준비하십시오.첫 번째는 1차 희석제로, Charles River에서 구입 가능하며 분석 세척 버퍼의 비특이적 상호작용을 줄이기 위한 독자적인 블로킹제가 포함되어 있습니다. 입자성 물질을 제거하기 위해 1% BSA가 포함된 pH 7.4의 PBS 용액을 준비하십시오. 분석 세척 버퍼를 사용하여 0.2 micron 보틀 탑 필터 유닛을 통해 버퍼를 여과한 후, 멸균된 라벨 부착 용기에 담으십시오.검사 혈청 배양 단계에서 형성된 항원-항체 복합체를 라벨링하는 데 사용할 biotinylated antis species, IGG 또는 BAG 및 strep AVID 및 FICO erything 또는 SPE의 2배 농도 용액을 준비하십시오. 다음 재료 및 일회용품을 준비하십시오: 조립된 멀티 및 싱글 채널 마이크로피펫과 팁, 그리고 단백질 희석용 96-well low protein binding 마이크로타이터 플레이트입니다. 혈액 샘플을 수집하고 혈청을 분리한 후, 96-well 마이크로타이터 플레이트 내의 1차 희석액에 샘플을 희석하기 전에 혈청을 짧게 볼텍싱하여 웰 내에서 적절하고 균일하게 분주되도록 하십시오. 96-well 검사 플레이트의 모든 웰을 assay wash buffer로 미리 적신 후, 분석 과정 전반에 걸쳐 용액을 천천히 흡입하십시오.비드 응집 및 필터 막으로의 비드 압착을 방지하기 위해 흡입 시간은 5~10초가 소요되어야 하며, 이러한 현상은 분석 종료 시 판독 시간을 늦출 수 있습니다. 테스트 플레이트 하단을 종이 타월로 닦아 액체 배출이 중단되었는지 확인하십시오. 배양 중 웰에서 액체가 모세관 현상으로 빠져나가는 것을 방지하기 위해 매 세척 단계 후에 테스트 플레이트를 닦아내는 것이 중요합니다.비즈를 준비하려면 먼저 결합된 비즈 스톡 현탁액을 볼텍싱하십시오. 그런 다음 수조에서 짧게 초음파 처리하십시오. 비즈 응집체가 형성되면 판독 시간이 길어질 수 있으므로, 비즈를 적절하게 재현탁하는 것이 매우 중요합니다.다음으로, 20배 농축 스톡 현탁액을 1차 희석액 내의 2배 농축 작업 비드 용액에 분주합니다. 그런 다음, 2배 농축 비드 현탁액 50 µL를 미리 적셔둔 테스트 플레이트의 각 분석 웰에 분주합니다. 미리 정의된 플레이트 맵에 따라 각 2배 농축 테스트 및 대조 혈청 50 µL를 테스트 플레이트에 피펫팅합니다.플레이트 뚜껑을 단단히 닫습니다. 알루미늄 호일로 덮은 후, 용액의 증발로 인해 분석 실패가 발생하는 것을 방지하기 위해 상온의 오비탈 셰이커에서 테스트 플레이트를 60분 동안 배양합니다. 모든 배양 단계 동안 테스트 플레이트의 뚜껑을 덮은 상태로 유지하십시오.또한, 결합된 항원의 모든 표면에 혈청 항체가 접근할 수 있도록 비드가 현탁 상태를 유지할 수 있게 진탕 속도를 400 RPM 초과 700 RPM 미만으로 설정해야 합니다. BAG 및 SPE를 이용한 비드의 순차적 배양으로 플레이트를 세척한 후, 샘플을 다시 세척하십시오. 그 후 125 µL의 분석 세척 완충액을 첨가하여 비드를 재현탁하고 2분 동안 진탕한 뒤 플레이트를 판독하십시오.비드를 재현탁한 후 10분 이내에 분석 리더기에 넣으십시오. 비드는 검출기를 하나씩 통과하며 두 개의 레이저에 노출됩니다. 하나의 레이저는 비드 색상 세트를 식별하는 내부 염료를 여기시키고, 다른 하나는 FICO erything 리포터 염료를 여기시킵니다. 미리 정해진 수의 비드에 대한 FICO erything 형광 강도가 FM FI로 보고됩니다. 선택한 비드 패널이 테스트 웰의 비드 프로필과 일치하는지 확인하기 위해 첫 번째 웰을 읽으십시오.프로토콜 디스플레이의 지정된 비드 영역 바깥으로 비드가 떨어진다면, 프로파일 선택이 잘못된 것입니다. 적절하게 재부유된 비드는 어세이 리더 소프트웨어에 표시된 대로 지정된 영역을 채우게 됩니다. 비드가 응집된 경우에는 영역을 채우는 속도가 느려집니다.테스트 플레이트를 리더기에서 꺼내어 웰을 수동으로 재현탁하여 비드를 분리할 수 있습니다. 테스트 플레이트를 리더기에서 꺼낸 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰을 3~4회 트리레이트(tri rate)하십시오. 그런 다음 테스트 플레이트를 리더기에 다시 넣고 결과 분석을 계속하십시오.부적절한 비드 수 또는 감소하는 IgG anti IgG 비드 점수와 같은 오류가 보고되면, 해당 샘플에 대해 분석을 반복하십시오. 데이터를 Excel로 내보내고 순 MFI를 계산한 후, 고농도 면역 혈청을 제외한 테스트 플레이 분석 대조군 중 실패한 항목이 있는지 확인하십시오. 실패한 대조군이 있는 경우 분석 결과는 수용 불가능하며, 분석을 반드시 반복해야 합니다.이 표는 일반적인 분석 플레이트의 테스트 혈청 및 분석 컨트롤 데이터를 나타냅니다. 모든 IgG 컨트롤이 통과되었습니다. 이 플레이트의 테스트 결과는 주황색 웰에서 볼 수 있듯이 다수의 조직 반응성 및 IgG 컨트롤 샘플이 실패했음을 나타냅니다.A1C 1과 F1은 TC 조직 반응 실패를 나타내며, 여기서 TC 점수는 괄호 안에 표시됩니다. Wells B 1과 E 1은 각각 BAG 또는 SPE로 인한 테스트 항체 또는 테스트 시약 부족이라는 두 가지 유형의 IgG 내부 대조군 실패를 보여줍니다. 테스트 플레이트 결과는 시스템 적합성 대조군과 혈청 대조군이 여기에 표시된 허용 기준을 충족하는 경우에만 해석됩니다. 종 특이적 항-테스트 혈청 면역글로불린이 코팅된 마이크로스피어는 샘플 추가량 부족, 너무 높은 샘플 희석도, 잘못된 종 또는 면역 결핍 숙주의 테스트 혈청 사용으로 인해 실패 점수를 나타낼 수 있습니다.테스트 플레이 분석 대조군 결과가 만족스러운 경우, 개별 분석 점수를 다음과 같이 분류합니다. 이 절차에 따라, 예상치 못한 결과나 양성 판정이 처음으로 나타나면 ELISA, IFA 또는 Western blot과 같은 추가 방법을 사용하여 이를 확인해야 합니다. 동물 관리 결정을 내리기 전에 이러한 결과들을 검증하는 것이 매우 중요합니다.이는 동일한 샘플이나 동일한 콜로니에서 얻은 추가 샘플에 서로 다른 방법론을 적용하여 수행할 수 있습니다. 본 영상을 시청하고 나면, 멀티플렉스 형광 측정 면역 분석법(multiplex fluoro, metric immunoassay)을 수행하는 방법과 귀하의 시설에서 얻은 결과를 해석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이를 통해 각 테스트 샘플 웰에서 더 많은 정보를 수집하는 동시에 노동력을 줄일 수 있습니다.

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연구

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