탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생물물리학 연구에 적합한 품질의 천연 고분자 복합체를 정제하는 것입니다. 이 프로토콜은 복합체를 정제하는 방법일 뿐만 아니라 정제 중 샘플의 구조적 품질을 평가하기 위한 자세한 가이드 역할을 합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 조성 균질성을 보장하기 위해 생리학적 완충액에 가까운 조건에서 천연 어셈블리를 간단하고 빠르게 정제할 수 있다는 것입니다.

S.cerevisiae 세포를 원심분리하고 텍스트 프로토콜에 따라 상층액을 디캔팅한 후 2ml의 냉각 용해 완충액을 추가하고 10ml 혈청 피펫을 휘젓거나 사용하여 펠릿을 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 보관된 빈 50ml 원추형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 추가로 2ml의 냉각 용해 버퍼를 사용하여 각 원심분리기 병을 세척하고 용액을 50ml 튜브에 추가합니다.

셀 펠릿의 습윤 중량을 측정한 후 50ml 원추형 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 내부 및 그 주변에 액체 질소 수조를 만듭니다. 다음으로, 부유 세포를 5ml 주사기에 끌어당기고 16 게이지 바늘을 주사기에 연결합니다. 그런 다음 주사기와 바늘을 통해 분당 약 1ml의 속도로 수조에 통과시켜 세포 현탁액을 동결시켜 액적을 생성합니다.

효모 세포를 용해하려면 먼저 액체 질소를 사용하여 커피 그라인더를 미리 냉각하십시오. 그런 다음 최대 40g의 효모 세포를 넣고 25초 동안 분쇄하면서 8회 또는 9회 분쇄를 반복합니다. 한 번에 10리터 이상의 세포 배양을 정제하지 않는 것이 좋습니다.

이를 통해 정화 시간을 최소화하고 복합체의 구조적 무결성이 유지되도록 할 수 있습니다. 두 번의 연삭 후마다 그라인더에 얕은 액체 질소 층을 추가하고 증발시키십시오. 세포가 뭉치는 것을 방지하려면 액체 질소 냉각 주걱을 사용하여 세포를 저어줌으로써 세포가 해동되는 것을 방지하십시오.

용해 후 세포는 미세한 백색 분말로 나타나야 합니다. 세포 용해를 확인하고 텍스트 프로토콜에 따라 PMSF, DTT 및 프로테아제 억제제로 용해 완충액을 준비한 후 액체 질소 냉각 주걱을 사용하여 동결된 용해된 세포 분말을 준비된 완충액의 50ml 튜브에 점진적으로 퍼냅니다. 증분이 추가될 때마다 실온에서 50ml 튜브를 부드럽게 회전시켜 세포를 해동 및 용해시키고 기포가 형성되는 것을 방지합니다.

세포가 용해되면 더 많은 세포 분말을 추가하십시오. 모든 세포를 추가한 후 튜브에서 동결된 세포 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 세포를 계속 해동하고 용해합니다. 이 작업은 약 50분 정도 소요됩니다.

다음으로, 25, 000 시간 g 및 20 분 동안 4 섭씨 온도에 세포 용해물을 원심 분리하십시오. 세포가 용해되고 원심분리 후 불용성 펠릿에서 작은 어두운 층을 관찰할 수 있습니다. 상층액을 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브로 옮기고 각 전체 튜브에 10마이크로리터의 200밀리몰 PMSF를 추가합니다.

100개의, 000배 g 및 1 시간 동안 4 섭씨 온도에 표본을 원심 분리하십시오. 스핀이 끝나면 4개의 레이어가 보여야 합니다. 대부분 리보솜 복합체를 함유하는 단단하고 투명한 펠릿; 부드러운 지질이 풍부한 펠릿; 세포의 용해성 단백질과 복합체의 대부분을 포함하는 크고 투명하며 노란색을 띤 층; 및 지질로 구성된 비늘 모양의 상층.

섭씨 4도의 추운 방에서 1ml 피펫을 사용하여 상단 비늘 모양의 지질층을 최대한 많이 제거하고 폐기합니다. 10ml 혈청학적 피펫을 사용하여 투명한 노란색 층의 대부분을 회수합니다. 그런 다음 1 밀리리터 피펫을 사용하여 아래쪽 두 층을 방해하지 않도록이 층의 마지막 몇 밀리리터를 복구하십시오.

일반적으로 40g의 습식 세포 펠릿에서 약 48ml의 중간층이 회수됩니다. 텍스트 프로토콜에 따라 IgG 세파로스를 준비한 후, IGG 수지를 중간 단계 상등액과 세포 40g당 미니 프로테아제 억제제 정제 2정과 결합합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 회전기에 올려 2시간 동안 놓습니다.

이것이 IgG 배치 솔루션입니다. 평평한 개구부를 만들기 위해 컬럼의 끝을 절단하여 두 개의 10ml 폴리프렙 컬럼을 준비합니다. 24ml의 현탁액 IgG 수지 슬러리 또는 배치 용액을 각 컬럼에 붓고 중력에 의해 침전되도록 합니다.

이는 200마이크로리터의 충전된 IgG 수지에 해당합니다. 침강이 30분 이상 걸리면 중간 단계가 지질에 의해 오염되었을 수 있습니다. 침전이 완료되면 10ml 용량의 IgG D150 버퍼를 4회 연속 사용하여 패킹된 컬럼을 세척합니다.

컬럼에서 담배 에칭 바이러스 또는 TEV 프로테아제 절단을 수행하려면 컬럼 바닥을 밀봉하고 1ml의 IgG D150 버퍼와 100마이크로리터의 TEV 프로테아제를 추가합니다. 컬럼 상단을 밀봉하고 750RPM과 섭씨 18도의 열 혼합기를 사용하여 20분 동안 혼합합니다. 레진을 다시 현탁시키고 20분 동안 다시 혼합합니다.

그런 다음 다시 일시 중단하고 20분 믹싱을 세 번째로 반복합니다. 컬럼을 섭씨 4도로 되돌리고 중력을 사용하여 단백질 복합체를 용리시킵니다. 그런 다음 200마이크로리터의 IgG D150을 첨가하여 데드 볼륨을 용리합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 칼모듈린 친화성 수지를 준비한 후, 칼모듈린 결합 완충액과 샘플을 수지에 첨가하고 튜브 로테이터를 사용하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 칼모듈린 슬러리 100마이크로리터당 2mL의 폴리프렙 컬럼을 준비하기 위해 컬럼의 끝을 절단하여 평평한 개구부를 만듭니다. 이 프로토콜은 복합체를 집중적으로 유지하고 수지 체류 시간을 최소화하기 위해 선택된 특정 완충액 및 체류 부피를 자세히 설명합니다.

culture volume이 변경되는 경우 변화를 고려하여 gravity columns, resin 및 buffer volume을 변경하는 것이 좋습니다. 컬럼을 100마이크로리터 이하의 칼모듈린 슬러리로 채우고 중력에 따라 5ml의 칼모듈린 결합 버퍼를 사용하여 수지를 세 번 세척합니다. 200마이크로리터의 칼모듈린 용출 완충액을 사용하여 단백질을 3회 용리합니다.

그런 다음 컬럼 바닥을 밀봉하고 20마이크로리터의 용리 완충액을 추가하고 2.5분 동안 배양한 후 밀봉을 해제하고 단백질이 중력에 의해 용리되도록 합니다. 컬럼 바닥을 다시 밀봉하고 5분 동안 배양하기 전에 200마이크로리터의 용리 완충액을 추가합니다. 그런 다음 컬럼 바닥의 밀봉을 풀고 용액을 용리합니다.

여섯 번째이자 마지막 용리를 위해 컬럼 바닥을 밀봉하고 용리 버퍼로 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 밀봉을 풀고 용출합니다. 정제 후 분석을 수행하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 보관합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 발표된 프로토콜에 따라 복합체의 초기 TAP 정제는 은 염색 겔에서 3개의 띠로 이동하는 복합체를 생성했습니다. TAP 방법을 여러 차례에 걸쳐 최적화하면 네이티브 겔에서 단일 띠로 마이그레이션된 복합체를 얻을 수 있으며, 이는 보다 균질한 어셈블리를 나타냅니다. native gel 결과와 일치하게, 발표된 프로토콜에 따라 정제된 복합체에 대해 TAP 항체를 사용한 western blotting은 TAP 태그 단백질인 SNU-71의 단백질 가수 분해를 검출했습니다.

U1 snRNP 복합체에 있는 17개의 단백질 중 거의 모두가 SDS-PAGE에 의해 분해되고 다중 질량 분석법으로 확실하게 확인되었기 때문에 TAP 방법의 수정은 단백질 분해의 양을 크게 줄였습니다. 음성 염색 전자 현미경은 TAP의 첫 번째 및 두 번째 단계 후 성공적인 정제로 인한 단분산 입자를 보여줍니다. 대조적으로, 정제가 실패할 때 올바른 크기의 입자가 관찰되지 않습니다.

최종 복합 품질은 negative stain EM raw 이미지에서 단분산된 것처럼 보이는 여기에 표시된 정제된 입자의 잔디밭에서 평가되었습니다. 또한 입자의 등급 평균은 샘플이 구조 연구에 적합할 수 있음을 나타내는 뚜렷한 특징을 나타냅니다. 일단 마스터되면 이 프로토콜은 동결된 용해된 세포 분말을 해동한 후 10-12시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 프로토콜을 따르는 동안 모든 용액에 프로테아제와 뉴클레아제가 없는지 확인하고 복합체의 응집 또는 해리를 방지하기 위해 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 구조 연구에 적합한 품질의 천연 복합체를 정제하는 방법과 이것이 달성되었는지 평가하는 방법을 이해해야 합니다.