Name: Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: 배우세요 Xenopus 배아의 분열구 배아 세포를 분리 배양하여 세포 운명의 내재적·외재적 요인을 분석하는 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에서 유전자 발현과 세포 분화 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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저자는 모나 Herold의 지원 Paaqua를 부여하고 GWU 루터 쌀의 원정 지원 GWU 할란 휄로 십을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 MCB-1121711에 의해 지원되었다.

1. 악기, 문화 미디어와 요리 준비 <ol><li> 알루미나 연마 필름을 사용하여 네 포셉을 선명하게. 팁 크기를 모니터링 할 수있는 해부 현미경으로이 작업을 수행합니다. 포셉 중 하나 쌍은 백업 경우에는 팁이 절차를 수행하는 동안 손상된 역할을합니다. 네 개의 집게를 압력솥과 멸균 용기에 보관하십시오. </li><li> 및 필터 소독, 500 ML 0.1X와 1.0X 문화 매체의 각 (15 조리법 중 마크의 수정일 Ringers는 [MMR] 또는 수정일 바스의 식염 [MBS])가합니다. 우리는 정기적으로 MBS를 (; 1 ㎜ KCl, 0.7 MM CaCl 2, 1 MM MgSO 4, 5 밀리미터 HEPES [산도 7.8], 2.5 MM NaHCO 3 1X = 88 MM NaCl)을 사용합니다. 개월 동안 14-18 ° C에서 저장합니다. </li><li> 문화 매체 (나사 캡 유리 병에 100 ML 1X 문화 매체에 2g 전기 등급 아가로 오스)의 2 % 아가로 오스 솔루션을 확인하십시오. 아가로 오스를 해산하기 위해 압력솥. 이것은 달 동안 4 ° C에 저장하고,이 다음에 필요할 때 아가로 오스를 녹일 수있는 microwaved 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 액체이지만, 멸균 24도 문화 판의 각 우물의 바닥에 약 0.5 ML를 따르다. 이 플라스틱에 고집에서 explants를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 액체이지만, 2-3 60mm 배양 접시의 바닥에 2-3 ML을 흘려, 그리고 소용돌이 부드럽게 바닥 적용되어 있는지 확인합니다. 이러한 분해 요리로 봉사하고 세포막이 제거되면 아가로 오스는 플라스틱으로 고집에서 배아를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스는 냉각과 경화되면 불꽃은 6 &quot;파스퇴르 피펫의 팁은 공에 녹아 있으며, 가볍게 문화 판의 각 잘에있는 아가로 오스의 표면에 터치까지.이 얕은 우울증 만들어집니다로 explant가 배치됩니다. </li><li> 1X 멸균 문화 매체와 문화 판의 각 우물을 입력합니다. </li><li> 아가로 오스는 냉각과 경화되면, blastomere 분리를 촉진하기 위해 희석 문화 매체 (0.1X MMR 또는 0.1X MBS)로 분해 요리를 채 웁니다. </lI&gt; </ol> 2. 태아의 선택 <ol><li> 수정 된 알을 얻고 표준 프로토콜 15에 따라 젤리 코트를 제거합니다. 100mm 배양 접시에 0.5X 문화 매체로 전송할 수 있습니다. </li><li> 배아는 2 셀 단계에 도달하면, 첫 번째 절단의 고랑가 별도의 그릇에 동물 반구에서 가볍게 색소 영역 (그림 1)을 양분하는 사람들을 정렬합니다. 다음은 explants의 기증자 될 것입니다. explants을 시작할 수있는 단계 형제 제어 역할을 할 수있는 절차를 통해 기증 배아 옆에 별도의 접시에 나머지 2 세포 배아세요. </li></ol> 3. Explants의 작성 <ol><li> 분해 접시에 5-10 배아를 놓고 있지만, 한 번에 하나의 배아에서 작동합니다. </li><li> 투명 vitelline 막을 볼 수 있도록 최초의 배아를 배치, 그것은 배의 동물 극의 표면 위에 투명한 공간 (perivitelline 공간)로 구분합니다. 날카롭게 힘을 사용사람의 subdominant 손 (하나가 바로 전달하는 경우 왼쪽)에 PS, perivitelline 공간 위의 vitelline 멤브레인을 파악. 다른 손에 날카롭게 집게를 사용하여 첫 번째 포셉 팁에 가까운 멤브레인을 파악하고, 부드럽게 거리에 막 껍질을 벗기면에 반대 방향으로 당긴다. 대상 셀이 막 제거하는 동안 손상되​​지 않도록, 해부하는 셀에서 거리의 초기 이해하십시오. 하나는 배아가 결합한 것 때문에 멤브레인가 제거되었음을 알 수 있습니다. </li><li> subdominant 손에 포셉와 하나 이웃 셀을 잡아 해부 할 수있는 셀이 직접 접촉하지 않도록하는 &quot;핸들&quot;로 셀을 사용합니다. 다른 손에 포셉으로 부드럽게 원하는 blastomere에서 떨어져 남아있는 이웃 세포를 당긴다. 같은 운명을 공유하는 중간 선 세포, 타겟팅하는 경우, 그들은 한 쌍으로 함께 제거 할 수 있습니다. 마지막으로, &quot;핸들&quot;셀을 멀리 해부. </li><li> 살균과 blastomere (또는 blastomere 쌍), 픽업, 유리 파스퇴르 피펫, 기포 및 과도한 흡입을 피. 피펫은 세포가 손상 될 수 있습니다 날카로운 모서리를 제거 할 수 화재 연마 될 수 있지만, 우리는 정기적으로이 작업을 수행하지 않습니다. explant 문화 요리의 잘의 문화 매체의 표면 아래에있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫의 팁을 놓고, 가볍게 blastomere을 배출. 이 중력에 의해 얕은 우울증으로 밀어해야합니다. 하나 이상의 배아에서 같은 blastomere은 단일 explant로 결합 할 수 있습니다. </li><li> 분해 요리, 하나 하나에 남아있는 배아와이 절차를 반복합니다. 10 배아에 대한 후, 해부 접시는 세포 부스러기로 가득합니다. 이 문제가 발생하면, 새로운 절개 요리로 변경합니다. </li><li> 모든 dissections 완료 후 explants가 얕은 우울증에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 그들은 부드럽게 건조 70 % 에탄올과 공기 살균 된 헤어 루프와 함께 우울증에 밀려 할 수 있습니다. </li><li> 지난 해부 한 후 한 시간 정도, 파편 surrou를 제거살균, 유리 파스퇴르 피펫으로 치료 explants를 nding. </li><li> 14-20의 문화 explants의 판을 ° C 형제, 컨트롤 배아를 포함하는 페트리 접시 옆에. 형제 자매 배아는 blastomere explants의 개발 단계를 나타냅니다. </li></ol> 4. 분석을위한 수확 Explants <ol><li> 형제 자매가 원하는 발달 단계에 도달 할 때 explants를 수확. 세포의 일부가 붕괴하는 경우에도 이러한 explants 아주 잘 남아있다. 문화의 구름 덩어리가 잘있을 경우 따라서, 건강 explant가 내 매장되어 있는지 확인 할 수있는 헤어 루프 나 집게로 탐험 해보세요. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫과 문화 솔루션의 작은 볼륨에서 explants를 선택하고, 부드럽게 실시 할 수있는 분석에 적합한 정착액 또는 용해 버퍼에 넣어 배출. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

개인 blastomeres 성공적으로 배양하기위한 가장 중요한 단계는 1) 제대​​로 관심 blastomere 식별, 필요한 매뉴얼을 개발하고 4), 살균, 건강한 문화를 유지 2), 3) 세포주기의 정확한 부분에서 박리 세포를 해부하는 동안 손상을 방지하고 잘 문화에 전송하는 민첩성. 특정 blastomeres를 조작하려면, 그것은 추기경의 축을 식별 할 수 있도록 필수적입니다. Xenopus의 배아에서 등쪽의 측면은 세 가지 방법으로 식별 할 수 있습니다 (2) 팁의 체외 계란은 수정 된 한 쪽 18, 19를 표시 (1) 중요한 염료 18, 19로 정자 진입 지점을 표시하거나 (3) 첫 번째 절단의 고랑은 동물 반구 20, 21에 가볍게 색소 지역을 양분하는 2 세포 단계에서 배아를 선택합니다. 우리는 정확하게 자연스럽게 - fertiliz에서 b​​lastomeres를 식별 할 수...

Xenopus laevis의 배아들은 달걀 microsurgical 접근 방식을 허용 할 수있을만큼 크기 때문에 배아 세포가 특정 운명을 취득하는하여 메커니즘을 식별 할 수 광범위하게 활용되었습니다. 각 셀은 고유 에너지 저장소를 제공 난황의 혈소판의 풍부한 세포 공급을 포함되어 있기 때문에 또한, 그들은 문화 매체의 영양 보완 필요없이 외부 개발할 수 있습니다. 1, 2, 3, 4, 5, 6 - 세포의 운명이 결정되는이 메커니즘을 연구하는 중요한 자산이 (32 세포 단계를 통해 2) 절단 단계의 blastomeres의 운명지도의 종합 세트입니다. 이지도는 하나의 식별 blastomere으로 감지 분자를 microinjecting와 조직이 표시 자손에 의해 채워하는 후 개발의 모니터링에 의해 구축되었다. 배아의 추기경 축 안정적으로 많은 엠브리에서 확인 할 수 있기 때문에 일관성있는 운명의지도는 가능합니다OS. 식물 반구이 아닌 반면, 첫째, 모든 야생를 입력 배아에 동물 반구는 색소입니다. 둘째, 기름지게에서 정자의 항목은 미래 복부 편으로 동물 반구의 착색의 수축을 초래, 많은 배아에 착색 차이 따라서 등쪽과 복부 측면 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 셋째, 첫 번째 절단의 고랑 따라서 중간 시상 대부분의 배아에서 비행기, 그리고는 배의 오른쪽과 왼쪽 측면을 식별하는 데 사용할 수 있습니다 대략. 운명의지도는 자연스럽게 태아의 큰 인구에서 각 blastomere는 식별 할 일반 패턴에 알이 자주 다니엘 수정 된 사실에 의존하고 있습니다. 설명 내의 선택 절차를 사용하여 착색 및 절단 패턴에 대한 알 클러치 사이에 다양성이있는 반면 여기에서 소정의 운명과 셀이 90 %의 정확도로 식별 할 수 있습니다. 세포 운명은 방지 할 수 있습니다여러 메커니즘에 의해 embryogenesis 동안 채굴. 이러한 differentially 상속 세포질 mRNAs이나 단백질 등의 고유 요소는, 초기 패턴의 여러 측면에 기여합니다. 예를 들어, 특정 산모 mRNAs는 세포, 세균 라인에 기여 endoderm가, 또는 등쪽 몸 축 (7 검토)에 기여를 결정합니다. 태아의 신호 센터에서 더 많은 먼 이웃 셀이나이 지역에서 제공하는 외부 요인이 특정 조직 유형과 패턴 거의 모든 기관이 시스템을 유도 할 책임이 있습니다. 신호 센터의 예는 신경 외배엽 및 패턴 중배엽을 유도 gastrula의 주최자 / 노드 및 활동을 편광의 영역을 포함 사지 꽃 봉오리의 패턴 앞 - 뒤 축이. 운명의지도 다른 기관의 전구체를 확인하고 정상 배아에서 자신의 자손에 의해 촬영 발달 경로를 보여 있지만, 그들은 고유 구별 할 수 없습니다그리고 그 세포에 외부 영향을 미친다. 또한 자손 배의 복잡한 신호 환경에서 차별화 셀의 전체 발달 가능성을 공개하지 않습니다. 에 문화 다음 배아에서 세포의 제거 또는 2) 소설의 배아의 위치 1) 세포의 이식을 : 두 실험 방법은 셀의 운명은 고유 요인에 의해 결정됩니다 또는 이후 외부 요인에 의해 영향을 여부를 테스트 할 수 있습니다 외인성 신호의 부재. 세포가 수동으로 분리 될만큼 크기 때문에 두 실험 방법이 Xenopus에 가능했습니다. 예를 들어, 다수의 연구 (7 검토, 8, 9) 운명의 변화를 테스트하기 위해 호스트 배아의 소설 위치에 배아 (세포 세포 상호 작용을 변경하려면) 또는 이식 세포에서 단일 세포를 삭제했습니다. 또한, 배의 다른 지역에서 세포의 작은 번호를 explanting의 두 번째 접근법 전Xenopus의 배아의 세포가 세포 내 영양소 저장, 난황의 혈소판으로 가득하기 때문에 외인성 요인의 부재에 유도 조직 상호 작용을 명료하게하다하는 n 인물 문화이 가능합니다. 따라서, 그들은 문화 매체의 영양이나 성장 인자 보완없이 정의 된 소금 매체에서 몇 일 동안 배양 할 수 있습니다. 우리는 등쪽 동물 blastomeres가 maternally 상속 mRNAs 10, 11로 인해 신경과 등쪽 mesodermal 조직을 생성 할 수있는 자율적 인 능력을 가지고 있으며, 다른 32 셀 blastomeres의 중배엽 사양이 고유 및 외부 정보를 12 두에 의존했다 표시하려면이 방법을 사용했습니다 . explants 등의 배양 세포의 장점은 중간도 explanted 셀 12, 13, 14의 운명에 영향을 미칠 수있는 휴대 전화 통신 경로를 결정하기 위해 정의 된 신호 요소를 보완 할 수 있다는 것입니다. 또한, 하나는 blastomere 홍보를 삽입 할 수 있습니다내생 mRNAs의 번역을 방지하기 위해 오버 명시 적 유전자, 또는 안티 센스 oligonucleotides와에 mRNA와 문화 ior. 이, 이득과 손실 기능 분석은 분자가 자율적으로 표현 운명에 필요한되는 식별 할 수 있습니다. explant의 운명을 분석하려면 특정 세포 유형의 식별은 표준 유전자 발현 (예를 들어, 현장 하이브리드 화에 RT-PCR)과 immunocytochemical assays에 의해 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 배아 세포는 특정 조직에 개발 방법을 규제 고유 및 외부 메커니즘을 구별 할 수있는 간단하면서도 강력한 방법을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-38 </td><td> 포셉 팁의 주요 수리 과정 (12 μm), </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-46 </td><td> 포셉 도움말을 선명하게 잘 대해 보통 (3 μm) </td></tr><tr><td> 알루미나 연마 필름 </td><td> 토마스 과학 </td><td> # 6775E-54 </td><td> 포셉 도움말 연마를위한 고급 (0.3 μm) </td></tr><tr><td> 집게 : 뒤몽, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> # 11252-30 </td><td> 이 처음 구입했을 때 선명하게 필요하지 않는 좋은 방법이 있습니다. 부식 방지가 할 수 있도록autoclaved합니다. </td></tr><tr><td> Gentamicin 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> G1397 </td><td> 사용과 같은 날에 중간에 추가 </td></tr></tbody></table>

blastomere explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

배의 세포를 모두 추적 계보 (Lineage)로 구성 운명의지도는 조직이 배의 각 셀에서 내려 어떤 알 수있다. 운명의지도 기관의 전구체를 식별와 후손 세포가 정상적인 배아에서 해당 기관을 채우는 것들로부터 발달 경로를 elucidating 매우 유용하지만, 그들은 전구체 세포의 전체 발달 가능성을 설명하거나 메커니즘을 식별되지 않는로 운명이 결정됩니다. 세포 운명의 노력에 대해 테스트하려면, 하나는 실험 조작 한 후 표현들과 함께 그대로 배아 (운명의지도)에 자손의 세포의 일반적인 레퍼토리를 비교합니다. 세포의 운명은 주변 세포 환경에 관계없이 (커밋) 고정, 또는 이웃에 의해 제공 외부 요인에 의해 그 영향을 받는가? Xenopus의 배아의 종합 운명지도를 사용하여, 우리는 확인하는 방법에 대해 설명합니다, 격리 및 문화 단일 절단 단계의 전구체, blasto라고meres. 이 방법은 하나가 이러한 초기 세포가 그들의 이웃 세포와의 상호 작용이 필요 손상 배아에서 자신의 정상적인 환경에서 획득 운명에 최선을 다하고 있습니다, 또는 신호의 다른 유형에 노출하는 경우 다른 운명을 표현하는 영향을 할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.

정확하게 세포의 발달 잠재력을 평가하는이 분석의 능력 운명에지도 1, 2, 3, 4, 5, 6을 기반으로 올바른 blastomere을 해부에 의존하고 있습니다. 따라서 이후 그림 2에 도시, 정기적으로 절단 패턴을 준수 그림 1에 도시 된 바와 같이, 2 셀 단계에서 올바른 착색 패턴 배아를 선택하는 것이 중요합니다. 하나가 필요한 절단 단계에 도달로 정렬 배아를 관찰하고 불규칙 cleavages을 보여 배아를 분리하는 경우, 정확성이 크게 향상됩니다. 그림 2에 도시 된 바와 같이, 일반 cleavages는 주로 배의 한쪽에 발생합니다. 기증 셀 &#39;일반&#39;편에서 유래하는 경우 이러한 배아는 기증자으로 사용할 수 있습니다. 당신이 해부하고자하는대로 정기적으로 절단 패턴은 많은 배아 등 5 회 정도 세포 분열 진행, 정렬 등의 적은 배아에서 발견되기 때문에. 당연히 Fertilized 알은 체외</e...

개인 배아 세포의 운명은 상속 분자 및 / 또는 주변 세포의 신호에 의해 영향을받을 수 있습니다. 절단 단계 Xenopus의 배아의 운명지도 활용 한 blastomeres는 세포 세포의 상호 작용 비해 상속 분자의 공헌을 평가하기 위해 격리 문화 식별 할 수 있습니다.

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

배아의 모든 세포에 대한 계보 추적을 통해 작성된 운명 지도(fate maps)는 배아의 각 세포로부터 어떤 조직이 유래하는지를 밝혀줍니다. 운명 지도가 ...

본 동영상에서 보여주는 방법은 난할기 opus 배아의 운명 지도(fate map)를 이용하여 단일 포배 세포를 분리 배양함으로써, 배아의 운명이 내재적 지시 또는 외재적 지시에 의해 결정되는지 평가하는 것입니다. 먼저, 첫 번째 난할구가 동물극의 옅은 색소 영역을 이등분하는 2세포기 배아를 수집합니다. 이 배아들을 배양하여 16~32세포기에 도달하면, 투명대(vitel membrane)를 제거하고 선택한 세포 주변의 인접 세포들을 박리하여 제거합니다. 그 후, 박리된 포배 세포를 agar가 코팅된 배양 웰의 오목한 부분으로 옮겨 배양합니다.외식편(explant)이 원하는 단계에 도달하면, 이를 회수하여 in situ hybridization, QPCR 또는 면역조직화학법을 이용해 유전자 또는 단백질 발현을 평가합니다. 배양, 대규모 배아 세포군 또는 오가노이드 배양과 같은 다른 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 계보 추적 연구를 통해 발달 운명이 알려진 단일 배아 전구세포를 추가 성장 인자나 주변 세포의 존재 없이도 배양할 수 있다는 점입니다. 따라서 세포 내재적 인자가 해당 전구세포가 특정 조직의 전구세포가 되도록 지시하는지, 아니면 주변 세포로부터의 신호가 필요한지를 직접 테스트할 수 있습니다.Blairs의 해부와 배양 웰로의 이동은 실체 현미경 하에서 정밀한 조작이 필요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 영상에서는 해부 현미경을 사용하여 모체 유래 mRNA가 세포를 신경 운명으로 편향시키는지 확인하기 위해 이 방법을 시연하겠습니다. Illumina 연마 필름을 사용하여 핀셋 네 세트를 날카롭게 다듬으십시오.포셉 한 쌍은 실험 과정 중 팁이 손상될 경우를 대비한 예비용으로 사용합니다. 포셉 4개 모두를 오토클레이브로 멸균한 후 멸균 용기에 보관하십시오. 0.1x 및 1.0x 농도의 modified Barth saline(MBS)를 각각 500 milliliters씩 제조하고 여과 멸균합니다. 이 용액들은 유리 스크류 캡 병에 담아 14 to 18 degrees Celsius에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 1x 배지 100 milliliters에 전기영동 등급의 agarose를 2% 농도로 준비하십시오. agarose를 녹이기 위해 오토클레이브를 사용하며, 이후 agarose가 필요할 때 액체 상태가 되도록 마이크로웨이브로 가열하여 액화시킵니다.멸균된 24웰 배양 플레이트의 각 웰 바닥에 약 0.5 milliliters를 붓습니다. 이렇게 하면 임플란트가 플라스틱에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 2~360 millimeter 페트리 접시 2개의 바닥에 약 2~3 milliliters를 붓고 가볍게 돌려 골고루 분산시킵니다.이것들은 해부 접시 역할을 하며, 아가로스(agarose)는 배아가 플라스틱에 달라붙는 것을 방지합니다. 배아의 막을 제거하고 아가로스가 식어 굳으면, 6인치 파스퇴르 피펫의 끝부분을 불꽃으로 가열하여 구형으로 녹입니다. 구형 부분을 짧게 다시 가열한 후, 배양 플레이트 웰 내의 아가로스 표면에 가볍게 접촉시킵니다.이렇게 하면 X explan을 배치할 얕은 홈이 만들어집니다. 플레이트의 각 웰에 대해 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 배양 플레이트의 각 웰에 1 mL의 1x 멸균 배양 배지를 채웁니다.그 다음, 포배(blastomere) 분리를 용이하게 하기 위해 해부 접시에 0.1 X MBS를 채웁니다. 해부 접시 준비가 완료되면, 젤리층을 제거한 수정란을 0.5 x 배양이 포함된 100 millimeter 페트리 접시로 옮깁니다. 즉시 사용하지 않는 수정란은 첫 번째 접시에서 2세포기 배아를 찾는 동안 14 °C에서 배양할 수 있습니다.해부 현미경을 사용하여 첫 번째 페트리 접시에 있는 배아들을 관찰하고, 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 약 10개의 1세포 및 2세포 배아를 0.5 x 배양액이 채워진 별도의 접시로 옮깁니다. 페트리 접시를 14 °C 인큐베이터에 넣습니다. 세포의 발달 가능성을 정확하게 평가하는 이 분석법의 능력은 운명 지도(fate maps)를 기반으로 정확한 세포집단(blastomere)을 분리해내는 것에 달려 있습니다.따라서 2세포기 단계에서 이후의 정상적인 난할 패턴에 부합하는 올바른 색소 침착 패턴을 가진 배아를 선택하는 것이 매우 중요합니다. 여기서 보여주는 바와 같이, 정상적인 난할은 종종 배아의 한쪽 면에서만 일어납니다.공여 세포가 일반적인 부위에서 기원한 경우, 이러한 배아들은 여전히 공여체로 사용될 수 있습니다. 배아가 2세포기에 도달하면, 동물극의 옅은 색소 영역을 첫 번째 분열구가 이분하는 배아들을 별도의 접시에 분류하며, 해부할 수량보다 약 5배 더 많은 배아를 분류하십시오. 이들이 외편(explan)을 위한 공여체가 됩니다.절차 전반에 걸쳐 남은 2세포기 배아 두 개를 공여 배아 옆의 별도 배양 접시에 보관하여, 절편의 단계를 설정하기 위한 형제 대조군으로 사용하십시오. 배아의 분류 및 절개 작업이 끝나면, 인큐베이터 내의 배양 접시를 다시 확인하여 더 많은 1세포기 및 2세포기 배아를 찾으십시오. 1세포기 배아가 분열하는 데 약 90분이 소요되므로, 이 작업은 난자 채취 후 최대 2시간까지 수행할 수 있습니다.외배엽(explant)을 준비하기 위해 5~10개의 배아를 해부 접시에 넣습니다. 그런 다음 투명한 난황막을 포셉으로 잡을 수 있도록 첫 번째 배아의 위치를 조정합니다. 난황막은 보통 보이지 않으나, 배아 표면 위로 투명한 진주빛 공간이 형성되어 분리되어 있는 동물극 부위에서 잡을 수 있습니다.한 손에 쥔 날카로운 핀셋을 사용하여, 해부할 배아(blaster)가 손상되지 않도록 배아에서 약간 떨어진 지점을 잡습니다. 그런 다음 다른 손에 쥔 날카로운 핀셋으로 첫 번째 핀셋 끝부분 근처의 막을 잡고, 양쪽으로 부드럽게 당겨 막을 벗겨냅니다. 막이 제거되면 배아가 평평하게 펴집니다.다음으로, 핀셋으로 인접한 세포를 잡고 이 세포를 손잡이처럼 사용하여 다른 손에 든 핀셋이 분리하려는 세포에 직접 닿지 않도록 한 뒤, 대상 블래스토미어(blastomere) 주변의 나머지 인접 세포들을 조심스럽게 끌어내어 분리합니다. 동일한 운명을 공유하는 정중선 세포들을 대상으로 하는 경우, 이들을 한 쌍으로 묶어 함께 제거할 수 있습니다. 마지막으로, 손잡이 역할을 했던 세포를 분리해 냅니다.멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 blastocyst 또는 embryo 쌍을 집어 올리되, 공기 방울이 생기거나 과도한 흡입이 일어나지 않도록 주의합니다. 파스퇴르 피펫의 팁을 X-plane 배양 접시 웰의 배양액 표면 아래에 위치시키고, blastocyst를 천천히 배출합니다. blastocyst는 중력에 의해 얕은 홈 안으로 미끄러져 들어가야 합니다.배아 하나 이상에서 분리한 blastomeres를 배양액의 동일한 홈에 넣어 하나의 explant로 결합할 수 있습니다. 해부 접시에 남아 있는 배아들을 대상으로 이 과정을 하나씩 반복합니다. 배아 10개 정도를 처리하면 해부 접시가 세포 파편으로 가득 찰 것입니다.이런 현상이 발생하면 다음 해부용 접시로 교체하십시오. 모든 해부가 완료되면 외배엽(explan)이 얕은 홈 안에 있는지 확인하십시오. 홈 안에 없다면, 70% Ethanol로 멸균하고 공기 건조시킨 헤어 루프(hair loop)를 사용하여 조심스럽게 홈 안으로 밀어 넣을 수 있습니다. 마지막 해부가 끝난 후 약 1시간 동안 벤치 위 실온에서 이식물을 배양하십시오.멸균된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 치유된 외식편 주변의 잔해물을 제거합니다. 외식편이 담긴 플레이트를 형제 대조군 배아가 들어 있는 페트리 접시 옆에 14 to 20 °C로 배양합니다. 형제 배아를 통해 blastema 외식편의 발달 단계를 확인할 수 있습니다.배양 후 약 1~2시간이 지나면, 분리 배양된 할구들은 약 4회 분열하고 손상된 주변 세포로부터 남은 대부분의 잔해물을 탈락시킵니다. 20시간 후에는 작고 견고한 세포구를 형성합니다. 형제 세포들이 원하는 발달 단계에 도달하면, 분리 배양물을 회수하십시오.일부 세포가 붕괴되더라도 이러한 외식편은 꽤 잘 생존합니다. 따라서 배양액에 혼탁한 덩어리가 있는 경우, 헤어 루프나 핀셋으로 탐색하여 내부에 건강한 외식편이 묻혀 있는지 확인합니다. 글라스 파스토 pipette을 사용하여 소량의 배양액과 함께 외식편을 집어 올린 후, 수행할 분석에 적합한 고정액 또는 용해 버퍼로 조심스럽게 배출합니다.등쪽 blasphemer 두 마리 또는 배쪽 blasphemer 두 마리를 16세포기 단계에서 해부하여, 형제 배아가 초기 신경판 단계에 도달할 때까지 14 °C의 XMBS 한 곳에서 배양하였습니다. 각 샘플은 in situ hybridization을 통해 접합자 신경판 유전자 Sox two의 발현을 분석하였으며, 이는 청색 반응 생성물로 나타납니다.본 분석 결과는 신경판의 전구체인 배아 등쪽의 대부분의 blasphemers가 SOX two를 자율적으로 발현할 수 있음을 보여줍니다. 즉, 배아의 다른 부위로부터 추가적인 신호 전달 없이도 발현이 가능합니다. SOX two를 발현하지 않는 blasphemers는 해부 당시 잘못 식별되었을 가능성이 있습니다.이와 대조적으로, 복측 표피의 전구체인 복측 동물극 blastomeres는 SOX2를 발현하지 않습니다. 이러한 데이터는 배측 동물극 blastomeres가 신경 조직을 형성하는 내재적 능력을 갖춘 반면, 복측 동물극 blastomeres는 그렇지 않음을 나타냅니다. 일부 배측 explant는 또한 배측 중배엽 형성을 나타내는 신장된 형태를 보였습니다.이러한 할구들은 또한 온전한 배아에서 신경판(neural plate)을 형성하며, 외배엽 배양 시 신경판 마커 단백질을 발현하여 모계 발현 신경 유전자의 내인성 수준을 변화시키는 효과를 테스트합니다. Fox D5 mRNA를 8세포기의 복측 전구 할구에 주입하였습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 복측 이식편의 대부분이 SOX2를 발현하였습니다.반대로, 8세포기 배아의 등쪽 전구 세포에 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드를 주입하여 Fox D five의 내인성 수준을 감소시켰을 때, 소수의 등쪽 외배엽만이 SOX two를 발현했습니다. 이러한 실험 결과는 Fox D five의 모성 발현이 등쪽 전구 세포가 신경 운명을 획득하는 내재적 능력에 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 이 절차 외에도, 기능 획득을 위한 mRNA 또는 기능 상실을 위한 안티센스 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드를 분리 예정인 배아에 주입하는 등의 다른 방법들을 통해 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.예를 들어, 세포가 특정 발달 운명을 결정짓는 내재적 능력에는 어떤 유전자들이 관여할까요? 또한, 정제된 인자를 배양액에 첨가함으로써 알려진 신호 전달 인자들을 테스트할 수 있습니다. 이러한 접근법은 개별 세포 덩어리를 온전한 배아의 새로운 위치로 이식하는 데에도 사용될 수 있습니다.이 테스트는 이식된 세포가 원래의 발달 운명에 고정되었는지 여부를 확인하며, 이 정보는 다능성 배아 세포가 특정 조직의 전구세포로 분화하도록 결정되는 세포 기전을 정의하는 데 매우 중요합니다.

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Research

연구

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Biology

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