유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

본 시연의 전반적인 목표는 세 가지 서로 다른 세포 증식 분석법을 비교하고 각 방법의 장단점을 제시하는 것입니다. 이 방법은 가장 적절한 세포 증식 분석법의 선택과 같이 암 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 이미저(cell imager) 단계는 습득하기 어렵기 때문에 본 방법의 준비 과정이 매우 중요합니다.

적절한 세포 계수 마스크를 적용하기 전에 세포에 초점을 맞춰야 합니다. 이 절차를 시작하려면, phenol red-free DMEM을 사용하여 T75 square centimeter 조직 배양 플라스크에서 두 개의 MCF-7 세포주를 75~80% 합류도(confluence)까지 3일 동안 배양하십시오. 3일 후, 배지를 폐기물 용기에 따라내어 플라스크에서 세포를 제거하십시오.

그다음, 즉시 미리 데워둔 2배 농도 트립신 2 mL로 세포층을 세척합니다. 트립신을 흡입하여 제거하고, 미리 데워둔 트립신 2 mL를 세포층에 추가로 넣은 후 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 탈착되면, 데워진 신선한 보충 DMEM 10 mL로 세포를 세척합니다.

그 다음, 세포 현탁액을 멸균된 15 milliliter 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 5분 후, 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그 후, 세포 펠렛을 5 milliliter의 신선한 보충 DMEM에 다시 현탁합니다.

세포 수를 측정하기 위해, 100 µL의 세포 현탁액을 900 µL의 1× DPBS에 희석합니다. 그런 다음, 새로운 60 µm 센서를 자동 세포 계수기에 장착합니다. 플런저를 누른 상태에서 센서를 희석된 세포 현탁액에 담급니다.

세포 계수기의 플런저를 천천히 놓습니다. 그 다음, 작업이 완료되면 세포 계수기에서 센서를 제거합니다. 세포 성장 공간을 확보하고 3~5일 동안의 증식을 측정할 수 있도록, 96-웰 플레이트에 최종 부피 100 microliters로 세포를 약 20% confluency가 되도록 분주합니다.

헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하려면, 세포 배양 인큐베이터, 오븐 또는 항온수조에서 배지와 트립신을 모두 37 °C로 미리 데웁니다. 그다음, 세포로부터 배지를 흡입하여 폐기물 용기에 버립니다. 이어서 2배 농도 트립신 30 µL로 한 번 세척한 후, 배지를 다시 흡입하여 폐기물 용기에 버립니다.

다음으로, 2배 농도의 trypsin 30 µL로 세포를 다시 세척하고, 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 플레이트 가장자리를 가볍게 쳐서 세포를 떼어냅니다. 그 후, 보충제가 첨가된 DMEM 50 µL를 넣고 파이펫팅하여 단일 세포 현탁액이 형성될 때까지 세포를 혼합합니다.

카운팅 챔버 위에 유리 커버 슬립을 덮고, 커버 슬립 가장자리와 헬로사이토미터(helocytometer) 사이에 뉴턴 굴절 링(Newton's refraction rings)이 보일 때까지 고정합니다. 그다음, 커버 슬립 아래에 세포 현탁액 20 µL를 조심스럽게 피펫팅하여 모세관 현상에 의해 카운팅 챔버가 채워지도록 합니다. 이어서 10배 배율 하에서 그리드 레이아웃의 카운팅 챔버를 관찰합니다.

본 절차에서는 발광 시약을 22°C 항온 수조에서 30분 동안 해동합니다. 병을 부드럽게 반전시켜 혼합물이 균질해지도록 합니다. 그 다음, 세포가 분주된 플레이트 한 개를 실온에서 30분 동안 평형화합니다.

그 후, 각 웰에 100 µL의 발광 시약을 추가합니다. 오비탈 셰이커에서 2분 동안 혼합합니다. 그런 다음, 플레이트를 상온에서 10분 동안 배양합니다.

멀티모드 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여 발광 실험을 설정하려면, 멀티모드 플레이트 리더의 전원을 켜고 소프트웨어를 실행합니다. 작업 관리자(Task Manager)에서 Experiments를 선택하고 Create New를 클릭합니다. 그런 다음 사이드 툴바에서 File을 선택하고, Protocol 탭 아래에서 Procedure를 선택합니다.

다음으로, 플레이트 유형으로 Greiner 96 flat bottom을 선택하고 Use Lid 확인란을 체크하십시오. Read method 상자에서 Read 동작을 선택하십시오. 그런 다음, 검출 방법으로 Luminescence를 선택하고 OK를 클릭하십시오. Read Step 상자의 Full Plate 탭에서 스캔할 웰을 선택하고, 블랭크 웰로 사용할 웰을 선택하십시오.

필터 세트를 Empty Filter로 설정하십시오. Gain을 135로, 웰당 적분 시간(Integration Time)을 5초로, 측정 높이(Read Height)를 6.5 millimeters로 설정하십시오. OK를 클릭하여 발광 측정 설정을 저장하십시오.

발광 측정을 수행하려면 Instrument Control 탭을 선택하여 Plate Out을 클릭하고 플레이트 홀더를 배출하십시오. 뚜껑이 닫혀 있는지 확인한 후 96-well 플레이트를 플레이트 홀더 위에 놓으십시오. Instrument Control 탭에서 Plate In을 클릭하여 플레이트 홀더를 닫으십시오.

그런 다음, 툴바에서 Read Now를 클릭하여 발광 측정을 수행합니다. 그 후, 각 웰의 RLU 측정값을 분석을 위해 스프레드시트로 내보냅니다. 세포 이미징 실험을 설정하려면 멀티 모드 세포 이미저의 전원을 켜고 소프트웨어를 실행합니다.

작업 관리자에서 실험(Experiments) 탭을 선택하고 새로 만들기(Create New)를 클릭하십시오. 파일 툴바에서 프로토콜(Protocol) 탭을 클릭한 다음 절차(Procedure) 탭을 클릭하십시오. 온도 설정(Set Temperature) 동작을 선택하십시오.

인큐베이터를 On으로 설정하고 온도를 37도로 설정하십시오. Preheat를 확인한 후, OK를 클릭하여 설정을 저장하십시오. 다음으로 Read 동작을 선택하십시오.

검출 방법으로 Image를 클릭하십시오. 그런 다음 Endpoint/Kinetic 읽기 유형과 Filters 광학 유형을 선택하고 OK를 클릭하십시오. 그 후 Full Plate 탭을 클릭하고, 이미징할 플레이트의 웰들을 선택하십시오. OK를 클릭하여 설정을 저장하십시오.

이제 드롭다운 Objectives 옵션에서 2.5배 대물렌즈를 선택하십시오. Channels 탭에서 GFP 469.525와 Bright Field를 선택하십시오. 두 채널 모두 Auto Exposure를 체크하고, 자동 노출 웰을 선택하십시오.

자동 초점 설정을 지정하려면 Options를 클릭하십시오. 자동 초점 옵션에서 Scan 방식을 선택한 다음 auto focus를 선택하십시오. OK를 클릭하여 설정을 저장합니다.

그 후, 웰 중심으로부터의 수평 및 수직 오프셋을 0으로 설정합니다. 웰당 여러 이미지를 3x2 몽타주로 스캔하도록 선택합니다. 그런 다음, OK를 클릭하여 프로시저 설정을 저장합니다.

선택한 플레이트에서 실험 결과를 읽으려면, Instrument Control 탭을 클릭하고 Plate Out 기능을 선택하십시오. 덮개가 닫혀 있는지 확인한 후, 96-well 플레이트를 플레이트 홀더 위에 놓으십시오. Instrument Control 탭에서 Plate In 기능을 선택하십시오.

다음으로, 플레이트 탭에서 Read Now를 선택하고, 세포 파종 후 최대 96시간까지 24시간마다 측정을 반복합니다. 이미지를 분석하려면 이미지 캡처가 완료된 플레이트의 Data 탭을 클릭하고 Picture GFP 469, 525 plus Bright Field를 선택합니다. 그런 다음, 이미지가 캡처된 웰을 더블 클릭합니다.

이제 로드된 이미지를 클릭하십시오. Analyze를 선택한 다음, 분석할 몽타주의 단일 이미지를 선택하십시오. 그다음 OK를 클릭하십시오. 이후 GFP 채널만 체크하고, 표 3에 기술된 대로 파라미터를 설정하십시오.

그 후, Start를 클릭하여 이미지화된 세포에 파라미터를 적용합니다. 이미지화된 세포 위에 배치된 세포 계수 마스크를 관찰하며, 이는 이미지당 세포 수를 결정하는 데 사용됩니다. Apply Changes를 클릭하고, 실험 전반에 걸쳐 이미지화되는 각 플레이트에 대해 이 설정을 유지합니다.

이 그림에서는 MCF-7-LeGO 세포와 MCF-7-delta 40p53 세포의 세포 증식을 측정하기 위해 검토된 서로 다른 방법들 간의 상관 관계를 비교하기 위해 선형 회귀 분석을 수행하였습니다. 피어슨 상관 계수를 계산하였으며, 세포 증식을 측정하는 서로 다른 방법들 사이의 유의성을 결정하였습니다. 가장 강력한 상관 관계는 발광 기반 분석법과 세포 이미저의 비교에서 관찰되었습니다.

여기 세포들이 거의 100% confluence에 도달할 때까지 24시간마다 세포 이미저(cell imager)를 사용하여 촬영한 GFP 양성 MCF-7-LeGO 및 MCF-7-delta 40p53 유방암 세포의 대표 이미지가 제시되어 있습니다. 이 방법은 며칠에 걸쳐 세포 성장을 시각적으로 모니터링하고, 서로 다른 세포주 간의 세포 크기와 세포 형태를 비교할 수 있는 능력을 포함하여 유용한 세포 정보를 제공합니다. 테스트한 각 방법의 장단점 요약이 여기에 제시되어 있으며, 이는 각 방법의 다각적인 활용 가능성을 보여주며 독자가 가장 적절한 방법을 선택하는 데 도움을 줄 것입니다.

이 영상을 시청한 후에는 세 가지 서로 다른 세포 증식 분석법에 대해 충분히 이해하고, 자신의 실험 설계에 가장 적합한 분석법이 무엇인지 결정할 수 있을 것입니다.