특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도로 뉴런의 구조와 기능을 연구하기 위해 기능 맵의 마이크로 도메인을 정확하게 표적으로 삼는 것입니다. 이는 먼저 피질의 넓은 영역에 걸쳐 고유 신호 이미징을 수행하여 관심 있는 자극 특징의 지도를 얻음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 고해상도에서 광자 이미징의 대상이 될 지도에서 정확한 위치를 결정하는 것입니다.

다음으로, 형광 염료가 적재된 피펫을 조심스럽게 배치한 후 형광 마커로 표지합니다. 마지막으로, 뉴런 반응 또는 구조의 고해상도에서 광자 이미지가 수집됩니다. 궁극적으로, 내재적 신호 특징 맵을 사용하여 방향 바람개비 특이점과 같은 관심 영역을 찾은 다음 단일 뉴런 해상도에서 연구 대상으로 삼을 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 시스템을 몇 가지만 빠르게 조정하면 동일한 현미경 설정을 사용하여 서로 다른 공간 규모에서 피질을 이미지화할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 이러한 기술을 결합하여 코스 해상도 고유 신호 맵을 고해상도 이미징을 위해 형광 프로브로 표지할 뉴런 영역을 선택하기 위한 지침으로 사용할 수 있습니다. 동물은 기관 동물 관리 유도 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 마취되었으며 두개골이 노출되고 세척되었습니다.

치과 용 시멘트 혼합물은 두개골 중앙에 직사각형 개구부가 있는 스테인리스 스틸 헤드 플레이트를 부착하는 데 사용되었습니다. 헤드 플레이트 상단의 금속 챔버는 Water Immersion 대물 렌즈로 이미징하기 위한 저장소 역할을 합니다. 헤드 플레이트는 금속 포스트를 사용하여 XY 스테이지에 고정되었습니다.

치과용 드릴을 사용하여 헤드 플레이트의 직사각형 개구부 내에서 넓은 영역의 뼈를 얇게 만듭니다. 간헐적인 출혈을 멈추기 위해 뼈 왁스를 바르는 것이 필요했습니다. 얇은 영역은 계획된 개두술의 경계를 벗어나는 동안 확장되어야 합니다.

그런 다음 개두술을 위해 뼈에 2 x 2mm 정사각형 윤곽을 뚫습니다. 신선한 인공 대뇌척수액으로 챔버를 주기적으로 헹구어 뼈 파편을 제거하고 기저 피질에 대한 열 방출을 최소화합니다. 이제 숫자 3 집게로 뼈를 들어 올립니다.

숫자 5 집게와 Vana 스프링 가위를 사용하여 경막의 위쪽 층을 제거하고 아래쪽 층은 그대로 둡니다. 경막의 마지막 층은 투명하며 이를 통해 껍질 혈관이 명확하게 보여야 합니다. A CSF에 용해된 따뜻한 2%에어로스 한 방울을 바르고 즉시 개두술 위에 커버 유리를 놓습니다.

먼저, 내재 신호 이미징 중에 아그로스가 건조되는 것을 방지하기 위해 커버 유리 외부 주위에 CSF로 적신 젤 폼을 사용합니다. 그런 다음 고유 신호 이미징 CCG 카메라를 두 개의 사진 현미경 상단의 표준 C 마운트 포트에 부착하고 XY 스테이지 위치 근처의 에어 테이블에 조명 광원을 놓고 개두술 위에 광 가이드를 고정합니다. 기본 이색성과 해산 포트 아래의 미러를 집어넣어 고유 신호에 필요한 반사된 적색광이 개두술에서 CCD 카메라로 직접 전달되도록 합니다.

피질이 가열되는 것을 방지하기 위해 광 경로에 적외선 필터를 삽입하십시오. 그런 다음 녹색 빛을 통과하는 필터를 배치하고 피질 표면 혈관의 디지털 참조 이미지를 기록합니다. 다음으로, Z 초점을 피질 표면 아래 500미크론으로 이동합니다.

녹색 필터를 빨간색 필터로 교체하여 내재 신호를 측정하기 위해 피질을 비춥니다. 피질이 균일하게 조명되는지 확인하십시오. 시각적 자극 디스플레이에 의해 생성된 빛으로부터 개두술을 보호하고 시각적 자극 시퀀스를 제시하고 반사율 데이터 이미지를 기록하여 방향 맵을 생성합니다 10분 이내에 각 방향에 대해 4개의 방향과 2개의 방향으로 8개의 자극 시퀀스를 4회 반복하는 것에 해당하는 데이터를 수집합니다.

이제 내재 신호 데이터를 분석하여 다음과 같이 잘못된 방향 컬러 맵을 생성합니다. 그런 다음 뉴런의 두 광자 표지를 위한 잠재적 대상 영역을 선택합니다. 예를 들어, 방향 바람개비 특이점은 맵에서 모든 선호 방향이 수렴하는 지점을 가리킵니다.

다음으로, 방향 맵과 대뇌피질 표면 혈관 구조의 이미지를 오버레이하고 기능 영역의 레이아웃과 큰 표면 혈관의 위치를 사용하여 큰 혈관과 동맥이 있는 위치를 피하고 대상을 선택합니다. 형광 D 용액을 준비하고 서면 프로토콜의 지침에 따라 긴 테이퍼 피펫을 당깁니다. 염료 혼합물 5마이크로리터를 피펫에 넣습니다.

그런 다음 피펫 삽입을 용이하게 하기 위해 dura의 마지막 층을 제거하고 이 다이어그램에 표시된 대로 최고 품질의 두 광자 이미지를 얻습니다. 피펫은 챔버와 대물렌즈 사이를 통과하기 위해 30도 각도로 피질로 박아야 합니다. 그러므로, 피펫 진입 위치의 피질 표면 위치는 대상 관심 영역 바로 위에 있지 않을 것입니다.

예를 들어, 피질 표면 아래 200미크론 떨어진 타겟 영역을 라벨링하기 위해, 피질 표면의 피펫 진입 위치는 타겟 위치 측면에서 약 350미크론이 될 것입니다. XY 스테이지를 이동하여 피질 표면 진입 위치를 20 x 또는 40 x 대물렌즈 아래의 중앙에 배치합니다. 진입 위치가 목표물 아래 중앙에 오면 목표의 Z 위치를 2mm 올립니다.

그런 다음 녹색 에피 형광을 켜고 피펫의 빨간색 Alexa 염료를 시각화하고 팁이 피질 표면 진입 위치 위에 올 때까지 피펫을 움직입니다. 명시야 조명이 있는 현미경의 접안렌즈를 통해 피펫 팁을 보는 동안 팁이 피질 표면의 원하는 진입 위치에 도달할 때까지 피펫을 내립니다. 다음으로, 대물렌즈를 제거하고 보푸라기가 없는 흡수 창을 사용하여 개두술에서 과도한 대뇌척수액을 흡수하고 인접한 뼈를 건조시킵니다.

그런 다음 피질을 안정화하기 위해 CSF에 용해 된 따뜻한 3 % 상승 한 방울을 바르십시오. 아로스가 굳어지면 40 x 대물렌즈를 삽입하고 챔버를 CSF로 다시 채웁니다. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터의 대각선 축을 사용하여 팁이 피질에서 원하는 깊이에 도달할 때까지 피펫을 움직입니다.

DI 혼합물을 가끔씩 압력 배출하면 피펫이 2층에 도달할 때 피펫 팁이 막힐 가능성이 줄어들고, DI 혼합물의 세 번의 작은 퍼프는 여분의 세포 공간을 비추고 직경 300-600미크론의 피질 구체에 신경체를 적재하기 위한 어두운 그림자로 원형 세포체의 조밀한 어셈블리를 드러냅니다. 30-90 펄스를 사용하여 Dix 혼합물을 세포 외 공간에 주입합니다. 각 펄스는 1초, 2-10PSI입니다.

주입이 완료되면 몇 분 정도 기다렸다가 피펫과 대물렌즈를 제거합니다. 형광 칼슘 지시약은 1시간 안에 뉴런에 의해 완전히 흡수됩니다. 마지막으로 다운로드에 사용된 aros를 제거하고 녹음 챔버를 헹굽니다.

표면에 2-3%의 작은 방울을 떨어뜨리고 개두술 위에 커버 유리를 빠르게 놓습니다. 높은 NA 20 x 대물렌즈를 대물렌즈 홀더에 삽입하고 레이블이 지정된 대물렌즈 아래의 피질 영역을 중앙으로 되돌립니다. XY 스테이지를 사용하여 외부 광원으로부터 개두술을 보호하고 in vivo에서 라벨링된 뉴런의 고해상도 이미지를 수집합니다.

또는 단일 세포 electroporation을 사용하여 수지상 형태 또는 수상돌기의 기능적 이미징을 연구할 수 있습니다. 이 방법론에서 DI는 서면 프로토콜에 따라 준비됩니다. 그런 다음 절차의 적절한 지점에서 피펫 팁을 신경 세포체막에 인접하게 배치하고 axo를 사용하여 1-3개의 펄스를 적용합니다.

뉴런에 염료가 즉시 채워지는 것은 두 개의 광자 현미경으로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이 이미지는 시각 피질층 2 3에서 오전 1:00 형광 칼슘 지시자 OGB로 표시된 세포체를 보여주는 두 개의 광자 이미지 영역을 보여주며, 눈금 막대는 100 미크론을 나타냅니다. 이 이미지는 이전 이미지에 표시된 것과 동일한 부위의 개별 신경 세포체의 방향 선호도를 보여줍니다.

선호되는 자극 방향의 조직화된 지도는 이미지화된 영역에 중심을 둔 바람개비 특이점 주변에서 볼 수 있습니다. 여기서 우리는 내재적 신호 이미징으로 얻은 방향 맵을 볼 수 있습니다. 검은색 사각형은 이전 두 광자 이미지에 표시된 영역에 해당합니다.

이 이미지는 배향 맵으로 오버레이된 단일 뉴런의 수상돌기와 세포체를 보여줍니다. 뉴런은 두 개의 광자 유도에 따라 Alexa floor 5 94로 전기 천공되었습니다. Z 스택은 in vivo에서 수집되었으며 수지상 과정은 neuro lucid를 소프트웨어로 사용하여 오프라인으로 추적되었습니다.

방향 맵은 단일 세포 전기천공법 전에 고유 신호 이미징을 사용하여 얻었습니다. 축척 막대는 100미크론을 나타냅니다. 피질층 1에서 나온 이 10미크론 Z 투영은 정점 수상돌기를 보여줍니다.

빨간색 화살표는 수상돌기를 따라 가시를 보여주며, 피질층 2, 3에서 나온 이 10미크론 Z 돌출부는 빨간색 화살표로 표시된 가시가 있는 기저 수상돌기와 흰색 화살표로 표시된 축삭돌기를 보여줍니다. 이 방법은 다양한 공간 규모에서 피질의 기능 지도를 연구하고 특정 관심 영역의 뉴런을 정확하게 표적으로 삼는 데 유용합니다. 지도 내에서 우리는 방향 선택 지도를 검사하는 방법의 적용을 시연했지만 망막, 토피, 안구 우성 및 방향과 같은 다른 시각적 기능 지도 또는 소마토 감각 또는 청각을 인코딩하는 것과 같이 기능적으로 조직된 지도가 있는 다른 감각 양식으로 확장될 수 있습니다.