Name: GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 학습하세요 GST 및 His-태그를 활용한 2단계 친화력 정화법으로 재조합 단백질을 고순도로 정제하는 방법을. SF9 곤충 세포에서 발현된 단백질의 품질과 수율을 향상시키는 효율적인 실험 기술입니다.

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우리는 방법의 개발에 선도적 인 토론을위한 앤 마리 디온 - 코트 감사합니다. JK와 RB는 FQNRT 박사 학자이며, M.-MG는 바니 에르 CIHR 학자이며, J.-YM는 FRSQ 수석 연구원이다. 이 작품은 자연 과학 및 JY에 공학 연구 협의회에서 기금에 의해 지원되었다. M.

1. 재조합 배큘로 바이러스의 제조 배큘로 바이러스는 주로 단지 약간의 수정 제조자의 프로토콜에 따라 인비 트로겐의 바크 투 바크 배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성된다 : <ol><li> 수정 pFastBac1 벡터 (기브, 수명은) GST와 그의 - 태그 (그림 2)를 포함 만들었습니다. PET-52B (+) 벡터 (노바 젠)의를 다중 사이트 (MCS)는 10xHis 태그를 포함, pFastBac1 - 패 혈성-10xHis를 생성하는 pFastBac1 벡터의 MCS에 삽입했다. PET-52B (+) MCS 시퀀스는 5에서 BglII에 제한 사이트 &#39;말단과 3에서 HindIII의 제한 사이트&#39;말단을 추가를 XbaI 및 BlpI 제한 부위 사이에 증폭 된 PCR했다. PCR 생성물을 B​​amHI 및 다음 BglII에 제한 시퀀스의 호환성을 이용하여 제한 효소 BamHI과 HindIII로 pFastBac1의 제한 부위 사이에 클로닝 하였다. 목표는 표현을 허용 pFastBac1를 생성 할 때부터스트렙 타비 딘과 10xHis - 태그 재조합 단백질, PET-52B (+)의 BamHI로 제한 사이트는 MCS 시퀀스는 사용되지 않았다. 또한, XbaI의 제한 사이트는 이미 pFastBac1의 MCS 및 PET-52B의 MCS 삽​​입이 (+)의 사이트 사이에서 발생하는 제한 사이트의 중복을 피하기 위해 사용되지 않았습니다. PreScission 단백질 분해 효소 인식 부위 (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro)와 GST 코딩 순서는 다음 pFastBac1 - 패 혈성-10xHis에 삽입했다. 유전자 pGEX-6P-1 (GE 헬스 케어)에서 GST의 cDNA 서열은 PCR 각각 5에서을 NcoI 및 KpnI으로 제한 부위를 함유하는 프라이머 &#39;및 3&#39;말단으로 증폭 하였다. 을 NcoI 사이트는 개시 코돈의 첨가뿐만 아니라 GST에 알라닌을 허용한다. PCR 생성물이어서 스트렙 타비 딘 - 태그의 삭제 결과를 NcoI 및 KpnI으로 제한 부위 사이 pFastBac1-Strep의-10xHis로 클로닝 하였다. 이렇게 얻어진 새로운 융합 벡터 pFastBac1-GST-10xHis 지명되었다. </li><li> 홍보에 대한 cDNA를 코딩을 복제GST (N-말단)과 그의 태그 (C 터미널) 사이의 pFastBac-GST-10xHis 벡터에 관심 otein. C-말단 그의 태그와의 융합을 허용하는 cDNA를 정지 코돈을 제거 할주의하십시오. </li><li> E.에게 변환 (단계 1.2에서 얻은) 재조합 pFastBac와 대장균 DH10Bac는 백 미드를 생성합니다. 식민지 Bluo - 여자와 IPTG (10 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 12 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신, 100 ㎍ / ㎖의 Bluo을 함유 선택 접시에 30 ° C에서 37 ° C 몇 시간에서 하룻밤 성장 할 수 있도록 허용 여자, 40 ㎍ / ㎖의의 IPTG). </li><li> 선택과 화이트 표현형을 확인하기 위해 선택 접시에 (단계 1.3에서) 2 화이트 식민지를 restreak. </li><li> 10 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 단계 1.4에서 두 개의 흰색 식민지로하고 37 ℃에서 교반하면서 밤새 (250 RPM)를 물게을 포함하는 LB 2 ㎖를 접종 </li><li> 백 미드의 DNA를 정제하기 위해서는, 단계 1.5에서 박테리아 펠렛용액 300 μL 난에있는 세포를 재현 탁 및 솔루션 II 300 μL (퀴아 Maxiprep 키트)를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 품어 3 M KOAc이다 산도 5.5의 300 μl를 추가하고 얼음에 10 분 동안 품어. 4 ° C, 10 분 동안 최대 속도로 샘플을 원심 분리기. 상층 액에 이소프로판올 800 μl를 추가하고 얼음에 10 분 동안 품어. 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리하여 70 % 에탄올 500 μL로 펠렛을 씻으십시오. 펠릿 건조시켜 트리스​​ - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.0의 40 μL의 멸균 조건을 재현 탁. 백 미드의 DNA는 4 ℃에서 보관해야 </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 설명 된대로 배큘로 바이러스를 생성합니다. 배큘로 바이러스는 빛으로부터 보호 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 재조합 단백질 발현 <ol><li> 정제를위한 가장 효율적인 배큘 선택할 및 단백질 발현의 피크에 도달 몇시 모니터하기 위해, 미니 감염 분석을 수행의는 다음과 같다 : 2 인 Sf9의 X 10 7 배큘로 바이러스의 133 μL (1 / 150)으로 (10 % FBS, 1 % P / S 보완) 그레이스의 미디어에있는 27 ° C에서 배양 된 세포를 감염 감염하십시오. 0, 24, 48에 1.5 ㎖를 분취를 수집하고, 72 시간 게시물 감염. 펠렛은 세포 및 안티 태그 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 그 단백질의 발현 수준을 분석한다. </li><li> 바이러스와 미디어 사이의 1 / 150의 비율로 미디어 500 ㎖에 ML 당 1.0 × 10 6 인 Sf9 세포를 포함하는 회 전자를 감염시키기 위해 2.1 단계에서 가장 효율적인 배큘로 바이러스를 사용합니다. 감염된 세포는 27 ° C에서 서스펜션의 성장과 최대의 단백질 발현 (위 2.1 단계에서 결정)에 도달하면 세포를 수확 할 수 있습니다. 펠렛 세포는 나중에 사용할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 수용성 세포 용 해물의 제조 다음 배양 단계는 모두 가벼운 회전에서 4 ° C에서 수행됩니다. <ol><li> 를 Lyse SGST 결합 완충액 (150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.05 % 트리톤 - X-100, 1 ㎜ 250 ㎜의 염화나트륨의 최종 농도에 대한 PBS1X의 DTT, 및 단백질 분해 효소 억제제 ~ 20 ㎖에 관심 단백질을 발현 F9 세포 칵테일 (로슈). 빙수 욕에서, 다운스 균질 기, 초음파 처리 3X 30초 각 (70 % 출력)와 용액 20X 다운스 다시 20X를 다운스. </li><li> (선택 사항). DNA 또는 RNA의 오염을 제거하기 위해 4 ° C에서 30 분 동안 1 mM의 MgCl2를 2 7 클레아 제 (2.5 U / ㎖) 벤조 전체 세포 용 해물을 품어. </li><li> 4 ℃에서 30 분간 18,000 rpm으로 원심 분리기 뜨는을 유지합니다. </li><li> (선택 사항). 원심 분리기는 상층 액을 다시 4 ° C에서 18,000 rpm으로 30 분 동안 명확한 가용 해물를 얻을 수 있습니다. 막힘을 방지하기 위해 0.2 또는 0.45 μm의 필터를 통해 뜨는을 전달합니다. </li></ol> 4. GST 구슬에 단백질의 결합 <ol><li> GST 비즈 1 ㎖로 용해 세포 용 해물을 품어 (로 2 회 prewashedGST의 10 ㎖의 부드러운 회전에서 4 ° C에서 1 시간 동안 버퍼)를 결합. </li></ol> 의견 배양 시간은 단백질의 안정성과 결합 효율에 따라 최적화 될 필요가있다. <ol start="2"><li> 빠른 700 rpm에서 스핀과 결합되지 않은 단백질을 함유 뜨는을 제거 (이는 추가 분석을 위해 유지 될 수있다). GST 세척 버퍼 GST-결합 단백질 (그림 3B, 레인 1) 세척 (GST는 350 mM의 염화나트륨 마지막으로 버퍼를 바인딩). </li><li> 단계를 반복 4.2 배. 마지막 세척에서, 가능한 한 많은 뜨는을 제거합니다. </li><li> 열 충격 단백질 (8)의 비특이적 결합을 방지하기 위해 4 ° C에서 1 시간 동안 (10 ㎖ GST 바인딩 버퍼) 5 mM의 ATP, 15 mM의 MgCl2를 가진 구슬을 품어. GST 세척 버퍼로 구슬을 세 번 씻으십시오. </li></ol> 5. GST의 PreScission 분열 <ol><li> GST 비즈를 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 P5 버피와 GST 비즈를 씻어FER (50 mM의 NaHPO 4의 pH 7.0, 500 mM의 NaCl을, 10 % 글리세롤, 0.05 % 트리톤 - X-100, 5 mM의 이미 다졸). </li><li> 3 시간에 밤새 4 ℃에서 P5 버퍼 PreScission 효소와 GST-구슬을 품어 (100 μL의 분수 GST 비즈를 나누고 P5 버퍼 100 ㎕의 희석 효소의 4-8 단위 (2-4 μL)를 추가). </li></ol> 의견 PreScission 단계의 배양 시간은 분자량뿐만 아니라 단백질의 안정성에 따라 최적화 될 필요가있다. 열화가 관찰되는 경우,이 배양 시간 밤새 2 시간의 최소 대신에 감소 될 수있다. <ol start="3"><li> 빠른 스핀과 상층 액을 수집합니다. P5의 100 μl를 추가 한 후이 단계를 두 번 반복 구슬에 버퍼 및 모든 분수 (그림 3B, 레인 2) 풀. </li></ol> 코멘트 : 나머지 구슬 절단 효율성의 분석을 위해 사용될 수있다 (그림 3B </stroNG&gt;, 레인 3). 일반적으로, 단백질 70 ~ 80 %가 절단된다. 6. 단백질 결합 TALON 금속 친 화성 수지에 <ol><li> 1 ㎖의 3 분수에 위의 용출을 나누고 회전에서 1 시간 동안 (P5 버퍼로 2 회 prewashed) 100 ㎕의 발톱 금속 친 화성 수지 건조 구슬과 각을 품어. </li></ol> 코멘트 : 여러 분수 용출을 나누면 바인딩 / 세척 효율을 증가시킨다. <ol start="2"><li> P30 버퍼 (30 mM의 이미 다졸의 최종 농도로 P5 버퍼)와 수지 5 분을 씻으십시오. </li><li> 단계 6.2 배를 반복하여 하나의 튜브에 비즈를 풀. 마지막 세척하기 전에 가능한 한 많은 뜨는을 제거합니다. </li></ol> 코멘트 :이 TALON 바인딩 샘플 (그림 3B, 4 레인)에 해당합니다. 7. 정제 된 단백질의 용출 <ol><li> P5와 회전에서 5 분의 단백질 결합 TALON 수지를 품어00 버퍼 (500 MM의 이미 다졸의 최종 농도로 P5 버퍼). 버퍼 1:1 V / V의 구슬의 비율을 사용 (당신이 건조 구슬 200 μl를 촬영 한 경우 예를 들어, 당신은 P500의 200 μl를 추가해야합니다). 이 단계를 두 번 반복하고 개별적으로 각각의 용출 분획을 유지 (, 그림 (b), 5-7 차선), 용출 1 (E1)라는 이름의 용출 2 (E2 및 용출 3 (E3)). </li></ol> 의견 남은 비즈 용출 효율 (도 3b, 레인 8)의 분석에 이용 될 수있다. 전형적으로, 단백질 60 ~ 80 %가 전체에 용출된다. <ol start="2"><li> 쿠마시 블루 (그림 3B) 또는 시각화를위한 SYPRO 단백질 얼룩 SDS-PAGE와 얼룩에 표준 BSA 농도가 각 부분의 약 20 ~ 40 μl를로드하여 정제 된 단백질의 양과 질을 분석합니다. </li></ol> 코멘트 : 관심의 단백질은 또한 죽 검출 할 수있다항-GST 및 안티 그의 항체 (도 3C)를 이용하여 정제 절차 ughout. 8. 정제 된 단백질의 저장 <ol><li> 4 ℃에서 적절한 저장 버퍼에 대한 정제 된 단백질 (예를 들어, 20 mM 트리스 아세테이트 산도 8.0, 200 MM의 한국 공항 공사, 10 % 글리세롤, 1 mM의 EDTA, 0.5 mM의 DTT)을 Dialyze 그것은 투석 중에 정제 된 단백질의 침전을 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 교반 회전에서 4 ° C에서 1 시간 동안 2 배 dialyze. </li><li> 정제 된 단백질 (10 ~ 20 μL)의 작은 분취 량을 확인하고 30 분 동안 드라이 아이스에 냉동. -80 ° C에서 분취를 저장하고 여러 해동 / 냉동 사이클을 피할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

여기에 제시된 GST - 그의 정화 프로토콜은 재조합 단백질의 크기의 넓은 범위의 정화를 위해 적당하다 : 우리는 성공적으로 리 RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), 불안정한 고 분자량의 단백질을 정제 리 슈만 편모충의 infantum : 리튬 BRCA2 (125kDa) 6.9. 또한,이 프로토콜을 사용하여 정제 된 단백질은 6 생화학 적 활성했다. 이 방법의 성공은 전적으로 목적 단백질의 발현, 용해도 및 안정성에 따라 달라집니다. 이러한 E. 다른 호스트에있는 표현을위한 분자 생물학 벡터, 대장균이나 효모, 쉽게 널리 사용되는 GST와 그분의 태그를 사용하여 수정할 수 있습니다. 이것은 대부분의 분자 생물학 실험실에 대한 본 기술의 적용 및 비용 절감 효과를 강조한다. 장점의 다양한 recombinan에 ...

재조합 단백질의 정제는 생화학의 근본적인 문제를 해결하기 위해 매우 중요합니다. 이온 교환 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피와 같은 단백질 정제의 통상적 인 방법은 각각 같은 그것의 등전점과 충전 또는 크기와 같은 표적 단백질의 물리적 특성에 의존한다. 후자 단백질 특성은 상당히 통상적 인 단백질 정제 전략 단백질 오염의 기회를 증가 단백질의 다양성에 의해 공유된다. 이 문제는 시간 소모적이다 체류 정화 컬럼의 사용으로 피할 수있다. 동시에, 후자의 크로마토 그래피 방법은 고가의 실험 구성을 요구한다. 대부분의 경우 태그가 관심의 단백질에 고유하므로 선호도 태그 정화가 강하게 대상 특이성을 증가시킨다. 최근 연구에서, 플래그 또는 HA-친화력 정화 널리 사용되어왔다. 기존 REC 대조적하나의 태그가 사용되는 ombinant 단백질 정제 프로토콜은, 우리는이 태그의 고유 한 조합을 설립. 우리의 방법은 양 원하는 단백질의 순도 사이의 최적의 비율에 대한 관심의 단백질의 C-말단의 N-말단과 그의 태그에서 GST-태그의 융합을 포함한다. GST는 글루타티온 세 파로스 구슬 정화에 매우 효율적이다 긴 태그 (29 kDa의)입니다. 또한, GST를 사용하여 우리의 방법 1의 비용 효율성을 보장합니다. (두 아미노산의 첨가의 결과로 인식 서열 LeuGluValLeuPheGln / GlyPro 가진) PreScission 효소와 GST를 절단 할 수있는 가능성은 많은 장점을 가지고 예를 들어, 이러한 전략은 알로 스테 릭 장애물로 인해 생리적 단백질 기능의 변경을 방지한다. 다른 단백질 말단에 융합 작은 그의 태그는 벽개 GST를 씻어 내고,뿐만 아니라 분해 단백질 및 기타에 의해 단백질 순도를 증가시키기 위해 제 정제 공정에 제공<html> 오염 물질. 그의 정화 단계의 열 (TALON 수지)에 GST 전환 할 때 또한 프로토콜은 투석 단계가 필요하지 않습니다. 이러한 정제 과정에서 일반 오염 물질은 열 충격 단백질 (HSP)이다. MgCl2를 ATP와 함께 인큐베이션 단계의 첨가는 이러한 오염물을 제거 (도 1)을 허용한다. 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC) 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 관심의 정제 된 단백질의 높은 수율을 생성하기 위해 고가의 장비에 의존하는 일반적인 기술이다. 우리가 여기에 존재하는 배치 정화 프로토콜은, 대조적으로, 수동이며, 고가의 악기 설정을 필요로하지 않습니다. 단백질의 높은 수율이 프로토콜을 확장하여 도달 할 수 있습니다. 동시에 일괄 정제 프로토콜, 용출 부피는 FPLC 또는 HPLC와 관련되지 않은 단백질의 농도를 향상시키기 위해 조정될 수있다. ntent &quot;&gt; 또, 일괄 GST-그의 정제 프로토콜 ~ 10-300 kDa의의 크기 범위를 가진 단백질을 정제 할 수있다. 큰 장점 중 하나는 하나가 동시에 여러 단백질을 정제 할 수 있다는 사실에 의해 주어진다 예를 들어, 야생형과 돌연변이 단백질 둘. 제시된 프로토콜의 성공은 전적으로 그 단백질의 발현 수준과 용해도에 의존한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>E.Coli DH10Bac (competent)</td><td>Invitrogen</td> Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Invitrogen <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Solution I 및 II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco (Life)</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco (Life)</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 감염 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission 효소</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace의 감염 배지 보충</td><td>Gibco (Life)</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 특성</td>화 <td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>P/S (페니실린-스트렙토마이신)</td><td>Gibco (Life)</td> <td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온 세파로스 수지</td><td>GE bioscience</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 Roche</td><td></td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon 수지</td><td>클론텍</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>BioShop</td><td>288324</td> Gentamicin Gibco (Life)15710064 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>다클론 GST-항체</td><td>사내</td><td></td><td></td>생산</tr><tr><td>단클론 6X-His-항체</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer (tight)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Fisher dismembrator)</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis bag (50 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>2115217</tr></tbody></table>

gst - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

체외에서 단백질의 생화학 적 특성에 대한 효소 학의 핵심 분석은 그 정제 된 단백질의 높은 농도를 필요로. 단백질 정제 프로토콜은 효율, 단순성 및 비용 효율성을 배합 한 것이다. 여기에서, 우리는 N-말단 글루타티온 세 파로스 태그 (GST) 2,3 모두 융합 C-말단 10xHis 태그 4를 기반으로 재조합 단백질에 대한 새로운 소규모의 친화력 정화 시스템으로 GST - 그의 방법을 설명 관심의 단백질. 후자의 구조는 단백질 발현을위한 5 인 Sf9 감염된 세포의 감염을 위해, 배큘로 바이러스를 생성하는데 사용된다. GST는 정화 효율을 보장하는 역할을 다소 긴 태그 (29 kDa의)입니다. 그러나, 단백질의 생리 학적 성질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 후속 적으로 10 PreScission 효소를 사용하여 단백질을 분해한다. 최대 순도를 보장하고, 쪼개진 GST를 제거하기 위해 우리비교적 작은 그의 - 태그를 기반으로 두 번째 친 화성 정제 단계를 추가했습니다. 중요한 사실은, 우리의 기술이 따라서 저하 된 단백질을 제거하기위한 효과적인 도구이다 단백질의 양단 측면에 위치하고있는 두 개의 서로 다른 태그에 기초하고, 전장 단백질을 풍부. 여기에 제시된 방법은 FPLC 등 고가의 악기 설정을 필요로하지 않습니다. 또한, 우리는 열 충격 단백질 불순물과 핵산을 오염 폐지하는 핵산 분해 효소 처리를 제거하는 MgCl2를하고 ATP 세척을 통합. 요약하면, 플 랭킹이 다른 태그의 조합을 N-및 C-말단 및 태그 중 하나를 절단하는 기능을, 또한 고순도 및 전장 단백질의 회수를 보증한다.

GST-그의 정제 프로토콜의 효율을 예시하기 위해, 우리는 Rec14, S. 정제 32.9 kDa의의의 pombe 단백질. Rec14 cDNA를 각각 N-및 C-말단 (그림 1A)에서 GST - 그의 - 태그의 추가를 허용하는 우리의 수정 pFastBac1 벡터에 클로닝 하였다. 재조합 배큘로 바이러스는 다음 제조 및 단백질 발현을 위해 감염된 SF9 세포를 감염시키기 위해 사용되었다. 수용성 세포 용 해물은 GST 비즈 배양과 결합 - 단백질은 PreScission 프로테아제와 GST를 쪼개서 용출되었다. 그 결과 Rec14 - 그의 단백질은 TALON 수지와 결합 - 단백질 정제에 친 화성이 500 mM의 이미 다졸을 포함하는 TALON 버퍼로 용출했다. 정제 Rec14 - 그의이 저장 버퍼에 투석 및 -80 ° C (그림 1B)에 보관 하였다. Rec14 재조합 배큘로 바이러스,...

본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

다음 실험의 전체적인 목적은 고도로 정제된 전장 표적 단백질을 얻는 것입니다. 이를 위해 재조합 바오 바이러스(bao virus)를 제작하고, 이를 SF nine 곤충 세포에 감염시켜 고발현 및 수용성인 이중 태그 표적 단백질을 얻습니다. 이후 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferase) 태그 단백질 정제와 금속 친화성 크로마토그래피로 이어지는 2단계 친화성 정제를 수행합니다.정제 결과, 고순도의 히스티딘 태그 단백질을 얻을 수 있습니다. 다음으로, 보관 버퍼의 염 농도를 낮게 유지하기 위해 정제된 단백질 샘플을 투석합니다. SDS-PAGE 겔의 전체 단백질 염색을 통해 단백질의 발현 용해도, 양 및 품질을 확인한 결과를 얻습니다.우리는 PAL B two 및 BOC two와 같이 크고 불안정한 단백질을 정제하는 데 어려움을 겪으면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 따라서 단일 단계 친화성 정제와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 당사의 2단계 친화성 정제 프로토콜을 통해 얻은 단백질의 순도가 매우 높으며 일반적으로 분해 산물이 포함되어 있지 않다는 점입니다. 이 방법은 정제된 재조합 단백질의 생화학적 기능과 같이 단백질 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.본 프로토콜은 재조합 bao 바이러스의 생산으로 시작하며, 이어서 텍스트 프로토콜의 감염 섹션에 설명된 대로 가장 효율적인 BA 바이러스를 선별합니다. 500 mL의 배지에 0.75~1.0 × 10⁶개의 SF nine 세포가 포함된 스피너 배양 용기를 준비하며, 바이러스와 배지의 비율은 1:150으로 설정합니다. 스피너를 세포 배양 후드 안에 놓고, 스피너의 한쪽 암을 통해 필요한 부피의 baula 바이러스 현탁액을 세포 현탁액에 첨가하여 세포를 감염시킵니다.감염된 세포를 27 °C의 현탁 배양 상태로 성장시키고, 가장 효율적인 baculovirus를 선택할 때 결정된 최대 단백질 발현 시점에 세포를 수확합니다. 세포를 수확한 후, 프로테아제 억제제가 첨가된 약 20 mL의 GST 결합 버퍼를 사용하여 얼음물 배스(ice water bath) 내에서 목적 단백질을 발현하는 Sf9 세포를 용해합니다. 균질기(homogenizer)로 용액을 20회 통과시킨 후, 32초 동안 3회 초음파 처리(sonication)를 하고 다시 20회 통과시킵니다. 다음으로, 세포 용해물을 4 °C에서 18,000 RPM으로 30분간 원심 분리하여 상층액을 회수합니다. 수용성 세포 용해물을 미리 세척한 GST 비드 1 mL와 함께 4 °C에서 1시간 동안 완만하게 회전시키며 반응시킵니다.배양 시간은 단백질의 안정성과 결합 후의 결합 효율에 따라 최적화해야 합니다. 700 RPM에서 짧게 원심 분리하여 결합되지 않은 단백질이 포함된 상층액을 제거합니다. GST 세척 버퍼를 사용하여 GST 결합 단백질을 세척합니다.마지막 세척 후 이 과정을 두 번 더 반복하십시오. 상층액을 가능한 한 많이 제거합니다. 그 후, 인큐베이션 후 열충격 단백질(heat shock proteins)의 비특이적 결합을 방지하기 위해, GST 결합 버퍼 10 mL에 5 mM ATP와 15 mM 염화마그네슘을 첨가하여 비드를 4 °C에서 1시간 동안 인큐베이트하십시오.GST 세척 버퍼로 비즈를 3회 세척하십시오. GST 비즈를 원심 분리하고 상층액을 제거한 후, P five 버퍼로 GST 비즈를 세척하십시오. 그다음, GST 비즈를 100 microliters씩 분분하고, P five 버퍼 100 microliters에 희석한 4~8 units의 precision enzyme을 첨가하십시오.GST 비즈를 효소와 함께 4°C에서 완만한 회전 상태로 3시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 시간은 단백질의 분자량뿐만 아니라 절단 후의 안정성에 따라 최적화해야 합니다. 짧게 원심 분리하여 상층액을 수집합니다.비드에 P five buffer 100 µL를 추가합니다. 그 다음, 원심분리와 상층액 수집 과정을 두 번 반복합니다. 모든 분획물을 회수합니다.EIT를 1 mL씩 세 개의 분획으로 나누고, 각각에 미리 세척된 talon metal affinity resin dry beads 100 µL를 넣어 회전시키며 1시간 동안 배양합니다. 이때 용출액을 여러 분획으로 나누면 결합 및 세척 효율이 높아집니다. 그런 다음 4 °C에서 P 30 buffer를 사용하여 완만한 회전과 함께 5분 동안 레진을 세척합니다. 세척 과정을 두 번 더 반복한 후, 비드를 하나의 튜브에 모아 정제된 단백질을 용출합니다.단백질이 결합된 talon resin에 P 500 buffer를 추가합니다. buffer와 bead의 부피 비율을 1:1로 맞추어 추가합니다. 현탁액을 회전시키며 5분 동안 배양합니다.이 단계를 두 번 반복하십시오. 정제된 단백질을 저장하기 위해 용출된 각 분획을 분리하여 보관합니다. 단백질을 적절한 저장 버퍼에 넣고 4 °C에서 교반하며 1시간씩 두 번 투석하십시오.투석 과정 동안 정제된 단백질의 침전 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 정제된 단백질을 소량으로 분주하여 드라이아이스에서 30분 동안 급속 냉동시키십시오. 분주된 시료는 -80 °C에서 보관하며, 반복적인 해동 및 냉동 사이클을 피하십시오.각 분획의 약 20 to 40 µL를 SDS page gel에 로딩하여 정제 과정을 분석합니다. gel을 전기영동한 후 가시화를 위해 Coomassie blue 또는 단백질 염색약으로 염색합니다. REC 14 재조합 baculovirus에 감염된 SF nine 세포와 대조군으로 사용된 mock 감염 세포의 가용성 및 전체 세포 용해물을 Coomassie blue 염색으로 분석하여, 정제 과정 중 GST-RE14-His 단백질의 발현을 확인하였습니다. 해당 방법의 효율성을 추적하기 위해 다수의 샘플을 Coomassie Blue로 분석하였습니다.염색 결과, 정제 첫 번째 단계에서 GST Rec 14가 GST 비드에 정확하게 결합되었음을 보여주며, GST와 rec 14의 융합으로 인해 약 50 kilodaltons의 겉보기 분자량을 나타냈습니다. G-S-T-G-S-T 부위의 정밀 절단 후, 유리된 rec 14 hiss는 약 37 kilodaltons 부근에서 이동합니다. 절단된 GST는 GST 비드에서 시각화할 수 있으며, 일부 유리된 REC 14가 여전히 GST 비드에 결합되어 있음에도 불구하고 REC 14 hiss의 현저한 농축이 이루어졌습니다. 이 단계는 정밀 프로테아제와 단백질의 배양 시간을 늘림으로써 개선될 수 있습니다. GST 정제 단계 이후 용출된 단백질과 비교하여 Talon 비드에 결합된 REC 14 hiss의 정밀 프로테아제 분석 결과, REC 14 hiss의 상당 부분이 Talon 비드에 결합되어 있음을 보여줍니다.수차례 세척 후, REC 14 hiss를 용출하여 수집하였으며, 총 3회의 용출을 수행하였습니다. 분석 결과 REC 14 hiss의 높은 순도가 확인되었으며, 용출 분획과 비드(beads)를 비교한 첫 번째 용출 단계에서 REC 14 hiss의 농도가 가장 높게 나타나 용출 효율이 입증되었습니다. 이는 비드에 결합된 채로 검출된 REC 14 hiss가 거의 없었기 때문입니다.REC 14을 추적하기 위해 이 샘플들에 대해 anti GST 및 anti hiss 항체를 이용한 Western blot 분석을 수행하였습니다. 전체 과정 동안, anti GST blot은 GST 정제 단계에서 언급된 단백질들에 일부 GST-REC 14와 GST 단독 성분이 존재했음을 보여주며, hiss tag 친화성 정제 단계를 통해 오염 물질들이 제거되었음을 보여줍니다. 이 blot은 정밀 처리와 hiss tag 정제 단계를 통해 REC 14에서 GST가 효율적으로 제거되었음을 나타냅니다.anti-His 블롯은 Rec 14를 검출하는 것을 목표로 합니다. 이 블롯은 GST-Rec 14-His 및 REC 14-His가 GST 비드에서 완전히 절단되어 제거되지 않았음을 확인해 줍니다. 또한, 고농도에서 REC 14는 응집되는 것으로 보입니다.요약하자면, 제시된 결과는 S palm B rec 14 정제를 위한 GST hiss 정제의 효율성을 입증합니다. 이 영상을 시청한 후에는 고도로 정제된 재조합 단백질을 회수하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 이를 숙달하여 활용할 수 있을 것입니다.이 기술은 적절하게 수행될 경우 가용성 ly acid의 변성 후 12시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 단백질 분해를 방지하기 위해 신속하게 작업하고 엄격하게 4 °C를 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에, 단백질 파트너의 확인이나 관심 단백질의 번역 후 변형과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 공침 강정 분석이나 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.본 연구에서는 이 방법을 DNA 복구 단백질에 사용하였으나, 다른 연구 분야의 단백질 기능을 연구하기 위해 이 전략을 수정하여 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단백질 전달은 세포에 생물학적으로 활성화된 단백질의 직접 배달을 수 있습니다. 이러한 DNA의 transfection 또는 바이러스성 도입으로 종래의 방법과는 달리이 비침습 패러다임은 세포 독성 및 영구 유전자 조작에 의해 종양 발생 변화의 위험을 우회 titratable 방식으로 고효율 세포 조작이 가능합니다.

공학 세포 투과 단백질

여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을...

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

소설과 고효율 두 단계 친화도 크로마 토그래피 프로토콜이 개발되었고 자세하게 설명되어 있습니다. 방법은 두 개의 본질적 동질성과 작은 정화 태그를 기반으로하고 다른 특성을 가진 대상 단백질의 다양한 적용됩니다.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

우리는 액체 처리 로봇을 사용하여 재조합 단백질의 친 화성 태그 정화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 일반적으로 높은 처리량 형식에 용해 그의 태그 단백질의 작은 규모의 정화에 적용됩니다.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

출처: Becker, B. 외 효모에서 리신 독소 A 사슬(RTA) 수송에 필요한 세포 구성 요소를 규명하기 위한 간단한 형광 기반 리포터 검사법. J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 니켈 기반 친화성 크로마토그래피를 이용해 폴리히스티딘 표지된 재조합 단백질을 정제하는 과정을 보여줍니다. 이 연구는 초음파 검사를 통한 박테리아 용해, 용해액의 정화 및 여과, 그리고 이미다졸을 이용한 표적 단백질의 선택적 결합 및 용출 등 주요 단계를 설명합니다.

 재조합 박테리아 단백질 정제를 위한 친화 크로마토그래피 기법

이 비디오에서는 클로스트리듐 디피실리 박테리아에서 히스티딘 태그가 지정된 피로포스포키나제 효소를 정제하는 니켈 친화성 크로마토그래피 기술을 보여줍니다.

니켈 친화성 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 박테리아 세포 용해물에서 폴리히스티딘 표지 재조합 단백질을 정제하는 기술

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

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GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

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