종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

이 절차의 목적은 3D로 배양된 세포를 간질성 유체 흐름에 노출시키고 세포 침입에 대한 흐름 매개 효과를 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 유형 1 콜라겐과 마트리겔로 구성된 겔 용액을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 겔 용액에 지정된 농도의 세포를 추가하는 것입니다.

다음으로, 세포 현탁액을 직경 12mm, 공극 크기 8미크론 트랜스웰에 첨가하고 매트릭스가 겔화될 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다. 분석 설정의 마지막 단계는 트랜스웰에 특정 양의 매체를 추가하여 정적 및 유동 조건을 생성하는 것입니다. 24시간 후, transwell membranes는 침범된 세포의 수를 정량화하기 위해 고정, 염색 및 시각화됩니다.

미세유체, 간질 유동 챔버와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 펌프나 특수 장비가 필요하지 않으며 연구원이 여러 조건 또는 치료를 쉽고 빠르게 테스트할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 세포 이동 및 침입에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 단백질 발현, 세포 증식 및 세포 신호 전달의 변화와 같은 다른 관련 세포 행동에 대한 간질액 흐름의 영향을 연구하는 데에도 사용하거나 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 LIMA 두 개의 차아가 될 것입니다.

내 연구실의 한 대학원생: 섭씨 4도의 얼음 위에 작은 마트리 젤 분취액을 던져 이 절차를 시작합니다. 다음으로, PBS 멸균수, 수산화나트륨, 마트리겔 및 쥐꼬리 1형 콜라겐으로 젤 레시피를 준비합니다. 그런 다음 젤의 구성 요소를 동일한 순서로 얼음에 혼합하고 최종 용액을 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.

이제 한 쌍의 멸균된 집게를 사용하여 12mm 직경의 8 마이크로 PO 세포 배양 삽입물을 12웰 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 세포를 세고 밀리리터당 6개의 세포에 5배 10으로 혈청이 없는 매체에서 재현탁하고 900마이크로리터의 겔 용액에 100마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 그 후, 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 완전히 혼합하십시오.

그런 다음 각 삽입물에 150마이크로리터의 최종 혼합물을 추가합니다. 그런 다음 겔이 중합될 때까지 30분 동안 인서트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮깁니다. 정적 상태의 경우 젤 위에 100마이크로리터의 무혈청 매체를 추가하고 인서트 아래에 1, 200마이크로리터 마이크로리터를 추가합니다.

웰의 인서트 내부와 외부의 유체 레벨은 거의 동일해야 하며, 그 결과 겔 전체의 압력 차이가 최소화되고 틈새 흐름이 없어야 합니다. 유동 조건의 경우 인서트 아래에 100마이크로리터의 무혈청 매체를 추가하고 겔 위에 650마이크로리터를 추가합니다. 동시에 삽입물 아래에 기포가 생성되면 세포가 이러한 위치에서 멤브레인을 통해 이동하는 것을 방지할 수 있으므로 이를 피하십시오.

그런 다음 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다. 이 단계에서는 인서트 세척을 위해 웰당 PBS의 1배 500마이크로리터를 새로운 24웰 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 흐름 추세 우물의 상부에 남아 있는 매체를 제거합니다.

그런 다음 면봉을 사용하여 인서트에서 젤을 제거합니다. 비 VA 세포를 제거하기 위해 멤브레인 표면의 상단을 닦습니다. 그런 다음 15초 동안 1회 PBS를 포함하는 24웰 플레이트에 삽입물을 두어 인서트를 세척합니다.

그런 다음 PBS를 제거하고 각 인서트 아래에 500 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 첨가하십시오. 트랜스 마이그레이션된 세포를 고정하기 위해 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PFA를 제거하고 500 마이크로 리터로 한 번 헹구고 PBS를 한 번 헹구어 잔류 정착제를 제거합니다.

다음으로, 인서트 아래에 500마이크로리터의 0.5% Triton X 100 용액을 넣고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 침투시키려면 면도날을 사용하여 삽입물 밖으로 멤브레인을 잘라냅니다. 그런 다음 100 마이크로 리터에 1 회 PBS 용액에서 밀리리터 당 2 마이크로 그램 DPI의 100 마이크로 리터에 놓습니다.

멤브레인의 아래쪽이 아래를 향하도록 주의합니다. DPI 솔루션은 사용하기 몇 분 전에 준비하고 어두운 곳에 보관해야 합니다. 이제 플레이트를 알루미늄 호일로 감쌉니다.

150RPM의 셰이커에 올려 실온에서 30분 동안 놓습니다. 그런 다음 500 마이크로 리터에서 멤브레인을 PBS 1 회 세척하고 10 분 동안 셰이커에 다시 놓습니다. free jy를 제거하려면 세척을 두 번 더 반복하십시오.

다음 단계는 트랜스 마이그레이션된 세포가 위를 향하도록 유리 슬라이드에 멤브레인을 배치하는 것입니다. 멤브레인에 장착 용액을 추가합니다. 그런 다음 커버 슬립으로 덮으십시오.

그 후, 핵에 대한 dappy stain을 세고 함께 제공된 원고에 따라 침입 한 세포의 수를 계산합니다. 이 그림은 막의 trans migrated MDA MB 4 35 s 세포를 보여줍니다. 침입한 세포는 간질성 유체 흐름 침입 분석 후 고정되고 침입된 세포의 계수를 용이하게 하기 위해 DPI 및 Alexa Fluor 4 88 접합 foid in으로 염색되었습니다.

이것은 명시야 아래의 막이고 다음은 dappy stain nuclei입니다. F 액틴으로 염색된 Alexa Fluor 4 88 foid가 여기에 나와 있습니다. 이 그래프는 MDA MB 4 35 s 전이성 흑색종 세포의 침입이 간질류에 의해 현저히 강화되었음을 보여줍니다.

24시간 후, 결과는 정적 침입 조건의 평균으로 정규화되고 6개의 세포 배양 삽입물의 평균이 제시됩니다. 조건 간의 차이는 P 값이 0.003으로 통계적으로 유의합니다. 마스터하면 간질성 유체 흐름 분석을 2시간 내에 설정한 다음 24시간 배양한 다음 변형 멤브레인을 고정하고 염색하는 데 2시간 안에 설정할 수 있습니다.

이 절차에 따라 세포, 단백질 또는 핵산을 쉽게 추출하여 간질액 흐름에 반응하여 유전자 및 단백질 발현이 어떻게 변화하는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 이후 이 분석법은 간질성 흐름이 암세포에 미치는 영향을 연구하는 연구자들에게 필수적인 분석법이 되었습니다.