Name: CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 배우세요 세포 표면 단백질의 선택적 형광 라벨링 방법을 CyDye DIGE 기술과 2차원 전기영동을 활용하여. 이 프로토콜은 분획 없이 저발현 단백질을 풍부하게 검출하여 세포 신호전달 및 질병 연구에 활용됩니다.

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우리가 그들의 협력 임상 병리학, 비엔나, 오스트리아의 대학의 연구소에서 교수 Dontscho Kerjaschki, 코리나 Mayrhofer 및 시거드 크레 이거 감사합니다.

세포 배양 <ol><li> GlutaMAX 나는 10 % 태아 송아지 혈청, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신 황산 (Invitrogen)를 포함과 함께 F - 12 햄 매체의 표준 세포 배양 절차를 사용하여 중국어 햄스터 난소 세포를 (CHO - K1) 성장. </li><li> 혈청이없는 미디어로 문화 매체를 교환. 라벨 세포 표면 단백질은 CyDye DIGE 플루어 Cy3 또는 Cy5 최소한의 염료 (아래 섹션 세포 표면 라벨을 참조) 다른 시간 지점에 있었다. </li><li> 각각의 시점과 CyDye DIGE 플루어 Cy2와 레이블에서 세포의 풀 같은 숫자. 각각의 2 - D 겔을위한 내부 표준으로 이들을 사용합니다. </li><li> 실험의 대부분은 CHO - K1 세포로 수행할 수 있지만, 마우스 배아 섬유아 세포 (3T3 L1)와 마우스 복수의 림프종 lymphoblasts (EL4)도 (데이터가 표시되지 않음) 사용할 수 있습니다. </li><li> GlutaMAX II와 DMEM 매체 두 후자의 셀 유형을 성장하지만, 그렇지 않으면, CHO - K1 세포에 사용되는 동일한 조건을 사용합니다. </li></ol> 세포 표면 라벨링 <ol><li> 조심스럽게 계산 및 50-10 x106 세포의 aliquots 나누어 아닌 효소 자기편 세포를 분리. 정지 성장 세포 들어, 분리 단계를 생략하십시오. </li><li> 5 분 약 800 XG에있는 세포를 원심 분리기 suspensions. 매체를 포함하는 supernatants를 제거합니다. </li><li> 1 ML 얼음 차가운 행크의 밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) 산도 8.5에서 resuspendion하여 알약을 씻으십시오. 4 800 XG ° 2 분 C에서 Centrifuged. </li><li> 뜨는를 제거하고 200 μl 얼음 차가운 라벨 버퍼에있는 세포 펠렛을 (HBSS 산도 8.5, 1 M 우레아) resuspend. </li><li> 어두운 얼음 속에서 20 분 동안 600 pmol CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료로 그대로 세포 라벨. </li><li> 라이신 20 μl 10 MM을 추가하여 반응을 끄다. 10 분 알을 품다. </li><li> 4 800 XG에서 원심 분리 ° C 2 분 뒤에 500 μl HBSS의 산도 7.4에 resuspension에 의해 두 번 표면 라벨 세포를 씻으십시오. </li></ol> 세포 용해 및 분류 <ol><li> 150 μl 차가운 용해 완충액 (7 M의 요소, 2 M 티오 우레아, 4 % 챕스, 30 MM 트리스, 5 MM의 마그네슘 아세테이트 산도 8.5)에 표면 라벨 세포를 Lyse. 가끔 vortexing 최소한 1 H 위해 얼음에 둡니다. </li><li> 4 10 000 XG에 lysates을 원심 ° C를 5 분. 새로운 튜브에 뜨는를 전송합니다. 이 예제는 모든 세포 단백질을 포함하는 비 fractionated 예제입니다. </li><li> 병렬, 멤브레인 및 cytosolic 분수 이전 2 - D 겔 전기 영동에로 (막 분획화 키트를 사용하여 피어스), 위에서 다음 분류 셀 알약을 씻으십시오. 멤브레인 분율은 내부와 세포 표면 막 단백질을 포함하고 있습니다. </li><li> 비교, 표준 Ettan DIGE 절차 3에 따라, 그리고 lyse, 레이블, 그리고 세포 마지막으로, 분류. D 퀀트 키트 (GE 헬스케어) - 2를 사용하여 샘​​플의 단백질 농도를 결정합니다. </li></ol> 2 - D 전기 영동 <ol><li> Immobiline의 DryStrip의 젤, Immobiline DryStrip Reswelling 트레이, 하루 450 μl DeStreak의 Rehydration 솔루션 24cm (0.5 %는 IPG 버퍼)를 사용하여 pH를 3 11NL을 (24cm) Rehydrate. </li><li> 매니폴드의 양극 컵로드하여 DryStrip 젤류을 Immobiline하고 지시에 따라 Ettan IPGphor II IEF 시스템을 사용하여 isoelectric 초점 (IEF)을 수행할 수있는 CyDye - 라벨 샘플 (50 μg 총 단백질에 해당)이 적용됩니다. </li><li> IEF 후, 대형 (26 X 20cm) 12.5 %의 polyacrylamide의 젤 (SDS - PAGE) 위에 두 단계와 장소에 부착된를 평형. 0.5 % 아가로 오스와 중첩 (bromophenol 파란색을 포함하는 버퍼를 실행에). 30 분 5 W / 겔에서 Ettan DALTtwelve 대형 수직 시스템을 사용하여 2 - D 전기 영동을 실행한 다음 15 염료 앞까지 W / 젤은 젤 하단에 도달합니다. </li></ol> 이미징 및 데이터 분석 <ol><li> 2 - D 전기 영동을 마친 후, 태풍 9,410 변수 모드 영상기를 사용하여 Cy2, Cy3 또는 Cy5에 대한 젤을 검사합니다. </li><li> DeCyder 2 - D 차동 분석 소프트웨어 사를 사용하여 막 분수, cytosolic 분수, 비 fractionated 샘플에서 현장지도를 비교합니다. </li></ol> 포스트 - 염색법 <ol><li> 이미징 후, 실버 표준 절차에 따라 5 젤을 얼룩. </li></ol> 단백질 식별 <ol><li> , 수확을 성장뿐만 아닌 fractionated 샘플 위에서 설명한 예비 금액 (10 x106 CHO 세포에서 약 1 MG 총 단백질) 세포를 씻어 및 lyse. 대못으로 Cy5 세포 표면 라벨 샘플을 (위 참조)를 사용하고, 단백질의 unlabelled 예비 금액과 함께 적용됩니다. </li><li> 위에서 설명한 2 - D 전기 영동을 수행하지만, 이번에는, aplly 600 μg 레이블이 지정되지 않은 세포는 양극 컵 응용 프로그램에 의해 스파이크 표시 50 μg 세포 표면과 함께 lysate. 올바른 장소 따기 수 있도록 참조 마커를 사용하여 할 곳추천 3에 따라 겔 주조하기 전에 트윈은 유리 접시. </li><li> 딥 퍼플 총 단백질 3 얼룩 사용하는 총 단백질 얼룩 다음 Cy5 세포 표면 현장지도를 얻을 수 Cy5 채널에서 젤 스캔. </li><li> DeCyder 사용하여 두 개의 현장지도를 2 - D 소프트웨어를 함께 매치하고 싸이 오 표시된 세포 표면 단백질에 해당하는 모든 장소에 대한 선택 목록을 만들 수 있습니다. Ettan 명소 처리 스테이션을 사용하여 세포 표면 단백질을 선택, 겔 플러그에서 추출하고, Ettan의 소화조를 사용하여 trypsinate. 든 - TOF 질량 분광법을 사용하여 식별합니다. </li></ol> 표 1. Ettan DIGE 실험은 그림 1에있는 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 따라 분류 혈청 고갈 세포의 샘플을 사용하여 수행되었습니다. <table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="text-align:center; font-weight:bold"> 견본 </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> 혈청 고갈의 시간 </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> CyDye과 Labelled </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> 젤 번호 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 1 </td><td style="text-align:center;"> - </td><td style="text-align:center;"> 싸이 3, 싸이 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 2 </td><td style="text-align:center;"> 삼십분 </td><td style="text-align:center;"> 싸이 5, 싸이 2 </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 3 </td><td style="text-align:center;"> 이시간 </td><td style="text-align:center;"> 싸이 3, 싸이 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 4 </td><td style="text-align:center;"> 사시간 </td><td style="text-align:center;"> 싸이 5, 싸이 2 </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 5 </td><td style="text-align:center;"> 16시간 </td><td style="text-align:center;"> 싸이 5, 싸이 2 </td><td style="text-align:center;"> 3 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+the+cell+surface+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li>
<li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ettan+DIGE+System+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+user+manual+18-1164-40%22%5BJournal%5D)">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients%2C+principles+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+handbook+80-6429-60+Edition+AB%22%5BJournal%5D)">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li>
<li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li>
</ol>

단백질 농도 두 상표 워크플로우의 개요는 그림 1에 표시됩니다. 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 따라 분류하면 세포가 그대로 있기 때문에, 단지 세포 표면 단백질이 염색에 노출되어 있습니다. 세포 내부뿐만 아니라 외부 라벨 부착 및 단백질은 (그림 1) 표시되기 전에 표준 Ettan DIGE 프로토콜에서는, 세포가 lysed 있습니다. 세포 - 표면 단백질이 특별히 quantitated 수 없으므로 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 단백질 색소의 상대적 금액은 알 수 없다. 그러나, 그것은 세포 표면 단백질은 세포 단백질이 매우 낮은 비율을 구성하는 것이 알려져 있습니다. 염료 600 pmol에 약 50-10 X10 6 셀 사용되었습니다. 그것은이 연구에서 nonfractionated 샘플만을 12.5-25 %가 2 - D 전기 영동에 사용되는 시절부터 적은 세포를 사용할 수 있습니다. <...

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE 키트, 2 nmol</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9345-30</td><td></td></tr><tr><td>2-D 정량 키트</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>IPG 버퍼 pH 3-11NL</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6004-40</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-77</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox</td><td>도구</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-65</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox 키트</td><td>도구</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-92</td><td></td></tr><tr><td>DeStreak 재수화 용액</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-19</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip 커버 액체</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 IEF 장비</td><td>기기</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 매니폴드</td><td>기기 구성 요소</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6498-38</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTtwelve 겔 캐스터 </td><td>도구</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6467-22</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTtwelve 분리 장치 및 전원 공급/제어 장치</td><td>기기</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6466-46</td><td>230 V 장치: 80-6466-27</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 가변 모드 이미저</td><td>기기</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-81</td><td></td></tr><tr><td>Ettan 스팟 피커</td><td>기기</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1145-28</td><td></td></tr><tr><td>에탄 소화기</td><td>기기</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-68</td><td></td></tr><tr><td>Ettan Spotter</td><td>기기</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-67</td><td></td></tr><tr><td>Ettan MALDI-TOF</td><td>기기</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-33</td><td></td></tr><tr><td>DeCyder 2-D 차이 분석 소프트웨어</td><td>기타</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4012-01</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant 분석 소프트웨어</td><td>기타</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9236-62</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1319-01</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne 디티오트레이톨 (DTT)</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1318-01</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 황산염 (SDS)</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Glycerol 87%</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1325-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1310-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne TEMED</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne 과황산암모늄</td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1311-01</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne 글리신 </td><td>시약</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>막 단백질을 위한 2차원 시료 준비</td><td>시약</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89864</td><td></td></tr><tr><td>황산스트렙토마이신</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

cydye dige 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 labelling

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

표면 단백질은 환경에 반응하고 이웃 세포와 상호 작용하는 세포의 능력의 핵심입니다. 그들은 거의 모든 세포 신호의 inducers 것으로 알려져 있습니다. 또한, 그들은 환경 적응 및 약물 치료에 중요한 역할을하고, 종종 질병 pathogenesis 및 병리 (1)에 참여하고 있습니다. 단백질 - 단백질 상호 작용은 신호 경로에 내장하고 있으며, 이러한 복잡한 생물 학적 과정에 더 많은 통찰력을 얻을 수, 민감하고 안정적​​인 방법은 세포 표면 단백질을 연구 필요합니다. 2 차원 (2 - D) 전기가 차등 변경 사항을 공부 복잡한 단백질 샘플에 생체와 다른 대상의 검출을 위해 광범위하게 사용됩니다. 그들의 낮은 풍부 (세포 단백질의 12 %)로 인해 일부 세포 표면 단백질은 분류 또는 일부 다른 유형의 이득이없는 2 - D 겔에서 감지하기가 어렵습니다. 그들은 또한 종종 제대로 자신의 소수성 자연과 높은 분자량 (2)에 의한 2 - D의 젤으로 표시됩니다. 본 연구에서는, 우리는 단백질이 중요한 그룹의 특정 라벨 및 감지를위한 CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료를 사용하여 그대로 전지에 대한 새로운 프로토콜을 제시한다. 결과는 세포 내 단백질의 최소한의 라벨과 함께 세포 표면 단백질의 다수의 특정 라벨을 보여주었다. 이 프로토콜은 사용하는 빠른 속도, 간단하고, 세 CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료는 (싸이 2, 싸이 3 싸이 5) 세포 - 표면 단백질에 라벨을 사용할 수 있습니다. 이러한 기능은 DeCyder 2 - D 차동 분석 소프트웨어를 사용하여 단백질 발현 변화 Ettan DIGE 기술과 분석 2 - D 형광 차이점 젤 전기 영동 (2 - D DIGE)를 사용하여 멀티플렉싱을위한 수 있습니다. 세포 - 표면 단백질의 수준은 시간을 다양한 길이에 대한 CHO 세포를 (표 1 참조)의 혈청 기아 동안 미행했다. 풍부의 작은 변화는 높은 정밀도로 감지했고, 결과는 정의 통계적 방법으로 지원됩니다.

단순하고 구체적인 방법은 분획화 단계없이 형광 라벨 부착 및 세포 표면 단백질의 향상된 감지를위한 시연했다. 세포 표면 단백질의 차동 풍부한는 (2 - D) 2 차원 전기 영동과 Ettan ™ DIGE 기술을 사용하여 분석했다.

CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

표면 단백질은 세포가 주변 환경에 반응하고 인접한 세포와 상호작용하는 능력의 핵심입니다. 이들은 ...의 유도체로 알려져 있습니다.

제 이름은 Maria이며, 스웨덴 NOS의 Y Healthcare에서 근무하고 있습니다. 세포 표면 단백질은 종종 세포와 주변 환경 사이의 통신에 관여하므로, 세포 환경 변화로 인해 유도되는 기타 생물학적 변이뿐만 아니라 질병에 대한 더 많은 통찰력을 얻고자 하는 연구에서 특히 중요하게 다뤄집니다. 이 영상에서는 간단한 side-eye dodge 세포 표면 표지 프로토콜을 보여드릴 것이며, 여러분은 물리적 증폭 없이도 이러한 저발현 단백질을 시각적으로 농축하고 이 기술을 통해 세포 표면 단백질의 차이점을 연구할 수 있게 될 것입니다.이 기술에 관심이 있으시다면 2D 핸드북에서 더 많은 정보를 확인하실 수 있습니다. 또한, 이 특정 주제에 관한 애플리케이션 노트를 job에서 다운로드하실 수 있습니다. 위에 제시된 세포 표면 표지 프로토콜에서는 세포가 온전한 상태일 때 표지를 수행합니다. 표지 과정 동안 염료는 세포 표면 단백질에만 접근할 수 있습니다.표지 단계 후, 세포 표면 특이적 표지가 이루어졌는지 확인하기 위해 세포를 분석합니다. 표지된 시료를 막 단백질과 세포질 단백질로 분획하였습니다. 이와 병행하여 분획하지 않은 시료도 함께 준비하였습니다.비교를 위해 이 분획 분석은 필수적이지는 않지만, 여기서는 세포 표면 프로토콜이 세포 표면 단백질에 특이적이라는 것을 보여주기 위해 수행되었습니다. 또한 아래에 제시된 표준 ETH 비식단 표지 프로토콜을 수행하였으며, 이 방식에서는 표지 전 세포가 용해되어 모든 세포 단백질이 표지 가능 상태가 됩니다. 표지 단계 이후, 샘플은 2차원 전기영동 분석을 거칩니다.표적 세포 표면 단백질의 소화를 방지하기 위해 비효소적 절차를 사용하여 부착 세포를 분리합니다. 본 프로토콜에서는 고무 폴리스맨(rubber policeman)을 사용하지만, enzyme-free 세포 해리 배지를 사용하는 것도 가능합니다. 세포 현탁액의 수를 측정하고 튜브당 500만에서 1,000만 개의 세포가 되도록 나누어 담습니다. 그 후 세포를 원심 분리하여 펠렛으로 만들고 H-P-S-S-P-H 7.4로 세척하여 세포 배양액의 잔해를 제거합니다.혈청 단백질과 형광 성분으로 인한 배지 오염은 표지 및 검출을 방해할 수 있습니다. 부유 배양된 세포는 표지 단계 이전 세척 후 직접 펠렛화하여 세척합니다. 세포 펠렛은 HPSS pH 8.5와 1 M urea가 포함된 200 µL의 ice cold 표지 버퍼에 재현탁합니다.세포 표면 단백질의 최적의 라벨링 조건을 위해 항상 pH를 확인하십시오. 라벨링 전, 1,000만 개의 CHO 세포에 대해 600 pmol의 side-eye를 사용하였습니다. side-eye와 세포 수의 최적 비율은 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다.세포 표면의 정확한 단백질 농도를 알 수 없으므로, 단백질의 side-eye 라벨링을 위한 최적 조건을 결정하는 방법은 2D 전기영동 원리 및 방법 핸드북에 설명되어 있습니다. 세포를 side eye D floor, minimal dice와 함께 얼음 위 암실에서 20분 동안 배양합니다.표지 반응 후, 10 millimolar 라이신 20 µL를 첨가하여 반응하지 않은 염료를 퀜칭합니다. 표지된 세포를 차가운 HPSS pH 7.4 완충액으로 두 번 세척하여 과잉 염료를 제거합니다. 이렇게 하면 다음 단계인 세포 용해 과정에서 원치 않는 세포 내 표지나 단백질 표지가 일어날 수 있는 유리 염료가 남지 않게 됩니다.이제 세포 표면의 단백질이 표지되었으며, 세포를 세척하여 용해할 준비가 되었습니다. 마지막 세척 단계에서 얻은 펠릿을 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM magnesium acetate (pH 8.5)가 포함된 150 µL의 차가운 용해 버퍼에 재현탁하고, 가끔씩 볼텍싱하며 얼음 위에서 최소 1시간 동안 방치합니다. 이제 샘플은 2차원 분리를 수행할 준비가 되었습니다.전기영동의 첫 번째 단계는 재수화(rehydration)를 위해 IPG 스트립을 준비하는 것입니다. 사용하는 스트립의 pH 범위에 맞는 IPG 완충액을 추가하여 재수화 용액을 제조하고, 이 용액을 재수화 트레이의 렌즈 부분에 넣습니다. IPG 스트립의 보호 필름을 제거하고, 건조된 겔 면이 재수화 용액이 담긴 재수화 트레이를 향하도록 스트립을 조심스럽게 배치합니다.IPG 박스의 뚜껑을 닫고 스트립을 하룻밤 동안 재수화합니다. 1차원 분리인 등전점 전기영동(isoelectric focusing)에서 단백질은 각각의 pI 값에 따라 분리됩니다. 이 과정은 IPG four three를 사용하여 수행합니다.재수화된 스트립을 매니폴드에 배치하고 상단에 전극을 장착합니다. 샘플 적용 캡을 사용하여 각 샘플에서 50 micrograms를 도포합니다. 사전 분획을 거치지 않은 비분획 샘플을 직접 도포하거나, 도포 전 샘플을 막 분획과 세포질 분획으로 분획하였습니다.형광 샘플을 빛으로부터 보호하기 위해 리드를 닫습니다. 장비는 권장 사항에 따라 프로그래밍되었으며 밤새 가동되었습니다. 성체 12 젤을 사용하여 대형 12% lamby 젤을 제작했습니다.튜빙 내에서 아크릴아마이드 겔의 중합을 방지하기 위해 Coster 치환 용액을 첨가하였습니다. 겔은 사용 전 실온에서 하룻밤 동안 중합되도록 두었습니다. 등전점 전기영동 후, 스트립을 제거하고 SDS 함유 완충액에서 두 단계에 걸쳐 평형화합니다. 먼저 DTT를 사용하여 시스테인 잔기의 이황화 결합을 환원시킨 후, 아크릴아마이드에 의한 수정을 방지하기 위해 iodoacetamide로 알킬화합니다.IPG 스트립을 러닝 버퍼에 담근 후, 두 개의 큰 2차원 겔 상단에 조심스럽게 배치합니다. 스트립과 겔 사이에 공기가 갇히지 않도록 브로모페놀 블루(bromo phenol blue)가 포함된 녹인 2% agarose 용액을 상단에 추가하여 밀봉합니다. 이제 겔은 2차원 SDS-PAGE 분리 준비가 완료되었습니다. 2차원 SDS-PAGE 과정에서는단백질은 분자량에 따라 분리되며, 이는 tonal six 시스템을 사용하여 수행합니다. 전기영동 챔버에 양극 러닝 버퍼를 채우고, 젤을 삽입한 후 상단 구획에 음극 러닝 버퍼를 채웁니다. 권장 사항에 따라 전원 공급 장치를 설정하고, 빛이 차단된 상태에서 2차원 전기영동을 약 4~5시간 동안 또는 염료 전선이 젤 하단에 도달할 때까지 실행합니다.2차원 전기영동 후, 그리퍼를 사용하여 젤 카세트를 Typhoon 형광 이미지 분석기에 배치합니다. 두 개의 젤과 세 개의 채널을 동시에 스캔할 수 있습니다. 이 2차원-DL(two DL)의 결과는 소수성 단백질이 2차원-DL에서 검출되는 데 일부 알려진 제약이 있음에도 불구하고, 시료 내 막 단백질의 높은 해상도를 보여줍니다. 결과에서는 표준 라벨링 프로토콜(초록색으로 표시)을 사용했을 때는 검출되지 않았으나, 여기에서는 빨간색으로 표시된 많은 새로운 세포 표면 라벨 스팟들이 나타납니다.이 결과는 세포 표면 표지 프로토콜이 세포 표면 단백질을 표지하는 데 매우 특이적임을 보여줍니다. 세포 표면 단백질만 선택적으로 표지되므로, 이들을 더 쉽게 시각화할 수 있으며 풍부한 세포질 단백질에 의한 감쇄를 방지할 수 있습니다. 분획하지 않은 막 분획물 또는 세포질 분획물이 포함된 겔의 형광 이미지는 상단에 표시되어 있습니다.아래는 은(silver)으로 염색한 동일한 젤의 이미지입니다. 결과에서 세포질 단백질의 형광 표지는 나타나지 않았으나, 은 염색을 통해 젤 내에 단백질이 존재함이 확인되었습니다. 또한, 분획되지 않은 시료와 막 분획물에서 유사한 스팟 맵 패턴이 관찰되었으며, 이는 2차원 전기영동 전 분획 과정이 필요하지 않음을 보여줍니다. 따라서 본 프로토콜은 단순하고 편리합니다.SI two, SI three 및 SCI five는 유사한 표지 패턴을 보이며 모두 세포 표면 프로토콜과 호환됩니다. 혈청 기아 상태의 기간에 따른 CHO 세포 내 세포 표면 단백질의 차등 발현을 연구하기 위해 세 가지 side eye DI floor minimal dy를 모두 사용하여 식이 실험을 수행하였습니다. 실험의 모든 샘플에서 얻은 CY two 세포 표면 샘플을 풀링(pooling)하여 내부 표준 물질로 사용하였습니다.기아 기간 동안 여러 세포 표면 단백질의 차등적인 변화를 추적할 수 있었습니다. 세포 표면 프로토콜을 사용하여, 분취 젤(preparative gel)에서 단백질의 정체를 확인하기 위한 표준 프로토콜로는 검출되지 않았던 18개 이상의 새로운 막 단백질을 검출하였습니다. 분석 데이터 세트의 스팟과 다시 매칭하는 것을 용이하게 하기 위해 세포 표면 샘플을 스파이크(spike)하는 과정이 필요했습니다.결과입니다. 결과에서는 다수의 세포 표면 단백질이 고해상도로 나타남을 보여줍니다. 이 프로토콜은 세포 표면 단백질에 매우 특이적이며, 세포 내 단백질의 표지는 관찰되지 않았습니다.이 방법을 통해 표준 프로토콜과 비교하여 더 많은 세포 표면 단백질을 검출할 수 있으며, 이미 확인하신 것처럼 매우 간단하게 수행할 수 있는 프로토콜입니다. 세포 표면 단백질이 온전한 상태일 때 그대로 라벨링한 후, 막 분획 과정 없이 즉시 2D 전기영동을 실시하면 됩니다. 따라서 이 프로토콜은 세포 표면 단백질과 D 기술을 이용한 단백질 간의 차이를 연구하는 데 매우 유용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 형광 염료와 인간 배아 줄기 세포 및 mesenchymal 줄기 세포의 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 기술은 광학 이미징과 이식 줄기 세포의 생체내 추적에와 형광 현미경과 histopathological 상관 관계에 대해 사용할 수 있습니다.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

CFSE는 covalently 형광 염료, carboxyfluorescein와 긴 세포내 분자를 표시합니다. 따라서, CFSE - 표시 셀 분할 때, 그 자손 이는 세포 분열을 평가하는 데 사용할 수있는 형광의 절반 금액을 보유하고 있습니다. 이 문서는 일반적으로 CFSE와 마우스 lymphocytes를 라벨에 사용되는 절차를 설명합니다.

림프구 확산을 모니터 Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 Succinimidyl 에스터 (CFSE)의 사용

면역 세포 기능과 확산을 모니터하기위한 셀 추적 염료의 성공적인 사용은 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 우리가 방법을 설명합니다 : 1) 막 염료를 갖춘 밝고 균일 재현 라벨 - ING 획득, 2) fluorochromes 및 데이터 수집 조건을 선택을하고, 3) 염료 희석에 따라 세포 증식을 수량화 할 수있는 모델을 선택.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

이 프로토콜은 시판되는 DNA 젤 얼룩이 있는 미토콘드리아 핵종의 특정 라벨링, 초고해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)에 의한 라이브 라벨링 세포의 타임랩스 시리즈 획득, 핵운동의 자동 추적을 설명합니다.

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

중요한 형광 염료는 현대 곰팡이 세포 생물학에 있는 살아있는 세포 화상 진찰 분석을 위한 필수적인 공구입니다. 이 논문은 필라멘트 균류에서 플라즈마 막 역학, 내분비 / 외신 세포증 및 세포 벽 형태 형성을 추적하기위한 확립되고 덜 알려진 형광 염료의 응용 프로그램에 대해 자세히 설명합니다.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

배우세요 세포 표면 단백질의 선택적 형광 라벨링 방법을 CyDye DIGE 기술과 2차원 전기영동을 활용하여. 이 프로토콜은 분획 없이 저발현 단백질을 풍부하게 검출하여 세포 신호전달 및 질병 연구에 활용됩니다.

CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

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