Name: 유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: 학습하세요 유방암 세포주 MCF-7에서 세포 증식 분석을 위한 세 가지 방법을 비교하는 프로토콜입니다. 전통적인 세포 계수, 발광 기반 세포 생존율 측정, 세포 이미저를 활용한 계수법의 장단점을 파악하여 연구에 적합한 방법을 선택할 수 있습니다.

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transduction MCF-7-LeGO 세포주 개발에 도움을 주신 Hamish Campbell 박사와 Antony Braithwaite 교수님께 감사드립니다. Hunter Medical Research Institute를 통해 Bloomfield Group Foundation의 자금 지원에 감사드립니다. BCM은 뉴캐슬 대학교(University of Newcastle)의 APA 장학금과 헌터 의학 연구소(Hunter Medical Research Institute)의 MM 소여 장학금(MM Sawyer Scholarship)의 지원을 받습니다.

대량 살상 무기 확산 시험 법 1. 준비 세포 주 : 각각의 방법은 분석 될 수 있도록 동일한 포맷에 동일하게 종자의 두 세포주를 준비한다. <ol><li> 사용 T에 MCF-7 레고 및 MCF-7 Δ40p53 75 ㎠로 조직 배양 플라스크 75-80% 합류 7 세포 성장 페놀 레드없는 10 % 소 태아 혈청으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) (FBS) 200 mM의 L- 글루타민, 2 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 % CO 2, 37 ℃에서 1 μg의 / ml의 퓨로 마이신. 멸균 바이오 안전성 캐비닛 클래스 II의 셀을 처리합니다. 참고 : 합류로 세포를 성장하는 데 걸리는 시간은 시드 희석에 따라 변한다. 확산 분석을위한 세포를 도금에 대비, 1에서 세포를 시드 : 보충 DMEM 3 희석 및 75~80%의 자랄 때까지 3 일 동안 정상적인 성장 조건에서 유지한다. </li><li> 에 미디어를 붓고, 플라스크에서 세포를 제거하려면폐기물 용기. 즉시 예열 배 트립신 2 ㎖의 세포 층을 세척한다. 기음 트립신. 5 % CO 2, 37 ℃에서 5 분 동안 항온 세포층과 장소에 미리 가온 된 트립신의 또이 용액을 추가한다. <ol><li> 세포가 분리되면, 신선한 DMEM을 보충 따뜻해진 10 ml의 세포를 씻는다. RT에서 5 분 동안 491 XG에 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 조심스럽게 기음과 뜨는 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 신선한 보충 된 DMEM 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 96- 웰 플레이트에서 세포를 배정하는 정확한 농도를 결정하기 위해 셀 카운트를 수행한다. <ol><li> 900 ㎕의 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 세포 현탁액 100 ㎕를 희석. 자동 세포 계수기에 새로운 60 μm의 센서를 배치합니다. 플런저를 누른 상태에서 희석 세포 현탁액에 센서를 잠수함. 천천히 셀 카운터에 플런저를 놓습니다. 셀 COU에서 센서를 제거nter 완료 할 때. 주 : 세포 수는 세포 / ml의 세포 카운터에 표시된다. </li></ol></li><li> 20 % 컨 플루 ~에서 96 웰 플레이트 (DMEM)에서 100 μL의 최종 부피에서 종자 세포 3~5일 (표 1 참조)를 통해 증식 세포 증식 측정을위한 공간을 허용한다. 세중의 모든 세포 라인을 시드. 주 :이 실험을 위해, 세 가지 세포 밀도는 최적의 세포 밀도를 결정하기 위해 평가 하였다. 필요한 세포 수는 표 1에 요약되어있다. 종자 세포를 낮은 밀도보다 장기 성장의 측정이 필요한 경우. <ol><li> 혈구 및 발광 기반 분석의 경우 (즉, 분석 당 4 판) 시점 당 한 판을 준비합니다. 셀 메이져 분석의 경우, 실험 지속 기간 동안 하나의 플레이트를 준비한다. </li></ol></li><li> 24 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li></ol> 2. 결정 세포는 우리를 카운트혈구를 보내고 <ol><li> 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C까지 사전 따뜻한 두 매체와 트립신, 오븐 또는 물 목욕. 폐기물 용기에 세포를 대기음 매체는 2 배 트립신 30 μl를 한 번 세척하고, 트립신을 대기음. </li><li> 배 트립신 30 μl를 다시 세포를 씻으, 37 ° C에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 판에서 셀을 제거하기 위해 판의 가장자리를 누릅니다. 보충 된 DMEM 50 μl를 첨가하고 세포를 단일 세포 현탁액을 형성 할 때까지 피펫 팅하여 세포를 혼합한다. </li><li> 70 % 에탄올로 표면과 유리 커버를 청소하여 혈구를 준비합니다. </li><li> 계산 챔버 위에 유리 커버 슬립을 놓고 &#39;뉴턴의 굴절 반지&#39;커버 슬립의 가장자리와 혈구 사이에 볼 수있을 때까지 부착합니다. 참고 :이 커버 슬립 올바르게 혈구에 부착 된 것을 나타냅니다. </li><li> 부드럽게 모세관 운동에 의해 카운팅 챔버를 채우고, 커버 슬립에 따라 세포 현탁액 20 μL 피펫.현미경의 10 배 배율에서 혈구를 놓고 그리드 레이아웃 계산 실을 시각화. </li><li> 그리드 레이아웃의 4 바깥 쪽 사각형의 세포를 계산합니다. 정확성을 개선하기 위해 추가로 외부 사각형의 반복 계산이 필요하거나 수까지 70에 도달하면 - 100 세포 14, 15입니다. <ol><li> 다음과 같이 ml의 당 세포 농도를 계산 : 사각형의 X 희석 계수 당 평균 세포 수를 (사용 된 경우) 10 (4) X </li></ol></li><li> 반복 2.1-2.8 매 24 시간 96 시간 동안 후 파종 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 발광 기반 분석법을 이용하여 세포 증식을 결정 참고 :이 엔드 포인트의 측정이다. 시약을 세포에 첨가하면, 플레이트 번만 정량화 할 수있다. <ol><li> 30 분 동안 22 ℃로 물을 욕조에 해동 발광 시약. </li><li> 부드럽게 균질 혼합물을 얻기 위해 병을 반전시킴으로써 시약을 혼합한다. </li><li> 단계에서 (시드 세포의 한 판 평형1.5)을 실온에서 30 분 동안. </li><li> 각 웰에 발광 시약 100 μl를 추가합니다. 2 분 동안 궤도 통에 내용을 섞는다. 플레이트는 실온에서 10 분 동안 배양 할 수 있습니다. </li><li> 다중 모드 플레이트 판독기 소프트웨어를 사용하여 발광 실험 설정. <ol><li> 멀티 모드 플레이트 리더를 켜고 소프트웨어를 엽니 다. &#39;작업 관리자&#39;에서 &#39;실험&#39;을 선택하고 파일 &#39;new&#39;.Select 만드는&#39;측 도구 모음에서, 그리고 아래의 &#39;프로토콜 절차&#39;를 &#39;탭을 선택&#39;. </li><li> 선택 &#39;Grenier의 96 평평한 바닥&#39;플레이트 유형 및 &#39;사용 뚜껑&#39;확인란을 선택합니다. &#39;읽는 방법&#39;상자에서 &#39;읽기&#39;작업을 선택합니다. &#39;발광&#39;검출 방법을 선택합니다. &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> 읽기 단계 상자에서 &#39;전체 판&#39;탭에서 스캔 할 수있는 우물을 선택하고 빈 우물을 행동 우물을 선택합니다. </li><li> (: 구멍, 거울 : 없음 예를 들어, 플러그, 엠) 빈 필터 설정 필터를 설정합니다. 에 게인을 설정135 웰 당 0.5 초 적분 시간과 6.5 mm의 높이를 판독. 발광 읽기 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 발광 읽기를 수행 <ol><li> &#39;기기 제어&#39;탭을 선택하여 플레이트 홀더를 꺼내와 &#39;뚜껑을 보장하는 것은 켜져 판 홀더에 96 웰 플레이트를 out&#39;.Place 판을 클릭합니다. 아래 &#39;기기 제어&#39;탭 &#39;에 판&#39;을 클릭하여 판 홀더를 닫습니다. 발광 읽기를 수행하기 위해 도구 모음에서 &#39;지금 읽기&#39;를 클릭합니다. </li><li> 또한 추가 분석을 위해 스프레드 시트에 각각의 상대 발광 장치 (RLU) 측정을 보냅니다. </li></ol></li><li> 반복 세포를 파종 한 후 증식에게 96 시간에 매일 24 시간 최대를 기록 할 3.1-3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 셀 이미 저를 사용하여 세포 수를 결정 <ol><li> 다중 모드 셀 메이져 소프트웨어를 사용하여 세포 이미징 실험 설정 <ol><li> 멀티 모드 셀 이미 저와 오픈 일을 켭니다전자 소프트웨어. </li><li> &#39;작업 관리자&#39;에서 &#39;실험&#39;탭을 선택하고 &#39;도구 모음에서 클릭&#39;파일 &#39;new&#39;.On에게 만들기&#39;프로토콜 &#39;탭을 열고&#39;절차 &#39;tab.Select&#39;설정 온도 &#39;조치를. &#39;에&#39;에 인큐베이터를 설정하고 37 ° C로 온도를 설정하고 다음 단계 &#39;상자를 계속하기 전에&#39;예열 &#39;확인합니다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> &#39;읽기&#39;작업을 선택합니다. &#39;이미지&#39;검출 방법을 클릭하여 &#39;엔드 포인트 / 운동&#39;읽기 유형과 &#39;필터&#39;광학 유형을 선택합니다. 접시에 전체 판 &#39;탭&#39;에 OK&#39;.Click &#39;를 클릭하고 우물 군데한다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> &#39;목표&#39;옵션 드롭 다운에서 2.5 배의 목표를 선택합니다. GFP 469, 525 및 밝은 필드 &#39;채널&#39;탭에서 두 개의 채널을 선택합니다. 두 채널 모두를위한 &#39;자동&#39;노출을 확인하고 잘 자동 노출을 선택합니다. </li><li> AUT을 확인하려면오 포커스 설정이 &#39;자동 초점&#39;을 선택하고 &#39;옵션&#39;을 클릭합니다. 자동 초점 옵션의 경우, &#39;다음 자동 초점을 스캔하고&#39;방법을 선택합니다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> 설정 수평 및 수평 간격 (μm의) = 2881 및 수직 간격 (μm의) = 2127으로, 3 × 2 몽타주에 잘 당 여러 이미지를 스캔 0.Select하는 것이 아니라 (μm의)의 중심에서 수직 오프셋. 프로 시저 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. 참고 : 읽기 매개 변수에 대한 표 2를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 선정 된 플레이트에 대한 읽기 실험을 수행 <ol><li> 뚜껑을 보장하는 것은 켜져의 &#39;장비 제어&#39;탭을 클릭하고 &#39;밖으로 판&#39;function.Place에게 판 홀더 96 웰 플레이트를 선택합니다. &#39;기기 제어&#39;탭에서 함수 &#39;에서 판&#39;를 선택합니다. 선택 판 탭에서 &#39;지금 읽기&#39;. 96 시간의 후 파종 할 때마다 24 시간까지를 읽어 반복합니다. </li></ol></li><li> 를 사용하여 세포 수의 분석셀 이미 저 소프트웨어. <ol><li> 이미지를 분석하기 위해, 이미지화 된 판의 &#39;데이터&#39;탭을 클릭, 선택 &#39;사진 [GFP 469, 525 + 밝은 필드]. 잘 군데 온 두 번 클릭합니다. </li><li> 로드 이미지를 클릭하십시오. 선택 &#39;분석&#39;과 몽타주의 단일 이미지 분석을 선택합니다. GFP &#39;를 OK&#39;.Check&#39;클릭 &#39;만 채널 및 표 3에 설명 된대로 설정 매개 변수를. 클릭&#39;이미징 세포 매개 변수를 적용 START &#39;를. </li><li> 이미지 당 세포 수를 결정하는 데 사용되는 이미징 셀 위에 위치하는 셀 카운팅 마스크를 관찰한다. 클릭 실험을하는 동안 몇 군데 각 플레이트에 대해이 설정을 &#39;변경 사항을 적용&#39;을 유지한다. </li><li> 일단 다시 이미지화 된 판에, 다운 메뉴에서 &#39;데이터&#39;메뉴를 클릭하고 &#39;세포 수&#39;를 선택합니다. 이것은 물론 당 전체 세포 수를 생성합니다. </li><li> 추가 분석 O를위한 &#39;수출&#39;탭을 클릭하여 스프레드 시트에있는 모든 데이터를 내보내기웰 당 세포 수 (F). </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜에서 배양 된 세포에서 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 조사 하였다. 각 방법은 96 시간 동안 세포 증식 재현하고 정확한 측정을 할 수 있었고, 그 결과 (도 2 및 3) ​​실험 방법 각간에 비교 하였다. 발광 기반 분석법 및 세포 영상 법은 모두 96 시간 후 세포 증식의 선형 증가를 나타내는 가장 강력한 결과를 생성 (도 2b, c). 또한, 시간이 지남에 따라 셀 이미징 형질 도입 및 비 - 형질 도입 된 세포주 (도 4) 사이의 성장 속도에 큰 차이를 도시하지 않는다. 이 많은 장점과 단점은,이 프로토콜에서 검사 각 방법위한 요약 표 5 참조. 혈구를 사용하는 종래의 전지의 계산 방법은 매우 적은 또는 부가적인 시약을 필요 effo 저비용 방법실온 준비하고 실행합니다. 또한,이 방법은 세포 / ㎖ <...

종양 억제 유전자는 p53의는 세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 한 포함한 세포 프로세스의 개수의 필수 레귤레이터이다. 이는 게놈 안정성을 유지할 책임이 있으며, 따라서, 세포 사멸 및 세포 성장의 균형을 유지하는데 중요하다. p53의 돌연변이 암에서 흔히 조절되지 않은 암 세포 증식이 선도 p53의 불 활성화의 주요 원인이다. 흥미롭게도, p53의 돌연변이는 다른 메커니즘은 p53의 기능의 손실에 대해 책임이 있음을 시사 유방암 3의 약 25 %를 차지한다. 최근에 발견 된 p53의 이성체는 인간 암의 다수의 과발현되는 것으로 도시되어 있고, p53의 기능 4,5-를 변조 할 수있다. 우리는 p53의 이성체, Δ40p53는 유방암에서 가장 높은 발현 이성체가 있음을 이전에 도시 한 통상 인접 담배 마는에 비해 상당히 유방암 세포에서 상향 조절된다UE (6). 이것에 따라, 우리는 안정적 레고 IG2 - 순수하지 않아 + 벡터 (GFP의 +)를 이용하여 7 Δ40p53 과발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7 형질. 이들 세포는 높은 Δ40p53 식​​ 유방암 세포에서 세포의 증식 속도가 증가하면 조사 하였다. 시험관 8,9 배양 세포의 세포 증식을 측정하는 다수의 직접 및 간접 방법이있다. 이러한 시간에 따른 연속 측정 또는 종점 분석법 10 중 수행 될 수있다. 기존의 방법은 혈구를 사용하여 세포 계수로, 여전히 유용하다. 이 분석은 낮은 비용과 셀 번호 직접 측정이지만, 계산에서 오류가 큰 표준 편차를 최소화하기 위해 큰 세포 수 및 숙련 된 훈련에 의존 않는다. 고 스루풋 포맷과 호환 측정을 수행 할 필요가 멀티 웰 플레이트 검정의 개발을 유도 하였다. 이 발광 기반 분석은 measu셀 (11, 12)의 대사 활동에 비례하는 발광 신호에 기초하여 세포 수를 재. 최근에, 고 함량의 이미징 플랫폼의 도입 양적 및 질적 표현형 데이터 수집을 제공하는 동안 세포 증식을 모니터링 할 수있는 새로운 도구시키고, 시스템 (13)의 다양한 종류를 포함하고있다. 이들 방법은 모두 연속적인 측정 또는 종점 분석법에 의해 하나, 세포의 성장을 측정하는 길을 제공하며, 각 따라 적절하게 칭량 할 수 모두 감도에 관해서, 시료 번호의 처리량 및 셀 정보 장단점 범위를 가지고 연구 질문에. 이 프로토콜은 감도, 재현성 및 멀티 웰 플레이트 포맷의 다른 범위를 이용하여 각 방법으로 시험관 내에서 세포 증식을 측정하기위한 세 가지 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 혈구 계수 차의 사용과 비교 대상mber 96 시간의 시간 과정을 통해 세포 증식의 측정에 기반 발광 세포 생존력 분석법 및 세포 이미 저. 이를 위해, 벡터 - 형질 도입 된 세포 (MCF-7 LEGO)의 성장은 세 가지 세포 밀도를 사용 Δ40p53 (MCF-7 Δ40p53)를 과발현하는 형질 도입 된 세포와 비교 하​​였다. 세포 증식은 최대 96 시간 동안 매 24 시간을 측정 하였다. 각 방법은 자체의 장점 및 단점을 갖는 것으로, 상기 실험의 목적에 따라 각 여전히 증식 속도에 대한 정보를 제공하기위한 유용한 방법 하였다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle Medium, 페놀-레드 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>10% FBS, 200 mM L-글루타민, 2 &micro 보충; g/ml 인슐린 및 1 &micro; g/ml 퓨로마이신</td></tr><tr><td>L-글루타민 용액(100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 용액 인간</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>퓨로마이신 디하이드로클로</td><td>라이드 Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 트립신-EDTA 용액(10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td>에 2배로 희석 (1x)<td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크, 75 cm2 growth area</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Automated cell counter</td></tr><tr><td>96 well multiwell plate, 평평한 바닥</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Improved Neubauer 혈구계</td><td>BOECO 독일</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 분석</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>발광 기반 분석</td></tr><tr><td>Cytation 3 세포 이미징 다중 모드 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td>플레이트 리더 발광, 형광 및 명시야 세포 이미징</td></tr><tr><td>Gen5 데이터 분석 소프트웨어</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

측정 셀 증식은 다양한 수준의 감도, 재현성 및 고처리량 포맷과의 호환성을 가진 다양한 방법으로 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기존의 혈구계 계수 챔버, 생존 가능한 세포의 대사 활동 변화를 상대적인 세포 수의 척도로 활용하는 발광 기반 분석, 계수 알고리즘을 사용하여 세포 수를 측정하는 다중 모드 세포 이미저를 포함하여 체외에서 세포 증식을 측정하기 위한 세 가지 방법의 사용을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용 및 높은 처리량 호환성을 포함하여 세포 증식 측정에 대한 고유한 장점과 단점을 제시합니다. 이 프로토콜은 각 방법이 시간 경과에 따른 세포 증식을 정확하게 측정할 수 있으며 서로 다른 세포 밀도에서 성장을 감지하는 데 민감하다는 것을 보여줍니다. 또한 세포 영상 장치를 사용한 세포 증식을 측정하면 형태, 합류점과 같은 추가 정보를 제공할 수 있었고 시간 경과에 따른 세포 증식을 지속적으로 모니터링할 수 있었습니다. 결론적으로, 각 방법은 세포 증식을 측정할 수 있지만 선택한 방법은 사용자에 따라 다릅니다.

배양 된 세포의 증식 - Δ40p53 MCF-7 세포를 형질 도입의 세포 증식을 측정하는 다른 방법을 연구하는 비 형질 MCF-7 레고 유방암 세포주와 비교 하​​였다. 비교 된 세 가지 방법 - 도식에 설명 된 분석 - 종래 방법 혈구 세포 생존력 발광 분석법 및 세포 이미징 (도 1). 각 방법의 장점은 정확하게 시간이 지남에 따라 셀 계수를 측정하는 단점을 가지고 있으며, 가장 효과적인 방법은 실험의 끝점 요구 및 세포 집단에 대해 획득 될 수있는 정보에 의존한다. MCF-7 및 MCF-레고 -7- Δ40p53 세포의 성장은 4 일 동안 24 시간 후에 측정 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 두 개의 세포주는 세 가지 세포 밀도 (1.5 × 103로 접종 하였다 </s&...

이 프로토콜은 유방암 세포주에서 세포 증식을 분석하기 위한 세 가지 다른 방법의 사용을 설명합니다. 여기에는 기존 세포 계수, 발광 기반 세포 생존율 및 세포 이미저 사용을 통한 세포 계수의 사용이 포함됩니다. 각각은 세포 증식의 재현 가능한 측정에 이점을 제공합니다.

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

본 시연의 전반적인 목표는 세 가지 서로 다른 세포 증식 분석법을 비교하고 각 방법의 장단점을 제시하는 것입니다. 이 방법은 가장 적절한 세포 증식 분석법의 선택과 같이 암 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 이미저(cell imager) 단계는 습득하기 어렵기 때문에 본 방법의 준비 과정이 매우 중요합니다.적절한 세포 계수 마스크를 적용하기 전에 세포에 초점을 맞춰야 합니다. 이 절차를 시작하려면, phenol red-free DMEM을 사용하여 T75 square centimeter 조직 배양 플라스크에서 두 개의 MCF-7 세포주를 75~80% 합류도(confluence)까지 3일 동안 배양하십시오. 3일 후, 배지를 폐기물 용기에 따라내어 플라스크에서 세포를 제거하십시오.그다음, 즉시 미리 데워둔 2배 농도 트립신 2 mL로 세포층을 세척합니다. 트립신을 흡입하여 제거하고, 미리 데워둔 트립신 2 mL를 세포층에 추가로 넣은 후 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 탈착되면, 데워진 신선한 보충 DMEM 10 mL로 세포를 세척합니다.그 다음, 세포 현탁액을 멸균된 15 milliliter 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 5분 후, 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그 후, 세포 펠렛을 5 milliliter의 신선한 보충 DMEM에 다시 현탁합니다.세포 수를 측정하기 위해, 100 µL의 세포 현탁액을 900 µL의 1× DPBS에 희석합니다. 그런 다음, 새로운 60 µm 센서를 자동 세포 계수기에 장착합니다. 플런저를 누른 상태에서 센서를 희석된 세포 현탁액에 담급니다.세포 계수기의 플런저를 천천히 놓습니다. 그 다음, 작업이 완료되면 세포 계수기에서 센서를 제거합니다. 세포 성장 공간을 확보하고 3~5일 동안의 증식을 측정할 수 있도록, 96-웰 플레이트에 최종 부피 100 microliters로 세포를 약 20% confluency가 되도록 분주합니다.헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하려면, 세포 배양 인큐베이터, 오븐 또는 항온수조에서 배지와 트립신을 모두 37 °C로 미리 데웁니다. 그다음, 세포로부터 배지를 흡입하여 폐기물 용기에 버립니다. 이어서 2배 농도 트립신 30 µL로 한 번 세척한 후, 배지를 다시 흡입하여 폐기물 용기에 버립니다.다음으로, 2배 농도의 trypsin 30 µL로 세포를 다시 세척하고, 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 플레이트 가장자리를 가볍게 쳐서 세포를 떼어냅니다. 그 후, 보충제가 첨가된 DMEM 50 µL를 넣고 파이펫팅하여 단일 세포 현탁액이 형성될 때까지 세포를 혼합합니다.카운팅 챔버 위에 유리 커버 슬립을 덮고, 커버 슬립 가장자리와 헬로사이토미터(helocytometer) 사이에 뉴턴 굴절 링(Newton's refraction rings)이 보일 때까지 고정합니다. 그다음, 커버 슬립 아래에 세포 현탁액 20 µL를 조심스럽게 피펫팅하여 모세관 현상에 의해 카운팅 챔버가 채워지도록 합니다. 이어서 10배 배율 하에서 그리드 레이아웃의 카운팅 챔버를 관찰합니다.본 절차에서는 발광 시약을 22°C 항온 수조에서 30분 동안 해동합니다. 병을 부드럽게 반전시켜 혼합물이 균질해지도록 합니다. 그 다음, 세포가 분주된 플레이트 한 개를 실온에서 30분 동안 평형화합니다.그 후, 각 웰에 100 µL의 발광 시약을 추가합니다. 오비탈 셰이커에서 2분 동안 혼합합니다. 그런 다음, 플레이트를 상온에서 10분 동안 배양합니다.멀티모드 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여 발광 실험을 설정하려면, 멀티모드 플레이트 리더의 전원을 켜고 소프트웨어를 실행합니다. 작업 관리자(Task Manager)에서 Experiments를 선택하고 Create New를 클릭합니다. 그런 다음 사이드 툴바에서 File을 선택하고, Protocol 탭 아래에서 Procedure를 선택합니다.다음으로, 플레이트 유형으로 Greiner 96 flat bottom을 선택하고 Use Lid 확인란을 체크하십시오. Read method 상자에서 Read 동작을 선택하십시오. 그런 다음, 검출 방법으로 Luminescence를 선택하고 OK를 클릭하십시오. Read Step 상자의 Full Plate 탭에서 스캔할 웰을 선택하고, 블랭크 웰로 사용할 웰을 선택하십시오.필터 세트를 Empty Filter로 설정하십시오. Gain을 135로, 웰당 적분 시간(Integration Time)을 5초로, 측정 높이(Read Height)를 6.5 millimeters로 설정하십시오. OK를 클릭하여 발광 측정 설정을 저장하십시오.발광 측정을 수행하려면 Instrument Control 탭을 선택하여 Plate Out을 클릭하고 플레이트 홀더를 배출하십시오. 뚜껑이 닫혀 있는지 확인한 후 96-well 플레이트를 플레이트 홀더 위에 놓으십시오. Instrument Control 탭에서 Plate In을 클릭하여 플레이트 홀더를 닫으십시오.그런 다음, 툴바에서 Read Now를 클릭하여 발광 측정을 수행합니다. 그 후, 각 웰의 RLU 측정값을 분석을 위해 스프레드시트로 내보냅니다. 세포 이미징 실험을 설정하려면 멀티 모드 세포 이미저의 전원을 켜고 소프트웨어를 실행합니다.작업 관리자에서 실험(Experiments) 탭을 선택하고 새로 만들기(Create New)를 클릭하십시오. 파일 툴바에서 프로토콜(Protocol) 탭을 클릭한 다음 절차(Procedure) 탭을 클릭하십시오. 온도 설정(Set Temperature) 동작을 선택하십시오.인큐베이터를 On으로 설정하고 온도를 37도로 설정하십시오. Preheat를 확인한 후, OK를 클릭하여 설정을 저장하십시오. 다음으로 Read 동작을 선택하십시오.검출 방법으로 Image를 클릭하십시오. 그런 다음 Endpoint/Kinetic 읽기 유형과 Filters 광학 유형을 선택하고 OK를 클릭하십시오. 그 후 Full Plate 탭을 클릭하고, 이미징할 플레이트의 웰들을 선택하십시오. OK를 클릭하여 설정을 저장하십시오.이제 드롭다운 Objectives 옵션에서 2.5배 대물렌즈를 선택하십시오. Channels 탭에서 GFP 469.525와 Bright Field를 선택하십시오. 두 채널 모두 Auto Exposure를 체크하고, 자동 노출 웰을 선택하십시오.자동 초점 설정을 지정하려면 Options를 클릭하십시오. 자동 초점 옵션에서 Scan 방식을 선택한 다음 auto focus를 선택하십시오. OK를 클릭하여 설정을 저장합니다.그 후, 웰 중심으로부터의 수평 및 수직 오프셋을 0으로 설정합니다. 웰당 여러 이미지를 3x2 몽타주로 스캔하도록 선택합니다. 그런 다음, OK를 클릭하여 프로시저 설정을 저장합니다.선택한 플레이트에서 실험 결과를 읽으려면, Instrument Control 탭을 클릭하고 Plate Out 기능을 선택하십시오. 덮개가 닫혀 있는지 확인한 후, 96-well 플레이트를 플레이트 홀더 위에 놓으십시오. Instrument Control 탭에서 Plate In 기능을 선택하십시오.다음으로, 플레이트 탭에서 Read Now를 선택하고, 세포 파종 후 최대 96시간까지 24시간마다 측정을 반복합니다. 이미지를 분석하려면 이미지 캡처가 완료된 플레이트의 Data 탭을 클릭하고 Picture GFP 469, 525 plus Bright Field를 선택합니다. 그런 다음, 이미지가 캡처된 웰을 더블 클릭합니다.이제 로드된 이미지를 클릭하십시오. Analyze를 선택한 다음, 분석할 몽타주의 단일 이미지를 선택하십시오. 그다음 OK를 클릭하십시오. 이후 GFP 채널만 체크하고, 표 3에 기술된 대로 파라미터를 설정하십시오.그 후, Start를 클릭하여 이미지화된 세포에 파라미터를 적용합니다. 이미지화된 세포 위에 배치된 세포 계수 마스크를 관찰하며, 이는 이미지당 세포 수를 결정하는 데 사용됩니다. Apply Changes를 클릭하고, 실험 전반에 걸쳐 이미지화되는 각 플레이트에 대해 이 설정을 유지합니다.이 그림에서는 MCF-7-LeGO 세포와 MCF-7-delta 40p53 세포의 세포 증식을 측정하기 위해 검토된 서로 다른 방법들 간의 상관 관계를 비교하기 위해 선형 회귀 분석을 수행하였습니다. 피어슨 상관 계수를 계산하였으며, 세포 증식을 측정하는 서로 다른 방법들 사이의 유의성을 결정하였습니다. 가장 강력한 상관 관계는 발광 기반 분석법과 세포 이미저의 비교에서 관찰되었습니다.여기 세포들이 거의 100% confluence에 도달할 때까지 24시간마다 세포 이미저(cell imager)를 사용하여 촬영한 GFP 양성 MCF-7-LeGO 및 MCF-7-delta 40p53 유방암 세포의 대표 이미지가 제시되어 있습니다. 이 방법은 며칠에 걸쳐 세포 성장을 시각적으로 모니터링하고, 서로 다른 세포주 간의 세포 크기와 세포 형태를 비교할 수 있는 능력을 포함하여 유용한 세포 정보를 제공합니다. 테스트한 각 방법의 장단점 요약이 여기에 제시되어 있으며, 이는 각 방법의 다각적인 활용 가능성을 보여주며 독자가 가장 적절한 방법을 선택하는 데 도움을 줄 것입니다.이 영상을 시청한 후에는 세 가지 서로 다른 세포 증식 분석법에 대해 충분히 이해하고, 자신의 실험 설계에 가장 적합한 분석법이 무엇인지 결정할 수 있을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

면역 세포 기능과 확산을 모니터하기위한 셀 추적 염료의 성공적인 사용은 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 우리가 방법을 설명합니다 : 1) 막 염료를 갖춘 밝고 균일 재현 라벨 - ING 획득, 2) fluorochromes 및 데이터 수집 조건을 선택을하고, 3) 염료 희석에 따라 세포 증식을 수량화 할 수있는 모델을 선택.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

이 비디오는 인간 뼈 조직 이식 모델 시스템에서 암세포 증식 및 집락화를 측정하기 위해 대퇴골 이식에 인접한 유방암 세포를 배양하는 방법을 설명합니다.

BC 세포 공동 배양: 암세포 증식을 연구하기 위해 뼈 조각과 함께 유방암 세포 배양

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

동물 세포 배양을 사용하여 고급 세포 및 분자 개념을 탐구하는 생물학 학부생을 위한 실현 가능한 실험실 모듈에 대해 설명합니다. 학생들은 화학 요법제에 노출되어 유방암 세포 모델을 성장, 특성화 및 조작합니다. 세포 생존율은 표준 방법과 새로운 방법을 모두 사용하여 세포 계수를 통해 분석됩니다.

핵심 생물학 개념을 가르치는 마우스 유방 종양 세포를 사용 : 간단한 랩 모듈

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

우리는 산소와 영양분을 전달하기 위해 관류 생물 반응기 시스템을 사용하여 배양할 수 있는 3D 유방암 대리모를 생성하는 방법을 시연합니다. 성장 후, 대리모는 관심 매개변수의 평가를 위해 고정되고 파라핀으로 처리됩니다. 이러한 매개 변수 중 하나 인 세포 밀도의 평가가 설명됩니다.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

이 연구는 실시간 모니터링이 가능한 3가지 시험관 내 모델을 사용하여 노화 HeLa 세포의 노화 관련 분비 표현형(SASP) 인자가 비노화 HeLa 세포에 미치는 증식 효과를 평가합니다. 암에서 세포-세포 상호작용을 더 잘 이해하기 위해 각 방법의 장점과 한계를 체계적으로 비교했습니다.

세 가지 방법론의 비교 분석을 사용하여 암세포 증식에 대한 SASP 요인의 영향 평가

학습하세요 유방암 세포주 MCF-7에서 세포 증식 분석을 위한 세 가지 방법을 비교하는 프로토콜입니다. 전통적인 세포 계수, 발광 기반 세포 생존율 측정, 세포 이미저를 활용한 계수법의 장단점을 파악하여 연구에 적합한 방법을 선택할 수 있습니다.

유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

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