Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

이 비디오에 표시된 방법은 분열 단계 오푸스 배아의 운명 지도를 활용하여 단일 블레이저 배양을 단독으로 식별하여 배아 황산염이 내적 또는 외적 지시에 의해 결정되는지 여부를 평가하고, 첫 번째 분열 고랑이 동물 반구의 옅은 색소 영역을 이등분하는 첫 번째 두 개의 세포 배아를 수집합니다. 이러한 배아는 배아가 16 내지 32개의 세포에 도달하면 배양되고, 그 후 유리막이 제거되고 이웃 세포가 선택된 세포로부터 해부됩니다. 설명을 위해, 절개된 블래스터는 그런 다음 오거로 코팅된 배양액의 함몰부로 옮겨져 잘 배양됩니다.

explan이 원하는 단계에 도달하면 in situ hybridization QPCR 또는 immunohistochemistry를 사용하여 유전자 또는 단백질 발현을 평가하기 위해 수확합니다. 배아 세포 또는 장기 배양 배양과 같은 다른 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 계통 추적 연구를 통해 발달 운명이 알려진 단일 배아 신성 모독을 추가 성장 인자나 이웃 세포의 존재 없이 배양할 수 있다는 것입니다. 따라서 세포에 내재된 요인이 신성모독이 특정 조직의 전구체가 되도록 지시하는지 아니면 주변 세포의 신호를 필요로 하는지 직접 테스트할 수 있습니다.

이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 블레어를 해부하고 배양정으로 옮기려면 실체 현미경으로 섬세한 조작이 필요하기 때문입니다. 이 비디오에서는 이 방법을 사용하여 모계 유래 mRNA가 해부 현미경 아래에서 작동하는 신경 운명으로 세포를 편향시키는지 여부를 시연할 것입니다. Illumina 연마 필름을 사용하여 4세트의 집게를 연마합니다.

한 쌍의 집게는 시술 중 팁이 손상된 경우 백업 역할을 하며, 4개의 집게를 모두 고압멸균하고 멸균 용기에 보관하여 0.1 x 및 1.0 x 각각 500 밀리리터의 변형 바스 식염수 또는 MBS를 만들고 여과 살균합니다. 이러한 용액을 섭씨 14도에서 18도에서 유리 스크류 캡 병에 몇 달 동안 보관하고 100 밀리리터의 X 배양액에 2 % 전기 영동 등급 aros를 준비하십시오. aros가 액체인 동안 aros가 다음에 필요할 때 aros를 액화하기 위하여 aros 마이크로파를 녹이기 위하여 매체 오토클레이브.

멸균 24웰 배양 플레이트의 각 웰 바닥에 약 0.5ml를 붓습니다. 이렇게 하면 임플란트가 플라스틱에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 2-360mm 페트리 접시의 바닥에 약 2-3 밀리리터를 붓고 부드럽게 휘젓습니다.

이것들은 해부 접시로 사용되며 aros는 배아가 플라스틱에 달라붙는 것을 방지합니다. 일단 그들의 막이 제거되면, aros가 냉각되고 화염이 굳어지면 6 인치 목초지 피펫의 끝이 공으로 녹을 때까지. 공을 잠시 다시 프레임한 다음 배양 플레이트의 우물에 있는 aros 표면에 가볍게 터치합니다.

이것은 X 익스플란이 배치될 얕은 함몰부를 만들 것입니다. 플레이트의 각 웰에 대해 반복합니다. 다음으로, 배양 플레이트의 각 웰에 1ml의 1 x 멸균 배양 배지를 채웁니다.

그런 다음 해부 접시에 0.1 XMBS를 채워 블래스터 분리를 용이하게 합니다. 해부 접시가 준비되면 젤리 코트가 제거된 수정란을 0.5 x 배양 배지를 포함하는 100mm 페트리 접시로 옮깁니다. 즉시 사용되지 않는 것은 섭씨 14도에서 배양할 수 있으며, 첫 번째 접시는 두 개의 세포 배아를 조사합니다.

해부 현미경을 사용하여 첫 번째 페트리 접시의 배아를 조사하고 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 약 101개의 세포와 2개의 세포 배아를 0.5 x 배양액으로 채워진 별도의 접시로 옮깁니다. 보통. 페트리 접시를 섭씨 14도의 인큐베이터에 넣습니다. 세포의 발달 가능성을 정확하게 평가하는 이 분석의 능력은 운명 지도를 기반으로 올바른 신성 모독을 해부하는 데 달려 있습니다.

따라서 두 세포 단계에서 규칙적인 절단 패턴을 따르는 올바른 색소 패턴을 가진 배아를 선택하는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 대로. 규칙적인 분열은 종종 배아의 한쪽에서만 발생합니다.

이 배아는 기증자 세포가 정규 쪽에서 유래한 경우 여전히 기증자로 사용할 수 있습니다. 배아가 두 세포 단계에 도달하면, 첫 번째 분열 고랑이 동물 반구의 옅은 색소 영역을 이등분하는 배아를 별도의 접시로 분류하고, 해부할 배아의 약 5배를 분류합니다. 이들은 엑스플랜의 기부자가 될 것입니다.

나머지 두 개의 세포 배아는 절차 내내 기증자 배아 옆에 있는 별도의 접시에 보관하여 엑스플랜을 단계화하기 위한 형제자매 대조군 역할을 합니다. 배아를 분류하고 해부한 후 인큐베이터의 접시로 돌아가 더 많은 1개 세포 배아와 2개 세포 배아를 찾습니다. 하나의 세포 배아를 분열하는 데 약 90분이 걸리기 때문에 난자 채취 후 최대 2시간까지 수행할 수 있습니다.

엑스플란을 준비하기 위해 5-10개의 배아를 해부 접시에 넣습니다. 그런 다음 첫 번째 배아를 배치하여 투명한 유리막을 집게로 잡을 수 있도록 합니다. 일반적으로 볼 수는 없지만 배아 표면 위의 명확한 peral space로 분리된 동물의 극에서 잡을 수 있습니다.

한 손에 날카로운 집게를 사용하여 해부할 블래스터에서 멀리 떨어져 있어 손상되지 않도록 합니다. 그런 다음 날카로운 집게로 다른 손으로 다른 집게의 끝 부분에 가까운 막을 잡고 반대 방향으로 부드럽게 당겨 막을 벗겨냅니다. 배아는 막이 제거되면 평평해집니다.

다음으로, 겸자로 이웃 세포를 잡고 이 세포를 손잡이로 사용하여 해부할 세포가 다른 손의 집게로 직접 닿지 않도록 하고 나머지 이웃 세포를 원하는 신성 모독으로부터 부드럽게 당겨냅니다. 같은 운명을 공유하는 정중선 세포가 표적이 되면 한 쌍으로 함께 제거할 수 있습니다. 마지막으로 핸들 셀을 해부합니다.

신성 모독 또는 멸균 유리와 함께 피펫을 지나쳐 기포와 과도한 흡입을 피하십시오. 목초지 피펫의 끝을 X explan 배양 접시의 우물에 있는 배양 배지 표면 아래에 놓고 블래스터를 부드럽게 배출합니다. 그것은 중력에 의해 얕은 함몰부로 미끄러져야 합니다.

하나 이상의 배아에서 나온 신성모독자들은 한 배양에서 동일한 함몰부에 그것들을 증착시킴으로써 하나의 설명으로 결합될 수 있다. 음, 해부 접시에 남아 있는 배아를 하나씩 가지고 이 절차를 반복합니다. 약 10개의 배아가 생성되면 해부 접시는 세포 파편으로 채워집니다.

이 경우 다음 해부 접시로 변경하십시오. 모든 해부가 완료된 후 엑스플랜이 얕은 함몰부에 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 70% 에탄올로 살균된 헤어 루프를 사용하여 함몰부로 부드럽게 밀어 넣고 마지막 해부 후 약 한 시간 후에 벤치에서 실온에서 공기 건조된 임플란트를 배양할 수 있습니다.

멸균 유리 목초지 피펫 배양으로 치유된 엑스플란을 둘러싼 파편을 제거합니다. 섭씨 14도에서 20도의 엑스플랜 접시는 형제 대조 배아가 들어 있는 페트리 접시 옆에 있습니다. 형제자매 배아는 신성모독 설명의 발달 단계를 나타냅니다.

배양에서 약 1-2시간 후, 이식된 할구는 약 4번 분열하고 손상된 이웃 세포에 남아 있는 대부분의 파편을 벗겨냅니다. 20시간이 지나면 작고 튼튼한 세포 덩어리를 형성합니다. 형제자매가 원하는 발달 단계에 도달하면 엑스플플랜을 수확합니다.

이러한 익스플란은 일부 세포가 분해되더라도 꽤 잘 살아남습니다. 따라서 배양에 흐린 덩어리가 있으면 헤어 루프나 집게로 잘 탐색하여 건강한 엑스플랜이 그 안에 묻혀 있는지 확인하십시오. 소량의 배양 용액에 담긴 엑스플랜을 피펫 너머로 유리잔으로 집어 들고 분석을 수행하기에 적합한 정착제 또는 용해 완충액으로 부드럽게 배출합니다.

두 개의 등쪽 신성모독 또는 두 개의 배쪽 신성모독을 16개의 세포 단계에서 해부하고 형제 배아가 초기 신경판 단계에 도달할 때까지 섭씨 14도에서 하나의 XMBS에서 배양했습니다. 각 샘플은 접합 신경판(zygotic neural plate)의 발현을 위해 분석되었습니다. Gene Sox two by in situ hybridization, 이는 청색 반응 생성물로 간주됩니다.

이 분석의 결과는 신경판의 전구체인 대다수의 등쪽 동물 신성모독자가 SOX 2를 자율적으로 발현할 수 있음을 보여줍니다. 이는 배아의 다른 영역으로부터 추가적인 신호 전달이 없는 것이다. SOX 2를 표현하지 않는 설명은 해부 시점에 잘못 식별되었을 수 있습니다.

대조적으로, 복부 표피의 전구체인 복부 동물 신성모독자 중 어느 것도 SOX 2를 발현하지 않습니다. 이러한 자료는 등쪽 동물 신성모독자는 신경 조직을 형성하는 타고난 능력을 가지고 있는 반면, 복부 동물 신성모독자는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 일부 등쪽 explan은 또한 등쪽 중배엽 형성을 나타내는 형태를 연장했습니다.

이러한 할구는 또한 온전한 배아에서 Noor를 형성하기 위해 퇴색되며, explan 배양은 Noor marker 단백질을 발현하여 모계 발현 신경 유전자의 내인성 수준을 변경하는 효과를 테스트합니다. Fox D 5개의 mRNA를 8개의 세포 복부 전구체 신성모독자에 주입했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 대부분의 복부 임플란트는 SOX 2를 발현했습니다.

반대로, 8개의 세포 배측 전구체 블래스터에 안티센스 모프 올리고뉴클레오티드를 주입하여 Fox D five의 내인성 수치를 감소시켰을 때, 소수의 등쪽 엑스플란만이 SOX 2를 발현했습니다. 이 실험은 Fox D five의 모계 발현이 이 절차 이전에 신경 운명을 획득하는 등쪽 신성모독자의 내재적 능력에 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 기능 향상을 위한 mRNA 또는 기능 상실을 위한 안티센스 모르포 올리고뉴클레오티드를 해부하기 위해 블레어에 주입하는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.

예를 들어, 특정한 발달 운명을 일으키는 세포의 내재적 능력에 관여하는 유전자는 무엇입니까? 또한, 배양 배지에 정제된 인자를 첨가하여 알려진 신호 인자를 테스트할 수 있습니다. 이 접근법은 또한 개별 신성모독자를 온전한 배아의 새로운 위치에 이식하는 데 사용할 수 있습니다.

이식된 세포가 원래의 발달 운명에 전념하는지 여부를 테스트하는 이 정보는 만능 배아 세포가 정의된 조직의 전구체가 되기 위해 투입되는 세포 메커니즘을 정의하는 데 중요합니다.