GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

다음 실험의 전반적인 목표는 고도로 정제된 전체 길이 관심 단백질을 얻는 것입니다. 이는 재조합 바오 바이러스를 생성함으로써 달성되며, 이 바이러스는 SF 9개의 곤충 세포를 감염시켜 고도로 발현되고 용해되는 2개의 태그 된 단백질 버전을 얻는 데 사용됩니다. 그런 다음 글루타티온, 혈청 태그 단백질의 정제를 특징으로 하는 2단계 친화성 정제를 수행한 다음 금속 친화성 크로마토그래피를 수행합니다.

정제 결과는 고순도 히스티딘 태그가 붙은 단백질입니다. 다음으로, 정제된 단백질 샘플은 저장 완충액의 낮은 염 농도를 보장하기 위해 투석됩니다. SDS 페이지 젤의 전체적인 단백질 염색에 근거를 둔 단백질의 표정 가용성, 양 및 질을 보여주는 결과는 얻어진다.

이 방법에 대한 아이디어는 PAL B 2 및 BOC 2와 같은 크고 불안정한 단백질을 정제하는 데 문제가 있었을 때 처음 떠올랐습니다. 따라서 1단계 친화성 정제와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 2단계 친화성 정제 프로토콜에서 얻은 단백질이 매우 순수하고 일반적으로 분해 생성물이 없다는 것입니다. 이 방법은 정제된 재조합 단백질의 생화학적 기능과 같은 단백질 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 프로토콜은 재조합 bao 바이러스를 생산하는 것으로 시작하여 감염을 위한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 가장 효율적인 BA 바이러스를 선택합니다. 바이러스와 배지 사이의 비율이 1:150인 500ml의 배지에 있는 6개의 SF 9개 세포에 대해 0.75 - 1.0 곱하기 10을 포함하는 스피너 배양 용기를 준비합니다. 세포 배양 후드 아래에 스피너를 놓고 스피너의 한쪽 팔을 통해 세포 현탁액에 필요한 양의 baula 바이러스 현탁액을 추가하여 세포를 감염시킵니다.

감염된 세포를 섭씨 27도에서 현탁액으로 성장시키고 가장 효율적인 황반 바이러스를 선택할 때 결정되는 최대 단백질 발현에 도달하면 세포를 수확합니다. 세포를 수확한 후, 약 20ml의 GST 결합 완충액에서 관심 단백질을 발현하는 9개의 세포를 얼음물 수조에서 프로테아제 억제제로 보충합니다. 아래로 균질화기를 가진 해결책 20 시간의 아래 그 후에 다시 20 시간 춤추기 전에 3 32번째 주기 동안 sonicate, 18에 세포 용해물을 원심 분리하십시오, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 분당 회전수를 유지하고 온화한 교체의 밑에 4 섭씨 온도에 1 시간 동안 전 세척한 GST 구슬의 1 밀리리터를 가진 녹는 세포 lysate를 지키십시오.

배양 시간은 pro의 안정성과 결합 후 결합 효율에 따라 최적화되어야 합니다. 700RPM에서 빠르게 회전하고 결합되지 않은 단백질을 포함하는 상등액을 제거합니다. GST 결합 단백질을 GST 세척 버퍼로 세척합니다.

마지막 세탁 후 이 과정을 두 번 반복합니다. 가능한 한 많은 상층액을 제거하십시오. 그런 다음 배양 후 열 충격 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해 섭씨 4도에서 1시간 동안 GST 결합 완충액 10ml에 5밀리몰 A TP 및 15밀리몰 염화마그네슘으로 비드를 배양합니다.

GST 세척 버퍼로 구슬을 세 번 씻으십시오. GST 비드를 원심 분리하고 상등액을 제거한 후 GST 비드를 P 5 버퍼로 세척합니다. 다음으로, GST 비드를 나누고, 100 마이크로 리터의 위반 사항을 P 5 완충액 100 마이크로 리터에 희석 한 정밀 효소 4-8 단위를 첨가한다.

GST 비드를 부드럽게 회전시키면서 섭씨 4도에서 3시간에서 하룻밤 동안 효소로 배양합니다. 배양 시간은 분자량과 단백질 Following cleavage의 안정성에 따라 최적화되어야 합니다. 빠르게 회전하고 상층액을 수집합니다.

비드에 100마이크로리터의 P 5 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 반복하고, 회전하고, 상층액 수집을 두 번 수행합니다. 모든 분수를 당깁니다.

EIT를 1밀리리터의 3개 분획으로 나누고 각각 100마이크로리터의 사전 세척된 탈론 금속 친화성 수지 건조 비드를 1시간 동안 회전하여 배양하고 용출액을 여러 분획으로 나누어 결합 및 세척 효율을 높입니다. 그런 다음 P30 버퍼로 섭씨 4도에서 부드럽게 회전하면서 수지를 5분 동안 세척합니다. 세척을 두 번 반복한 후 단일 튜브의 비드를 당겨 정제된 단백질을 용리시킵니다.

단백질 결합 탈론 수지에 P 500 버퍼를 추가합니다. 1:1 부피의 버퍼 대 비드 비율을 추가합니다. 음량. 교대로 5분 동안 서스펜션을 배양합니다.

이 단계를 두 번 반복합니다. 정제된 단백질의 저장을 위해 각 회피된 분획을 별도로 유지합니다. 적절한 저장 버퍼에 단백질을 2회 투석하고, 교반 상태에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 투

투석 중 정제된 단백질의 침전을 확인하는 것이 중요합니다. 정제된 단백질을 소량 분취하고 드라이아이스에서 30분 동안 얼립니다. 부분 표본을 섭씨 영하 80도에서 보관하고 많은 해동 동결 주기를 피하십시오.

약 20 - 40 마이크로리터의 각 분획을 SDS 페이지 겔에 로딩하여 정제 과정을 분석합니다. 시각화를 위해 kumasi blue 또는 protein stain으로 겔 염색을 실행한 후, 대조군으로 REC 14 재조합 valo 바이러스 또는 mock에 감염된 SF 9 세포의 용해성 및 총 세포 용해물을 Kumasi blue staining에 의해 분석하여 정제 과정에서 GST re14 his 단백질의 발현을 확인할 수 있었습니다. kumasi Blue에 의한 이러한 샘플의 방법 분석의 효율성을 따르기 위해 많은 샘플을 분석했습니다.

염색은 정제의 첫 번째 단계에서 GST Rec 14가 G-S-T-G-S-T와의 정밀 절단 후 rec 14와 GST의 융합으로 인해 약 50킬로달톤의 겉보기 분자량을 가진 GST 비드에 올바르게 결합되었음을 보여주며, 자유 rec 14 히스는 약 37킬로달톤으로 이동합니다. 절단된 GST는 GST 비드에서 시각화할 수 있지만, GST free REC 14의 일부가 여전히 GST 비드에 결합된 상태로 남아 있음에도 불구하고 REC 14 히스의 현저한 농축이 달성되었습니다. 이 단계는 GST 정제 단계에서 REC 14 히스의 큰 부분이 탈론 비드에 결합되어 있음을 보여준 후 언급된 단백질과 비교하여 Talon 비드에 결합된 REC 14 히스의 정밀 프로테아제 분석으로 단백질의 배양 시간을 증가시킴으로써 개선될 수 있습니다.

몇 번의 세척 후, REC 14 쉿 소리를 피하고 수집하여 세 가지 환상을 수행했습니다. 분석 결과, Ellucian이 착시의 효율성을 설명한 후 탈곡 구슬에 대한 회피된 분획의 첫 번째 Ellucian 비교에서 rec 14 hiss의 높은 순도와 rec 14 hiss의 가장 큰 농도가 나타났습니다. rec 14가 거의 없기 때문에 쉿 소리가 비드에 결합된 것으로 감지될 수 있습니다.

이 샘플은 또한 REC 14를 따르기 위해 항 GST 및 항 히스 항체를 사용한 서양 혈액 분석을 받았습니다. 절차 전반에 걸쳐 anti GST 블롯은 GST 정제 단계에서 암시된 단백질에 일부 GS TRE 14 및 GST만 존재하고 오염 물질이 히스 태그 친화성 정제 단계에 의해 제거되었음을 보여줍니다. 이 블롯은 GST가 정밀 처리 및 히스 태그 정제 단계에 의해 re14에서 효율적으로 제거되었음을 나타냅니다.

쉿 소리 방지 블롯은 re 14를 감지하는 것을 목표로 합니다. 이 블롯은 GST Rec 14 히스 및 REC 14 히스가 GST 비드에서 완전히 절단되어 제거되지 않았음을 확인합니다. 더욱이, 고농도에서 REC 14는 응집되는 것으로 보인다.

요약하면, 제시된 결과는 S palm B rec 14의 정화를 위한 GST 히스 정화의 효율성을 보여줍니다. 이 동영상을 시청하고 나면 매우 아름다운 에너지를 회복하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 조합 단백질 일단 마스터.

이 기술은 적절하게 수행되면 용해성 산의 변성 후 12 시간 이내에 수행 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 단백질 분해를 방지하기 위해 섭씨 4도에서 빠르고 엄격하게 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 코드 침전 분석 또는 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 단백질 파트너 식별 또는 관심 단백질의 번역 후 변형과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

우리는 DNA에 대해 이 방법을 사용하지만, 다른 연구 분야에서 단백질의 기능을 연구하기 위해 복구 단백질 전략을 수정할 수 있습니다.