Dye-Labeled Magnetic Microspheres를 사용한 Multiplexed Quantitative Bacterial Detection

스펙트럼적으로 다른 형광단으로 내부적으로 염색된 자성 폴리스티렌 마이크로스피어의 혼합물이 포함된 분석 플레이트를 가져 가십시오.

각 마이크로스피어 세트는 별개의 병원성 박테리아 특이적 포획 항체와 공유 결합됩니다.

열로 죽인 병원성 박테리아 혼합물을 첨가하십시오. 인큐베이트.

포획 항체는 표적 박테리아 항원에 결합하여 마이크로스피어-박테리아 복합체를 형성합니다.

자기 분리기를 사용하여 복합체를 침전시킵니다. 결합되지 않은 박테리아를 버리고 완충액으로 세척하십시오.

마이크로스피어 결합 박테리아에 특이적으로 결합하는 완충액 및 비오티닐화 검출 항체를 추가합니다.

복합체를 자기적으로 분리하고 완충액으로 세척합니다.

복합체를 완충액에 재현탁합니다. 비오티닐화 검출 항체에 결합하는 형광단 결합 스트렙타비딘을 포함하는 피펫 리포터 분자.

복합체를 자기적으로 분리하고 세척합니다. 버퍼에 재현탁합니다.

흐름 기반 분석 중에 첫 번째 레이저는 마이크로스피어의 내부 형광단을 여기시켜 고유한 스펙트럼 시그니처를 생성하고 고유한 마이크로스피어 세트를 식별합니다.

두 번째 레이저는 마이크로스피어의 박테리아에 결합된 형광단 리포터를 여기시켜 다양한 마이크로스피어 세트의 박테리아를 정량화하여 다중화된 정량적 박테리아 검출을 가능하게 합니다.

샘플 캡처의 경우 50마이크로리터의 마이크로스피어 또는 항체를 포획하기 위해 접합된 비드를 96웰 플레이트에 추가하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 병원성 박테리아 50마이크로리터에 이어 PBS-TBN 50마이크로리터를 배경 웰에 추가합니다.

호일 플레이트 씰로 플레이트를 덮고 플레이트 셰이커에서 800rpm으로 한 시간 동안 배양합니다.

그런 다음 플레이트를 마그네틱 분리기에 1분 동안 올려 비드를 분리합니다. 플레이트를 마그네틱 플레이트 분리기에 유지하면서 나머지 용액을 배출합니다. 그런 다음 실험용 종이 타월을 3-4번 두드려 말립니다. PBS-TBN으로 우물을 두 번 철저히 세척하십시오.

샘플 검출을 위해 50마이크로리터의 분석 완충액에 이어 밀리리터당 4마이크로그램의 농도로 50마이크로리터의 비오티닐화 검출 항체를 웰에 추가합니다.

박테리아와 검출 항체 간의 효율적인 상호 작용을 허용하기 위해 플레이트를 어두운 곳에서 한 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 마그네틱 분리기를 사용하여 비드를 분리하고 앞서 설명한 대로 PBS-TBN으로 비드를 세척합니다.

드를 50마이크로리터의 분석 완충액에 재현탁하고 50마이크로리터의 스트렙타비딘-R-피코에리트린 또는 형광 리포터 분자인 SAPE를 첨가합니다. 호일 플레이트 씰로 플레이트를 덮고 플레이트 셰이커에서 30분 동안 배양합니다.

웰이 세척되면 비드를 100마이크로리터의 PBS-TBN에 재현탁하고 플레이트를 유량 기반 분석기에 로드합니다.

적절한 소프트웨어를 사용하여 판독값을 기록하십시오. 각 유기체에 대한 순 중앙값 형광 강도 값은 표준 곡선을 통해 평가하여 샘플에 존재하는 박테리아 부하를 결정할 수 있습니다.