GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

다음 실험의 전체적인 목적은 고도로 정제된 전장 표적 단백질을 얻는 것입니다. 이를 위해 재조합 바오 바이러스(bao virus)를 제작하고, 이를 SF nine 곤충 세포에 감염시켜 고발현 및 수용성인 이중 태그 표적 단백질을 얻습니다. 이후 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferase) 태그 단백질 정제와 금속 친화성 크로마토그래피로 이어지는 2단계 친화성 정제를 수행합니다.

정제 결과, 고순도의 히스티딘 태그 단백질을 얻을 수 있습니다. 다음으로, 보관 버퍼의 염 농도를 낮게 유지하기 위해 정제된 단백질 샘플을 투석합니다. SDS-PAGE 겔의 전체 단백질 염색을 통해 단백질의 발현 용해도, 양 및 품질을 확인한 결과를 얻습니다.

우리는 PAL B two 및 BOC two와 같이 크고 불안정한 단백질을 정제하는 데 어려움을 겪으면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 따라서 단일 단계 친화성 정제와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 당사의 2단계 친화성 정제 프로토콜을 통해 얻은 단백질의 순도가 매우 높으며 일반적으로 분해 산물이 포함되어 있지 않다는 점입니다. 이 방법은 정제된 재조합 단백질의 생화학적 기능과 같이 단백질 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

본 프로토콜은 재조합 bao 바이러스의 생산으로 시작하며, 이어서 텍스트 프로토콜의 감염 섹션에 설명된 대로 가장 효율적인 BA 바이러스를 선별합니다. 500 mL의 배지에 0.75~1.0 × 10⁶개의 SF nine 세포가 포함된 스피너 배양 용기를 준비하며, 바이러스와 배지의 비율은 1:150으로 설정합니다. 스피너를 세포 배양 후드 안에 놓고, 스피너의 한쪽 암을 통해 필요한 부피의 baula 바이러스 현탁액을 세포 현탁액에 첨가하여 세포를 감염시킵니다.

감염된 세포를 27 °C의 현탁 배양 상태로 성장시키고, 가장 효율적인 baculovirus를 선택할 때 결정된 최대 단백질 발현 시점에 세포를 수확합니다. 세포를 수확한 후, 프로테아제 억제제가 첨가된 약 20 mL의 GST 결합 버퍼를 사용하여 얼음물 배스(ice water bath) 내에서 목적 단백질을 발현하는 Sf9 세포를 용해합니다. 균질기(homogenizer)로 용액을 20회 통과시킨 후, 32초 동안 3회 초음파 처리(sonication)를 하고 다시 20회 통과시킵니다. 다음으로, 세포 용해물을 4 °C에서 18,000 RPM으로 30분간 원심 분리하여 상층액을 회수합니다. 수용성 세포 용해물을 미리 세척한 GST 비드 1 mL와 함께 4 °C에서 1시간 동안 완만하게 회전시키며 반응시킵니다.

배양 시간은 단백질의 안정성과 결합 후의 결합 효율에 따라 최적화해야 합니다. 700 RPM에서 짧게 원심 분리하여 결합되지 않은 단백질이 포함된 상층액을 제거합니다. GST 세척 버퍼를 사용하여 GST 결합 단백질을 세척합니다.

마지막 세척 후 이 과정을 두 번 더 반복하십시오. 상층액을 가능한 한 많이 제거합니다. 그 후, 인큐베이션 후 열충격 단백질(heat shock proteins)의 비특이적 결합을 방지하기 위해, GST 결합 버퍼 10 mL에 5 mM ATP와 15 mM 염화마그네슘을 첨가하여 비드를 4 °C에서 1시간 동안 인큐베이트하십시오.

GST 세척 버퍼로 비즈를 3회 세척하십시오. GST 비즈를 원심 분리하고 상층액을 제거한 후, P five 버퍼로 GST 비즈를 세척하십시오. 그다음, GST 비즈를 100 microliters씩 분분하고, P five 버퍼 100 microliters에 희석한 4~8 units의 precision enzyme을 첨가하십시오.

GST 비즈를 효소와 함께 4°C에서 완만한 회전 상태로 3시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 시간은 단백질의 분자량뿐만 아니라 절단 후의 안정성에 따라 최적화해야 합니다. 짧게 원심 분리하여 상층액을 수집합니다.

비드에 P five buffer 100 µL를 추가합니다. 그 다음, 원심분리와 상층액 수집 과정을 두 번 반복합니다. 모든 분획물을 회수합니다.

EIT를 1 mL씩 세 개의 분획으로 나누고, 각각에 미리 세척된 talon metal affinity resin dry beads 100 µL를 넣어 회전시키며 1시간 동안 배양합니다. 이때 용출액을 여러 분획으로 나누면 결합 및 세척 효율이 높아집니다. 그런 다음 4 °C에서 P 30 buffer를 사용하여 완만한 회전과 함께 5분 동안 레진을 세척합니다. 세척 과정을 두 번 더 반복한 후, 비드를 하나의 튜브에 모아 정제된 단백질을 용출합니다.

단백질이 결합된 talon resin에 P 500 buffer를 추가합니다. buffer와 bead의 부피 비율을 1:1로 맞추어 추가합니다. 현탁액을 회전시키며 5분 동안 배양합니다.

이 단계를 두 번 반복하십시오. 정제된 단백질을 저장하기 위해 용출된 각 분획을 분리하여 보관합니다. 단백질을 적절한 저장 버퍼에 넣고 4 °C에서 교반하며 1시간씩 두 번 투석하십시오.

투석 과정 동안 정제된 단백질의 침전 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 정제된 단백질을 소량으로 분주하여 드라이아이스에서 30분 동안 급속 냉동시키십시오. 분주된 시료는 -80 °C에서 보관하며, 반복적인 해동 및 냉동 사이클을 피하십시오.

각 분획의 약 20 to 40 µL를 SDS page gel에 로딩하여 정제 과정을 분석합니다. gel을 전기영동한 후 가시화를 위해 Coomassie blue 또는 단백질 염색약으로 염색합니다. REC 14 재조합 baculovirus에 감염된 SF nine 세포와 대조군으로 사용된 mock 감염 세포의 가용성 및 전체 세포 용해물을 Coomassie blue 염색으로 분석하여, 정제 과정 중 GST-RE14-His 단백질의 발현을 확인하였습니다. 해당 방법의 효율성을 추적하기 위해 다수의 샘플을 Coomassie Blue로 분석하였습니다.

염색 결과, 정제 첫 번째 단계에서 GST Rec 14가 GST 비드에 정확하게 결합되었음을 보여주며, GST와 rec 14의 융합으로 인해 약 50 kilodaltons의 겉보기 분자량을 나타냈습니다. G-S-T-G-S-T 부위의 정밀 절단 후, 유리된 rec 14 hiss는 약 37 kilodaltons 부근에서 이동합니다. 절단된 GST는 GST 비드에서 시각화할 수 있으며, 일부 유리된 REC 14가 여전히 GST 비드에 결합되어 있음에도 불구하고 REC 14 hiss의 현저한 농축이 이루어졌습니다. 이 단계는 정밀 프로테아제와 단백질의 배양 시간을 늘림으로써 개선될 수 있습니다. GST 정제 단계 이후 용출된 단백질과 비교하여 Talon 비드에 결합된 REC 14 hiss의 정밀 프로테아제 분석 결과, REC 14 hiss의 상당 부분이 Talon 비드에 결합되어 있음을 보여줍니다.

수차례 세척 후, REC 14 hiss를 용출하여 수집하였으며, 총 3회의 용출을 수행하였습니다. 분석 결과 REC 14 hiss의 높은 순도가 확인되었으며, 용출 분획과 비드(beads)를 비교한 첫 번째 용출 단계에서 REC 14 hiss의 농도가 가장 높게 나타나 용출 효율이 입증되었습니다. 이는 비드에 결합된 채로 검출된 REC 14 hiss가 거의 없었기 때문입니다.

REC 14을 추적하기 위해 이 샘플들에 대해 anti GST 및 anti hiss 항체를 이용한 Western blot 분석을 수행하였습니다. 전체 과정 동안, anti GST blot은 GST 정제 단계에서 언급된 단백질들에 일부 GST-REC 14와 GST 단독 성분이 존재했음을 보여주며, hiss tag 친화성 정제 단계를 통해 오염 물질들이 제거되었음을 보여줍니다. 이 blot은 정밀 처리와 hiss tag 정제 단계를 통해 REC 14에서 GST가 효율적으로 제거되었음을 나타냅니다.

anti-His 블롯은 Rec 14를 검출하는 것을 목표로 합니다. 이 블롯은 GST-Rec 14-His 및 REC 14-His가 GST 비드에서 완전히 절단되어 제거되지 않았음을 확인해 줍니다. 또한, 고농도에서 REC 14는 응집되는 것으로 보입니다.

요약하자면, 제시된 결과는 S palm B rec 14 정제를 위한 GST hiss 정제의 효율성을 입증합니다. 이 영상을 시청한 후에는 고도로 정제된 재조합 단백질을 회수하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 이를 숙달하여 활용할 수 있을 것입니다.

이 기술은 적절하게 수행될 경우 가용성 ly acid의 변성 후 12시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 단백질 분해를 방지하기 위해 신속하게 작업하고 엄격하게 4 °C를 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에, 단백질 파트너의 확인이나 관심 단백질의 번역 후 변형과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 공침 강정 분석이나 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

본 연구에서는 이 방법을 DNA 복구 단백질에 사용하였으나, 다른 연구 분야의 단백질 기능을 연구하기 위해 이 전략을 수정하여 적용할 수 있습니다.