Name: 종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 배우세요 3D 세포 배양에서 종양 세포 침략에 미치는 중간 유체 흐름의 효과를 정량화하는 방법을. 콜라겐과 마트리겔을 사용한 이 기술은 암 미세환경 연구에 필수적입니다.

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1. 분석 설정 <ol><li> 4 ° C (약 2 시간)에 얼음 Matrigel의 작은 나누어지는 (&lt;500 μl)을 녹여. </li><li> 겔 제조법 (아래 표에서 예를 들어 볼륨을 참조) 준비 : 10X PBS (총 판매량 1X), 1N 수산화 나트륨을 (추가 콜라겐의 0.023 권에 상응하거나 콜라겐 제조 업체의 권장 사항마다 적절한 등), Matrigel과 콜라겐이에 나를 입력 1 MG / ML 및 1.3 밀리그램 / 각각 ML (다른 매트릭스 공법은 세포 종류와 실험에 따라 사용될 수있다)의 최종 농도. </li></ol> 예 겔 제조법 <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 주식 농도 </td><td> 최종 농도 </td><td> 볼륨을 추가 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10X </td><td> 1X </td><td> 0.090 ML </td></tr><tr><td> 멸균 물 </td><td></td><td></td><td> 0.346 ML </td></tr><tr><td> 1N NaOH </td><td></td><td></td><td> 0.008 ML </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 9.90 밀리그램 / ML </td><td> 1 MG / ML </td><td> 0.101 ML </td></tr><tr><td> 쥐의 꼬리 타입 I의 콜라겐 </td><td> 3.66 밀리그램 / ML </td><td> 1.3 MG / ML </td><td> 0.355 ML </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 4 ° C.에 1 시간을위한 위의하고 품어 최종 해결책 &#39;같은 순서대로 얼음 젤의 구성 요소를 섞어 우리의 경험에서 콜라겐의 더 많은 유니폼을 겔화의 세포 시딩 결과 이​​전 1 시간 보육. 항상 얼음 Matrigel과 콜라겐을 유지하고 겔화 방지를 위해 최대한 빨리 가능한 작동하도록해야합니다. </li><li> 소독 집게를 사용하여 12도 강판으로 장소 12mm 직경 8 μm의 기공 세포 배양 삽입합니다. </li><li> 5 X 10 6 세포 / ML (총 볼륨 겔 용액의 10 %이어야합니다)에 혈청이없는 미디어 셀 및 resuspend 세어보세요. </li><li> 세포 통화 100 μl 추가겔 용액 900 μl (최종 세포 농도가 5 × 10 5 세포 / ML)에 spension하며 위아래로 가볍게 pipetting에 의해 철저하게 섞는다. </li><li> 겔은 polymerizes 때까지 30 분 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에 각각 삽입 및 전송로 최종 혼합물의 150 μl를 추가합니다. </li><li> 혈청 프리 미디어를 사용하면, </li></ol><ul><li> 정적 상태에 삽입 이하 겔과 1,200 μl 위에 100 μl를 추가합니다. 우물에 삽입하고 외부 내부의 액체 레벨 겔없이 중간 흐름 전반에 걸쳐 최소한의 압력 차이가 발생, 약이어야합니다. </li><li> 유동 상태에 젤 위에 넣고 650 μl 아래 100 μl를 추가합니다. 그들이 이러한 위치에있는 멤브레인 통해 마이 그 레이션에서 세포를 차단하므로 삽입 아래에있는 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. 이러한 볼륨에 의해 생성되는 압력 차이는 약 1.3 cm H 2 O (또는 1mm HG)입니다. </li></ul><ol start="9"><li> 37의 장소 플레이트° C, 24 시간을위한 5% CO 2 배양기. </li></ol> 2. 세포 염색법과 집계 <ol><li> 500 1X PBS의 μl 당 자로 새로운 24 잘 플레이트를 추가, 이것은 삽입을 씻어 사용됩니다. </li><li> 흐름 transwells의 상단 부분에 남아있는 매체를 제거하고 볼륨을 결정합니다. 원래, 650 μl를 (이것은 아래 참조, 유량 계산에 사용됩니다) 추가된 총 볼륨에서 나머지 볼륨을 빼는 방법으로 총 eluted 볼륨을 계산합니다. 삽입에서 젤을 제거 및 비 침략 세포를 제거하는 멤브레인의 상단 표면을 닦아하기 위해 면봉을 사용합니다. 삽입을 씻어 15 s에 대한 1X PBS를 포함하는 24 잘 판에 삽입 놓으십시오. </li><li> PBS를 제거하고 transmigrated 세포를 해결하기 위해 상온에서 30 분간 각각 넣고 품어 밑에 4 % paraformaldehyde (PFA) 500 μl를 추가합니다. </li><li> PFA를 제거하고 잔류 정착액을 제거하기 위해 500 μl 1X PBS로 한번 헹굼. </li><li> 500 μl O를 추가하십시오세포를 permeabilize 위해 상온에서 10 분 삽입하고 품어 아래 F 0.5 % 트리톤 X-100 솔루션입니다. </li><li> 아래로 막 얼굴의 아래쪽에 배치하기 위해 신중하다고, 2 μg / 1X PBS 용액에 ML DAPI 100 μl로 면도날과 장소를 사용하여 삽입 세포막을 잘라 (transmigrated 세포 뒤집음). </li><li> 상온에서 30 분간 150 rpm으로 흔드는에 알루미늄 호일과 장소에서 랩 플레이트. </li><li> 흔드는 500 μl 1X PBS 무료 DAPI를 제거하는 (각 10 분 반복 3 회)에서 세포막을 씻으십시오. </li><li> 최대 직면한 transmigrated 전지와 유리 슬라이드에 플레이스 점막은 마운팅 솔루션과 커버 슬립을 추가합니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 각 멤브레인 5 임의로 선택된 위치 (거리 가장자리에서 머물면서 10X 또는 20X 객관 렌즈 사용)에 DAPI 묻은 핵을 세어보세요. </li><li> 평균 셀 카운트를 계산하고 다음 수식을 사용하여 %의 침공을 얻을 : %의 침공 = 100 % X (평균 세포 개수 X 막 면적) / (세포 씨앗의 현미경 이미지 X 번호의 표면적) %의 침공은 독립적인 실험 간의 비교를 가능하도록하기 위해서 몇 가지 제어 상태 (일반적으로 정적 상태)로 정규화 할 수 있습니다. </li><li> 배양 시간 (예, 24 시간)에 의해 유동 조건에서 총 eluted 볼륨을 분할 : 평균 유속을 계산합니다. </li><li> 평균 유속 계산 : 젤 / 멤브레인 (이 경우에는 60mm 2)의 단면적에 의한 평균 유속을 나눕니다. </li></ol> 4. 대표 결과 중간 흐름 미만의 종양 세포 침공을 측정하기 위해, 우리는 MDA-MB-435S 전이성의 흑색증 세포를 사용하여 우리의 3 차원 유동 침략 분석을 수행. 이러한 세포는 이전에 중간 유체 유동 13-14에 대한 응답으로 침략을 보여왔다. 전지는 1.3 밀리그램 / ML 쥐 타이 구성된 매트릭스에 박혀 있었다난 힘줄의 콜라겐 유형 I 및 5 × 10 5 세포 / ML의 최종 세포 농도 1 밀리그램 / ML Matrigel 지하 막 행렬. 두 가지 조건을 비교했다 : (1) 평균 중간 흐름 = 0.1 μm의들 -1 (2) 정적 상태 = 노 측정 가능한 유량 (그림 1). 24 시간 후, 멤브레인의 땀구멍으로 침입 세포는 세포 계수를 촉진하기 위해 DAPI 물들일되었다. 그림 2는 침략 세포의 대표적인 이미지를 보여줍니다. brightfield에서 막만을 모공도 볼 수 있습니다. 형광 사용 DAPI 묻은 핵은 세포 계수와 phalloidin 스테인드 F-actin 구조에 사용되었다는 세포 본문 (선택 사항) 시각화하는 데 사용되었습니다. 동등 변화하는 가정 학생의 T-테스트를 ​​사용하여, 우리는 그 중간 흐름이 크게 (그림 3) (P = 0.003) 정적 조건 이상의 2.3 배하여 MDA-MB-435S 세포 침공을 증가했다. 이 corrobora이 세포주 13-14를 사용하여 유사한 결과를 (하지만 다른 매트릭스 조건에 따라서 유량 판매율 포함) 오셨. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig1.jpg" /> 그림 1. 3 차원 침입형 유체 유동 침략 분석의 도식. 먼저 적절한 농도와 볼륨을 사용하여 겔 용액을 준비합니다. 그런 다음 겔 용액에 세포를 추가하고 세포 배양 삽입에 전송할 수 있습니다. 마지막으로 각 조건에 미디어의 적절한 볼륨을 추가하고 알을 품다. 침입형 유체의 흐름은 유체 압력의 머리에 의해 주도된다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig2.jpg" /> 그림 2. 막에 MDA-MB-435S 세포를 Transmigrated. 명시야 이하 멤브레인의) 사진; 침략 세포 침입 세포 계수 촉진하기 위하여 DAPI와 알렉사 형석와의 중간 유체 흐름 침략 분석과 스테인드 488-복합 phalloidin 후 수정되었습니다 B) DAPI 역ined 핵 (파란색), C) 알렉사 형석 488-phalloidin의 스테인드 F-actin (녹색). 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig3.jpg" /> 그림 3. 흐름 이하 MDA-MB-435S 세포의 침공 증가했습니다. 24 시간 후 세포 침공은 크게 중간 유량 (P = 0.003)에 의해 향상. 결과는 평균 정적 상태로 정규화과 가치는 6 세포 배양 삽입의 평균 ± SEM을 대표하고 있습니다.

<ol><li>Cichon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+influences+that+drive+progression+from+benign+breast+disease+to+invasive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland.+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer.</a> J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).</li>
<li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma%3A+tumor+agonist+or+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stroma: tumor agonist or antagonist.</a> Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment and progression.</a> J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+transfer+of+fluid+in+the+interstitial+compartment+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors.</a> Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).</li>
<li>Dafni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+drives+peritumor+interstitial+convection+and+induces+lymphatic+drain%3A+magnetic+resonance+imaging%2C+confocal+microscopy%2C+and+histological+tracking+of+triple-labeled+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin.</a> Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).</li>
<li>Chary, S. R., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interstitial+convection+and+diffusion+of+albumin+in+normal+and+neoplastic+tissues+by+fluorescence+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).</li>
<li>Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).</li>
<li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microvasculature+and+microenvironment%3A+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li>
<li>Shields, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chemotaxis+as+a+mechanism+of+tumor+cell+homing+to+lymphatics+via+interstitial+flow+and+autocrine+CCR7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling.</a> Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).</li>
<li>Shieh, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+is+promoted+by+interstitial+flow-induced+matrix+priming+by+stromal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts.</a> Cancer Res. 71, 790-800 (2011).</li>
<li>Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+interstitial+flow+mechanotransduction+regulating+MMP-13+expression+and+cell+motility+via+FAK-ERK+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen.</a> PLoS One. 6, e15956(2011).</li>
<li>Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+morphogen+gradients+by+subtle+interstitial+flow+and+matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions.</a> Biophys J. 91, 113-121 (2006).</li>
<li>Miteva, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+flow+modulates+cell+and+fluid+transport+functions+of+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium.</a> Circ. Res. 106, 920-931 (2010).</li>
<li>Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+induces+myofibroblast+differentiation+and+collagen+alignment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro.</a> J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).</li>
<li>Kunder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+particles+deliver+peripheral+signals+to+remote+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).</li>
<li>Helm, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+interstitial+flow+and+VEGF+directs+capillary+morphogenesis+in+vitro+through+a+gradient+amplification+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).</li>
<li>McGuire, P. G., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+plasminogen+activator+with+a+reconstituted+basement+membrane+matrix+and+extracellular+macromolecules+produced+by+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells.</a> J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).</li>
<li>Haessler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+dynamics+of+breast+cancer+cells+in+a+tunable+3D+interstitial+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber.</a> Integr. Biol. (Camb). , (2011).</li>
<li>Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+influences+direction+of+tumor+cell+migration+through+competing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기에서 우리는 세포 배양 삽입 내에 3 차원 매트릭스에 포함된 세포를 이용하여 종양 세포 침공에 침입형 흐름의 효과를 quantifying위한 방법론을 설명했습니다. 이것과 유사한 방식이 세포 유형에 13-15, 17의 다양한 침입형 흐름의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다. 우리의 접근 방식은 일부 유형을 사용하여 종양의 매트릭스 microenvironment을 모방한 것이었 나 상피 조직과 주변 기질 21-22 지하 막에서 발견된 단백질을 포함 콜라겐과 Matrigel. 이 시스템은 비교적에 설정 쉽고 간단하며 비용이 훨씬 더 체외 23-24에 침입형 유체의 흐름을 연구하는 데 사용되는 대부분의 microfluidic 장치를보다 효과적입니다. 그것은 펌프 또는 전문 장비가 필요하고 동시에 테스트할 수 있도록 여러 조건을 허용하지 않습니다. 또한, 측정은 일반적으로 침략과 migra를 테스트하는 데 사용되는 기존 Boyden 챔버 assays 분들 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 콜라겐 (쥐 꼬리) </td><td> BD </td><td> 354,236 </td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> Millicell의 세포 배양 삽입 </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td> 8 μm의 기공 직경, 폴리 카보 네이트 멤브레인 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td> 354,234 </td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 100M-8202 </td><td> 단계를 빨 겔 솔루션 1X를 준비하기위한 10X </td></tr><tr><td> 수산화 나트륨, 1.0N 솔루션 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> S2770 </td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> DMEM 1X </td><td> CellGro </td><td> 10-013 - 이력서 </td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> 511,150 </td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> 페니실린의 스트렙토 마이신 </td><td> CellGro </td><td> 30002CI </td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> X100-500 ML </td><td> PBS의 0.5 % </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 피셔 과학 </td><td> 04042-500 </td><td> PBS의 4퍼센트 </td></tr><tr><td> 탈이온수 </td><td></td><td></td><td> 무균 유지 </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6 diaminido-2-phenylindole (DAPI) </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 0215757401 </td><td> 1 MG / ML 주식 솔루션 </td></tr><tr><td> 마운트 솔루션 </td><td> 써모 과학 </td><td> TA-030-FM </td><td></td></tr><tr><td> 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> CellGro </td><td> 25-052-CI </td><td> 무균 유지 </td></tr></tbody> &lt;/ TABLE&gt;

종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

대부분의 고체 종양의 성장과 진보는 암 세포와 기질 - 연관된 종양 microenvironment 1에서 신호에 대한 그들의 반응의 초기 변화에 따라 달라집니다. 이전에는 종양 microenvironment에 관한 연구는 주로 종양 - stromal 상호 작용 1-2에 주력하고있다. 그러나, 종양 microenvironment도 효과 저조한 이​​해 남아 biophysical 세력, 다양한 포함되어 있습니다. 이들 세력은 유전자 발현의 변화, 세포 분열, 분화 및 침공 3로 이어질 종양 성장의 biomechanical 결과입니다. 매트릭스 밀도 4, 강성 5-6, 6-7 및 구조, 중간 유체 압력 8, 침입형 유체의 흐름 8 모든 암 진행하는 동안 변경됩니다. 특히 침입형 유체의 흐름은 정상 조직의 8-10에 비해 종양으로 높다. 예상 침입형 유체 층오우 판매율은 측정 및 종양 크기와 차별화 9, 11에 따라 0.1-3 μm의들 -1의 범위에 있어야 발견되었다. 이것은 종양 유발 angiogenesis 및 증가된 혈관 투과성 12 시까지 인한 고가 중간 유체 압력에 의한 것입니다. 침입형 유체의 흐름은 암세포 13-14, 혈관 섬유아 세포 및 평활근 세포 15 침략을 향상을 보여줘왔다. 이 침공은 3-D 16 셀 주위 만들거나 모체 metalloproteinase (MMP) 표현 15, 케모카인 분비와 세포 유착 분자 발현 17 증가 autologous chemotactic의 그라디언트가 원인일 수 있습니다. 그러나 세포가 유체의 흐름을 감지하는 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 종양 세포의 행동을 변화 이외에도, 중간 유체 흐름은 종양 microenvironment의 다른 세포의 활동을 modulates. 이것은 종양 - 홍보 myofibr으로 섬유아 세포의 (A) 운전 분화와 관련된oblasts 18 (b)는 항원과 림프절 19, 그리고 (c) modulating 림프 내피 세포 morphogenesis 20 ~ 다른 용해 요인에 호송. 여기에 제시된 기술은 체외에서 세포에 침입형 유체 흐름을 부과하고 침공 (그림 1)에 미치는 영향을 quantifies. 이 방법은 stromal 및 암 세포 침입 13-15, 17 일에 유체 흐름의 효과를 측정하기 위해 여러 연구에 게시되었습니다. 매트릭스 구성, 셀 유형, 및 세포 농도를 변경하면이 방법은 이러한 침략, 분화, 증식 및 유전자 발현 등의 세포 프로세스에 침입형 흐름의 효과를 연구하기 위해 다른 질환과 생리적 시스템에 적용할 수 있습니다.

침입형 유체의 흐름은 고체 종양에서 상승되며 종양 세포 침공을 조절하실 수 있습니다. 여기에서 우리는 매트릭스에 포함된 세포에 침입형 유체 흐름을 적용한 다음 세포 침입에 미치는 영향을 측정할 수있는 기법을 설명합니다. 이 기술은 쉽게 다른 시스템을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

대부분의 고형암의 성장과 진행은 암세포의 초기 변이와 기질 관련 신호 전달에 대한 암세포의 반응에 따라 달라집니다...

본 절차의 목적은 3D 배양된 세포를 간질액 흐름에 노출시키고, 흐름에 의해 매개되는 세포 침습 효과를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 type one collagen과 matrigel로 구성된 겔 용액을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 해당 겔 용액에 특정 농도의 세포를 첨가하는 것입니다.다음으로, 세포 현탁액을 직경 12 millimeter, 공극 크기 8 micron의 트랜스웰(transwell)에 넣고 매트릭스가 겔화될 때까지 37 °C에서 배양합니다. 분석 설정의 마지막 단계는 정적 및 흐름 조건을 형성하기 위해 트랜스웰에 특정 양의 배지를 추가하는 것입니다. 24시간 후, 침습된 세포 수를 정량화하기 위해 트랜스웰 막을 고정하고 염색하여 시각화합니다.미세유체, 간질 흐름 챔버와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 펌프나 특수 장비가 필요하지 않으며, 연구자가 여러 조건이나 처리 방법을 쉽고 빠르게 테스트할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 세포 이동 및 침습에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질 발현, 세포 증식 및 세포 신호 전달의 변화와 같이 다른 관련 세포 행동에 간질액 흐름이 미치는 영향을 연구하는 데에도 사용하거나 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 LIMA two chaa가 될 것입니다.본 실험실의 대학원생이 4°C 얼음 위에 Matrigel 소량을 분주하며 이 절차를 시작합니다. 다음으로 PBS 멸균수, 수산화나트륨, Matrigel, 그리고 rat tail type one collagen을 사용하여 겔 레시피를 준비합니다. 그런 다음 얼음 위에서 겔 성분들을 동일한 순서대로 혼합하고, 최종 용액을 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.이제 멸균된 핀셋을 사용하여 지름 12 mm의 8 $\mu$m 공극 세포 배양 인서트를 12웰 플레이트에 배치합니다. 그다음 세포 수를 측정하고 무혈청 배지에서 5 $\times$ 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁한 후, 세포 현탁액 100 $\mu$L를 젤 용액 900 $\mu$L에 첨가합니다. 그 후, 피펫팅을 통해 부드럽게 위아래로 섞어 충분히 혼합합니다.그 후, 최종 혼합물 150 µL를 각 인서트에 추가합니다. 그런 다음 인서트를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터로 옮겨 겔이 중합될 때까지 30분 동안 배양합니다. 정적 조건의 경우, 겔 위에 무혈청 배지 100 µL를 추가하고 인서트 아래에 1,200 µL를 추가합니다.웰 내 인서트 내부와 외부의 액체 수준은 거의 동일해야 하며, 이를 통해 겔 양단에 가해지는 압력 차이를 최소화하고 간질 유동이 없도록 해야 합니다. 유동 조건의 경우, 인서트 아래에 100 µL의 무혈청 배지를 추가하고 겔 위에는 650 µL를 추가하십시오. 이때 인서트 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 기포가 생기면 해당 위치에서 세포가 막을 통해 이동하는 것이 방해받을 수 있습니다.그 다음 플레이트를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 24시간 동안 배양합니다. 이 단계에서는 인서트를 세척하기 위해 새로운 24-well 플레이트의 각 웰에 1× PBS 500 µL를 추가합니다. 그런 다음 flow trends 웰의 상단부에 남아 있는 배지를 제거합니다.다음으로, 면봉을 사용하여 인서트에서 겔을 제거합니다. 비-VA 세포를 제거하기 위해 멤브레인 표면의 윗부분을 닦아냅니다. 그런 다음, 1배 PBS가 들어 있는 24웰 플레이트에 인서트를 15초 동안 넣어 세척합니다.그 후, PBS를 제거하고 각 인서트 아래에 4% para formaldehyde 500 microliters를 첨가합니다. 이행된 세포를 고정하기 위해 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PFA를 제거하고 500 microliters의 PBS로 한 번 헹구어 잔류 고정액을 제거합니다.다음으로, 인서트 아래에 0.5% Triton X 100 용액 500 µL를 넣고 상온에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 투과화하기 위해 면도날을 사용하여 인서트에서 멤브레인을 잘라냅니다. 그런 다음, 1× PBS 용액에 2 µg/mL DPI가 포함된 100 µL 용액에 멤브레인을 넣습니다.멤브레인의 아랫면이 아래를 향하도록 주의하여 배치하십시오. DPI 용액은 사용하기 몇 분 전에 준비하여 암소에 보관해야 합니다. 이제 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸십시오.이를 진탕기(shaker)에 넣고 상온에서 150 RPM으로 30분 동안 반응시킵니다. 그 다음 500 µL의 PBS로 막(membrane)을 1회 세척한 후, 다시 진탕기에 넣고 10분 동안 반응시킵니다. 결합되지 않은 jy를 제거하기 위해 세척 과정을 2회 더 반복합니다.다음 단계는 투과된 세포가 위를 향하도록 막을 유리 슬라이드 위에 놓는 것입니다. 막에 마운팅 용액을 첨가합니다. 그런 다음 커버슬립으로 덮습니다.그 후, 핵의 dappy 염색을 계산하고 동봉된 원고에 따라 침습된 세포의 수를 산출합니다. 이 그림은 막 위로 이행된 MDA MB 4 35 s 세포를 보여줍니다. 침습된 세포는 간질액 흐름 침습 분석 후 고정되었으며, 침습된 세포의 계산을 용이하게 하기 위해 DPI 및 Alexa Fluor 4 88 접합 foid로 염색되었습니다.명시야(brightfield) 하에서의 막의 모습이며, 여기에는 DAPI로 염색된 핵들이 보입니다. F-actin으로 염색된 Alexa Fluor 488-phalloidin이 여기에 나타나 있습니다. 이 그래프는 MDA-MB-435 전이성 흑색종 세포의 침윤이 간질액 흐름(interstitial flow)에 의해 유의하게 증가했음을 보여줍니다.24시간 후, 결과는 정적 침습 조건의 평균값으로 정규화하며, 6개의 세포 배양 인서트의 평균값을 제시합니다. 조건 간의 차이는 P 값이 0.003으로 통계적으로 유의미합니다. 숙련되면 간질액 흐름 분석법은 2시간의 준비, 24시간의 배양, 그리고 트랜스웰 막의 고정 및 염색을 위한 2시간의 과정으로 수행할 수 있습니다.이 절차를 통해 세포, 단백질 또는 핵산을 쉽게 추출할 수 있으며, 이를 통해 간질액 흐름에 반응하여 유전자 및 단백질 발현이 어떻게 변화하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 개발 이후, 이 방법은 간질 흐름이 암세포에 미치는 영향을 연구하는 연구자들에게 필수적인 분석법이 되었습니다.

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입체 세포외 매트릭스에 종양 세포 침공의 모델이 더...

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

이 동영상은 3차원 종양 스페로이드와 T 세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. 종양 스페로이드를 함유하는 마이크로웰이 있는 아가로스 캐스트를 준비한 후 T 세포를 첨가합니다. 배양 후 이 설정을 통해 통제된 3차원 환경에서 T 세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

종양 스페로이드에 침투하는 T 세포의 3차원 공동 배양 모델

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

암세포를 콜라겐 겔에 삽입한 다음 무세포 피브린 겔에 끼워 넣어 위성 종양의 침습성과 형성을 모니터링할 수 있는 3D 배양 시스템을 생성합니다.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

침습은 암의 발병과 진행에 있어 중요한 생물학적 현상입니다. 이 과정은 비종양 세포와 종양 미세환경의 구성 요소에 의해 영향을 받습니다. 이 연구의 목적은 3차원(3D) 배양을 사용하여 종양 세포 침입을 in vitro 분석하는 대체 방법을 설명하는 것입니다.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

배우세요 3D 세포 배양에서 종양 세포 침략에 미치는 중간 유체 흐름의 효과를 정량화하는 방법을. 콜라겐과 마트리겔을 사용한 이 기술은 암 미세환경 연구에 필수적입니다.

종양 세포 침략에 중간 유체 흐름의 효과를 측정하는 세 가지 차원 세포 배양 모델

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