CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

제 이름은 Maria이고 스웨덴 NOS의 Y Healthcare에서 일하고 있습니다. 세포 표면 단백질은 종종 세포와 세포 환경 간의 의사 소통에 관여하기 때문에 세포 환경 변화로 인해 유발되는 기타 생물학적 변이뿐만 아니라 질병에 대한 더 많은 통찰력을 얻는 것을 목표로 하는 연구에 특히 관심이 있습니다. 이 비디오에서는 간단한 측면 눈 회피 세포 표면 라벨링 프로토콜을 보여드릴 것이며, 물리적 향상 없이 이러한 낮고 풍부한 단백질을 시각적으로 농축하고 기술을 통해 이러한 세포 표면 단백질의 차이를 연구할 수 있습니다.

이 기술에 관심이 있다면 2D 핸드북에서 자세한 정보를 찾을 수 있습니다. 또한, 이 특정 주제에 대한 애플리케이션 노트가 있으며, 이 노트는 작업에서 다운로드할 수 있습니다 상단에 표시된 세포 표면 라벨링 프로토콜에서는 세포가 손상되지 않은 상태에서 세포에 라벨을 지정합니다. 라벨링 과정에서 염료는 세포 표면 단백질에만 접근할 수 있습니다.

라벨링 단계 후, 세포를 분석하여 세포 표면별 라벨링을 확인합니다. 라벨 샘플은 멤브레인 및 세포질 단백질로 분획되었습니다. 비분획 샘플을 병렬로 준비했습니다.

비교를 위해 이 분획 분석은 필요하지 않지만, 세포 표면 프로토콜이 cell surface pro 팁에 특이적임을 보여주기 위해 여기에서 수행되었습니다. 우리는 또한 아래에 보이는 표준 ETH 비다이어트 라벨링 프로토콜을 수행했으며, 세포는 라벨링 전에 거짓말이며, 이러한 방식으로 모든 세포 단백질에 라벨링에 접근할 수 있습니다. 라벨링 단계 후 샘플은 2D 전기영동을 받습니다.

부착 세포는 표적이 된 세포 표면 단백질의 소화를 피하기 위해 비효소 절차를 사용하여 분리됩니다. 이 프로토콜에서는 고무 경찰관을 사용하지만 효소 3 세포 해리 매체를 사용하는 것도 옵션 카운트이며 세포 현탁액을 튜브 당 5-1,000 만 개의 세포로 나눕니다. 그런 다음 세포를 펠렛화하고 H-P-S-S-P-H 7.4로 세척하여 세포 배양의 흔적을 제거합니다.

혈청 단백질과 형광 성분으로 인한 배지 오염은 라벨링 및 검출을 방해할 수 있습니다. 현탁액에서 성장하는 세포는 세척 후 라벨링 단계 전에 직접 펠릿화되고 세척됩니다. 셀 팔레트는 HPSS pH 8.5 및 1 몰 뇨를 포함하는 200 마이크로 리터의 얼음 저온 라벨링 버퍼에 재현 탁됩니다.

세포 표면 단백질의 최적 표지 조건을 위해 항상 pH를 확인하십시오. 라벨링하기 전에 1,000만 개의 CHO 세포에 대해 600 pic mold side-eye를 사용했습니다. 세포 수에 대한 측면 눈의 최적 비율은 세포 유형에 따라 다릅니다.

우리는 세포 표면의 정확한 단백질 농도를 알지 못하기 때문입니다. 단백질의 측면 표지를 위한 최적의 조건을 결정하는 방법은 2D 전기영동 원리 및 방법 핸드북에 설명되어 있습니다. 세포는 어둠 속에서 얼음 위에서 20분 동안 측면 눈 D 바닥, 최소한의 주사위로 배양됩니다.

라벨링 반응 후, 20 마이크로 리터의 10 밀리 몰 라이신을 첨가하여 반응성 염료를 담금질합니다. 이제 라벨 셀을 차가운 HPSS pH 7.4 버퍼에서 두 번 세척하여 여분의 측면 눈을 제거합니다. 따라서 세포 용해(cell lysis)라는 다음 단계에서 원치 않는 세포 내 표지 또는 단백질을 위한 유리 염료가 남지 않습니다.

이제 세포 표면의 단백질에 라벨이 지정되고 세포가 세척되어 liced될 준비가 되었습니다. 손실된 세척 단계의 펠릿을 7개의 어금니, 2개의 몰 thi 뇨, 4%chaps, 30개의 몰, 5개의 아세트산 마그네슘, pH 8.5를 포함하는 150마이크로리터의 냉간 용해 완충액에 재현탁하고 때때로 소용돌이 과세를 가하면서 최소 1시간 동안 얼음 위에 둡니다. 이제 샘플을 2D 분리할 준비가 되었습니다.

전기분해의 첫 번째 단계는 재수화를 위해 IPD 스트립을 준비하는 것입니다. 사용된 스트립의 pH 간격에 해당하는 IPG 완충액을 첨가하여 지역 재수화 용액을 준비하고 재수화 트레이의 렌즈에 용액을 추가합니다. IPG 스트립의 보호 필름을 제거하고 재수화 용액이 들어 있는 재수화 트레이에 건조된 젤이 아래를 향하도록 스트립을 조심스럽게 놓습니다.

IPG 상자의 뚜껑을 닫고 밤새 스트립을 재수화하십시오. 첫 번째 차원인 등전 집중에서는 단백질이 파이에 따라 분리됩니다. 이는 IPG 포쓰리를 사용하여 수행된다.

재수화된 스트립은 매니폴드에 배치되고 전극은 상단에 장착됩니다. 각 샘플에서 50마이크로그램을 샘플 도포 캡을 사용하여 적용했습니다. 당사는 사전 분획 없이 분획되지 않은 샘플을 직접 적용하거나 적용하기 전에 샘플을 멤브레인 및 세포질 분획으로 분획했습니다.

리드는 형광 샘플을 빛으로부터 보호하기 위해 닫혀 있습니다. 기기는 권장 사항에 따라 프로그래밍되어 밤새 실행되었습니다. 큰 12% 램비 젤은 성인 12 젤을 사용하여 비용이 들었습니다.

Coster 치환 용액은 튜브에서 중합된 acry 겔을 피하기 위해 추가되었습니다. 겔은 사용하기 전에 실온에서 밤새 중합되도록 했습니다. 등전 집중시키기 후에, 스트립은 DTT를 사용하여 2개 단계에 있는 완충액을 포함하는 SDS에서 아크릴 아미드에 의하여 수정을 피하기 위하여 당신의 아세트아미드를 가진 알킬화에 이어 시스테인 잔기의 디 황화물 결합을 감소시키기 위하여 제거되고 평형을 이룹니다.

IPG 스트립을 러닝 버퍼에 담그고 두 개의 큰 dig gel 위에 조심스럽게 놓습니다. 스트립과 밀봉된 젤 사이에 공기를 가두지 않도록 그 위에 브로모 아놀 블루와 함께 녹은 2% 농업 용액을 첨가하여 밀봉하십시오. 이제 겔은 2차원 SDS 페이지에서 2차원 SDS 페이지를 분리할 준비가 되었습니다.

단백질은 분자량에 따라 분리되며 이는 tonal six 시스템으로 수행됩니다. 전기영동 챔버를 양극 러닝 버퍼로 채우고, 겔을 삽입하고, 상단 컴파트먼트를 음극 러닝 버퍼 프로그램으로 채웁니다. 권장 사항에 따라 전원 공급 장치를 실행하고 약 4-5 시간 동안 또는 염료 전면이 젤의 바닥에 도달 할 때까지 빛으로부터 보호되는 2 차원을 실행합니다.

2차원 전기영동 후에, 젤 카세트는 태풍 형광성 영상장치에 있는 그리퍼를 이용하여 둡니다. 2개의 겔과 3개의 채널을 동시에 스캔할 수 있습니다. 이 2개의 DL에서 결과는 비록 A 2 DL.The 결과에서 검출될 소수성 단백질을 위한 몇몇 알려진 금지가 있더라도, 표본에 있는 막 단백질의 고해상을 보여줍니다 녹색에서 여기에서 보인 표준 레테르를 붙이는 프로토콜을 사용하여 검출되지 않는 빨강에서 여기에서 보이는 많은 새로운 세포 표면 상표 반점을 보여줍니다.

이 결과는 세포 표면 라벨링 프로토콜이 세포 표면 단백질을 라벨링하는 데 매우 특이적임을 보여줍니다. 세포 표면 단백질은 독점적으로 라벨링되기 때문에 더 쉽게 시각화할 수 있으며 풍부한 세포질 단백질에 의한 감쇠를 피할 수 있습니다. non fractionated membrane fraction 또는 cytosolic fraction을 가진 겔의 형광 이미지가 상단에 표시됩니다.

아래는 은색으로 얼룩진 동일한 젤의 이미지입니다. 결과는 세포질 단백질의 형광 표지를 보여주지 않지만, 은 염색은 겔에 단백질이 있음을 보여줍니다. 또한 결과는 비분획 및 멤브레인 분획의 유사한 스폿 맵 패턴을 보여주며, 이는 2D 전기영동 전에 분획이 필요하지 않음을 보여주며, 이는 이 프로토콜을 간단하고 편리하게 만듭니다.

SI 2, SI 3 및 SCI 5는 유사한 라벨링 패턴을 보이며 모두 셀 표면 프로토콜과 호환됩니다. 다이어트 실험은 서로 다른 시간 동안 혈청 결핍의 CHO 세포에서 세포 표면 단백질의 차등 발현을 연구하기 위해 3개의 측면 눈 DI floor 최소 dy를 모두 사용하여 수행되었습니다. 실험의 모든 샘플에서 CY 2개의 세포 표면 샘플을 모아 내부 표준물질로 사용했습니다.

여러 세포 표면 단백질의 차등 변화는 기아 기간 동안 추적될 수 있습니다. 분취용 겔에서 단백질의 정체를 찾기 위한 표준 프로토콜로는 검출되지 않은 세포 표면 프로토콜을 사용하여 18개 이상의 새로운 막 단백질이 검출되었습니다. 분석 데이터 세트의 스폿과 쉽게 일치시킬 수 있도록 세포 표면 샘플로 스파이크해야 했습니다.

결과가 있습니다. 결과는 많은 수의 세포 표면 단백질의 높은 해상도를 보여줍니다. 이 프로토콜은 세포 표면 단백질에 대해 매우 특이적이며 세포 내 단백질의 표지는 관찰되지 않았습니다.

이 방법을 사용하면 표준 프로토콜에 비해 더 많은 세포 표면 단백질을 검출할 수 있으며, 이미 보았듯이 실행이 매우 간단한 프로토콜입니다. 세포 표면 단백질이 손상되지 않은 상태에서 라벨을 지정하고 멤브레인 분획 없이 2D 전기영동에서 직접 실행하기만 하면 됩니다. 따라서 이것은 세포 표면 단백질과 D 기술의 차이점을 연구하는 데 매우 좋은 프로토콜입니다.