Name: 탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 학습하세요 탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 S. cerevisiae에서 기본 공단을 정화하고 구조 연구에 적합한 샘플 품질을 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 생리학적 버퍼 조건에서 신속하게 정화하여 구성 균질성을 보장합니다.

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저자는 니콜라우스 그리고리에프의 지원과 조언에 감사하고 있습니다. 유용한 토론과 EM 안내에 대해 Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu 및 Mike Rigney에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 자금 지원을 받았으며, Award No. 1157892. Brandeis EM 시설은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 P01 GM62580의 지원을 받습니다.

참고 : 다음 프로토콜 세포 배양의 4 L, 세포의 약 40g 습 중량에서 복잡한의 정제를 위해 고안되었다. 일단 준비, 모든 버퍼가 4 ° C에서 보관 및 준비 개월 이내에 사용해야합니다. 환원제와 단백질 분해 효소 억제제는 사용하기 직전에 버퍼에 추가됩니다. 탠덤 선호도 정화에 대한 전체 세포 추출물 1. 준비 <ol><li> S.의 성장 cerevisiae의 세포 <ol><li> 킬 원하는 TAP는 S. 태그 cerevisiae의 변형 스토리지에서 (-80 ° C) 효모 펩톤 덱 스트로스 상 (YPD) 판. 효모 세포는 흰색 털이 나타날 때까지 5 일 (30 ° C를) - 3 품어. </li><li> 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 10 ml의 YPD 매체로 판에서 신선한 세포의 약 2mm 2의 행진을 접종한다. 분당 180 회전 수 (rpm) 하룻밤 (° C ~ 30m)에서 튜브를 흔들어. </li><li> 오버 2 ㎖를 접종2 L의 삼각 또는 삼각 플라스크에 YPD 매체의 리터당 밤 문화. 180 rpm으로 (30 °에 C)에서 흔들어. 24 시간 - 늦은 로그 단계까지 2-1.8의 OD (600), 일반적으로 20을 600 nm의 (OD 600)의 광학 밀도에서 세포의 성장을 모니터링합니다. </li></ol></li><li> 수확 S. cerevisiae의 세포 <ol><li> 원심 분리하여 수확 세포 15 분 (4 °에 C)에 대한 5,400 XG에. </li><li> 빨리 뜨는을 가만히 따르다 4 ° C 또는 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> 용해 완충액 차가워 2 mL를 세포 펠렛 각각 리터 일시 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 300 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 0.2 mM의 EDTA, pH가 8.0, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8.0, 10 % 글리세롤; 0.1 % v / V를 NP-40). 소용돌이 및 / 또는 반복 피펫은 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 세포를 일시 중단합니다. 참고 : NP-40의 중요성은 복잡한 품질 및 사후 정화 분석이 아래에 설명되어 관련이있다. </li><li> 빈 50 ml의 원추형 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브 (K)에 세포 현탁액을 전송얼음에 EPT. 냉각 용해 버퍼의 추가로 2 ㎖로 각각의 원심 분리기 병을 세척하고 50 ML 튜브에 세포 현탁액에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 튜브를 칭량 빈 튜브의 중량을 감산뿐만 아니라 가산 용해 완충액으로 세포 펠렛의 습윤 중량을 결정한다. 참고 : OD 1.8 (600)을 갖는 세포 배양의 리터가 약 10 g이다. </li><li> 50 ML 원뿔 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 액체 질소 목욕을 만듭니다. 5 ML의 주사기에 현탁 세포를 그립니다. 주사기로 16 G 바늘을 연결합니다. 셀 생성하는 주사기 / 바늘을 통과시켜 세포 현탁액을 정지 &quot;액적.&quot; 동결의 비율은 약 1 분 / ㎖해야합니다. </li><li> 냉동 세포 방울을 저장 (-80 ° C) 또는 용해를 진행합니다. </li></ol></li><li> 용균 세포와 해물 대한 설명 <ol><li> 를 Lyse 커피 분쇄기를 사용하여 효모 세포. 는 C를 흔들어 섞으면 서 25 초, 버스트 연삭과를 Lyse 세포 여덟 아홉 배offee 분쇄기입니다. 사용하기 전에, 액체 질소로 커피 분쇄기 미리 차게. 연삭의 모든 두 라운드는 분쇄기에 액체 질소의 얕은 층을 추가하고이 증발 할 수 있습니다. </li><li> 응집으로부터 세포를 유지하기 위해 필요에 따라 액체 질소 냉각 주걱으로 교반 하였다. 세포 응집을 초래할 수 세포의 해동을 방지하기 위해주의하십시오. 세포 용해 다음과 같은 미세한 백색 분말로 나타납니다. 효모 배양 (~ 40g)의 4 L의 최대 세포 펠릿은 시간에 접지 될 수있다. 참고 : 용해 방법에 대한 관찰은 아래에 설명되어 있습니다. </li><li> 혈구 세포 또는 다른 계산 방법을 이용하여 세포 용해의 정도를 평가한다. 적절한 분석을 제공하기 위해, 다음 샘플을 (1) 용해 전; (2) 용해 네 라운드 후; 및 (3)의 용해를 수행. 이러한 샘플을 확인하려면, 1.5 ML 튜브에 액체 질소 냉각 주걱과 장소 세포의 작은 금액을 가져 가라. </li><li> 세포의 세포를 해동되면, 피펫 5 μL495 ㎕의 물을 섞는다. 40 경우 - 세포의 60 % 용해가 관찰, 프로토콜의 다음 단계로 진행합니다. 참고 : 용해 장기간의 효과에 대한 관찰은 아래에 설명되어 있습니다. </li><li> 일단 적절한 용해가 관찰, 저장 용해 세포 (-80 ° C) 또는 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 1mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 프로테아제 억제제의 칵테일 포함 시판 15 ml의 용해 완충액으로 각이 50 ml의 원추형 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브를 준비한다. 주 : 단백질 분해에 중요한 관찰되면, 프로테아제 결핍 균주의 사용을 고려한다. </li><li> 준비된 50 ㎖ 튜브에 고정 된 용해 세포 분말을 퍼하기 위해 액체 질소 냉각 주걱을 사용합니다. 환원제 및 프로테아제 억제제 (들) 모두를 함유하는 용해 버퍼 점진적 고체 전지 분말을 추가 /. </li><li> 해동로 / 형성되는 거품을 방지 할 세포를 용해하지만, 그래서 부드럽게 RT에서 50 ㎖ 튜브를 회전합니다. 에이셀 분말 / 고체 용해가 추가 세포를 고체 / 분말을 추가에요. </li><li> 각각 약 20 세포의 g 또는 추가 된 모든 셀이 될 때까지이 50 ㎖ 튜브를 각각 입력합니다. 50 ml의 튜브에서 관찰 동결 된 세포 덩어리가 없을 때까지 해동 / 용해를 계속합니다. 이 약 50 분 소요됩니다. </li><li> 25,000 XG (4 ℃)에서 20 분 동안 현탁 된 세포 용 해물을 원심 분리기. 잘 용해 세포 흑색 침전물을 소량을 나타낼 수있다. </li><li> 초 원심 분리기 튜브 (사용 26.3 ml의 튜브) 폴리 카보네이트와 각 전체 튜브에 10 ㎕의 200 mM의 PMSF를 추가하는 상층 액의 50 ㎖를 전송합니다. </li><li> 100,000 XG (4 °에 C)에서 1 시간 동안 원심 분리기. 4 층은 아래에서 위로, 볼 수 있어야합니다 : (1) 하드 명확한 펠렛, 리보솜 복합체를 함유 (2) 소프트 지질 과다 펠렛; (3) 세포의 가용성 단백질 및 복합체의 대부분을 함유하는 큰 투명한 황색 띤 층; 및 (4) &#39;비늘&#39;상층 지질 이루어지는. </li><li> 모든의를 수행추운 방 (4 ° C)에서 ubsequent 단계. 1 ml를 피펫을 사용하여 가능한 한 최고 &#39;비늘&#39;지질 층의 정도를 제거하고 폐기합니다. 옐로우, 클리어 층의 대부분을 복구하는 데 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. </li><li> 아래 두 층을 방해하지 않도록하기 위해 1 ML의 피펫을 사용하여이 계층의 마지막 몇 mL로 복구 할 수 있습니다. 40g 습윤 세포 펠릿에서 중간층의 약 48 ml의 통상적 회수 및 지방층 8 ml를 폐기 / 제거. 주 : 칼럼 정제 흐름이 크게 후술 또한 복합체의 품질이 저하 될 수 지질의 존재에 의해 방해된다. </li></ol></li></ol> 2. 열 정제 단계 1 : IgG의 크로마토 그래피 <ol><li> 수지 평형 및 바인딩 <ol><li> 세포 펠렛 40 g을하는 300 μL의 IgG 세 파로스 슬러리를 준비한다. 슬러리 피펫을 용이하게하기 위해 1 ml의 피펫 팁의 끝 부분을 잘라. 워시 / 5 ml의 IgGD150 Buffe와 IgG의 수지 세 번, 매번 평형R (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 150 mM의 NaCl을 150 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 0.1 % V / V의 NP-40 1 mM의 DTT 50 당 단백질 분해 효소 억제제 태블릿 ML의 볼륨). <ol><li> 스핀은 세척 사이 160 XG (4 °에 C)에서 펠렛과 뜨는을 제거합니다. </li></ol></li><li> 2 시간 (4 °에 C)에 대한 적절한 회전을 사용하여, 중간 단계의 상층 액과 세포의 40g 당 두 개의 미니 프로테아제 억제제 정제와 IgG의 수지를 돌립니다. 이 배치의 IgG 용액이다. </li><li> 평면 컷을 생성하기 위해 컬럼의 끝을 절단하여 사용이 10 ml의 폴리 준비 열을 준비합니다. 중력 흐름에 의한 열의 포장 및 세척을 촉진하기 위해, ~ 10 ml의 컬럼 당 IgG에 배치 용액 25 ml에 200 포장의 IgG 수지의 μL 또는 최대로드합니다. </li><li> 열로 IgG를 배치 솔루션을 붓고 중력에 의해 침전 할 수 있습니다. 침전이 30 분보다 더 오래 걸리는 경우 원심 분리기 t에서 중간 단계를 복구 할 때, 가장 가능성이 지질 오염을 발생했습니다ubes. </li><li> IgGD150 버퍼의 네 개의 연속 10 ml의 볼륨으로 충전 탑을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 열 TEV 절단에 <ol><li> 칼럼의 바닥을 밀봉 IgGD150 버퍼 1 mL 및 TEV 프로테아제 100 ㎕ 추가 (0.6 ㎎ / ㎖ 주식을, TEV의 돌연변이 변종 S219V는 자체 생산). 칼럼의 상단을 밀봉하고 20 분 (18 ° C를) 750 rpm으로 진탕, 열 믹서를 사용하여 혼합한다. 재현 탁 수지는 1 시간 배양 총 반복, 20 분 동안 다시 한 번 더 혼합. 참고 : 최소 배양 시간을 유지하는 것이 중요하다. </li><li> 4 ° C에 열을 반환하고 중력에 의해 단백질 / 복합을 용출. IgGD150 버퍼의 추가 200 μL와 죽은 볼륨을 용출. </li></ol></li></ol> 3. 칼럼 정제 단계 2 : 칼 모듈 린 친 화성 크로마토 그래피 <ol><li> 수지 평형 및 바인딩 <ol><li> 셀의 40g 당 칼 모듈 린 친 화성 수지의 200 μl를 준비작은 공. 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 5 ml의 칼 모듈 린은 버퍼 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0 바인딩과 수지 세 번, 매번 세척 1 ㎜의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 2 mM의 CaCl2를 0.1 % v / V를의 NP-40 10 MM의 β-머 캅토 에탄올), 160 XG (4 ° C)에서 원심 분리는 각각의 세척을위한 펠렛합니다. </li><li> 각 1 ml의 IgG의 용출에, 버퍼 바인딩 칼 모듈 린의 3 볼륨을 추가합니다. 일정 칼슘 수준을 유지하기 위해, 염화칼슘 (2) 및 β-머 캅토 에탄올은 IgG의 용출에 이러한 성분의 부족을 고려하여 추가 할 수 있습니다. 최종 농도는 2 mM의 염화칼슘이 10 MM의 β-머 캅토 에탄올해야합니다. </li><li> 칼 모듈 린 수지에 샘플을 추가하고 튜브 회를 사용하여 1 시간 (4 °에 C)에 대한 결합한다. </li></ol></li><li> 포장 및 칼 모듈 린 수지에서 용리 <ol><li> 평면 구멍을 만드 럼의 끝을 절단하여 100 ㎕의 칼 모듈 린 슬러리 당 2 ml의 폴리 준비 열을 준비합니다. 공동마다 더 이상 100 ㎕의 칼 모듈 린 슬러리를로드하지시료 수지의 양을 최소화 lumn 용출시에 접촉. </li><li> 중력에 의해 열을 포장하고 5 ml의 칼 모듈 린 바인딩 버퍼로 열 세 번 수지를 씻는다. </li><li> 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 KCl을 1 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8.0, 4 mM의 EGTA, pH가 8.0, 0.08 %의 V 200 μL 모듈 린 용출 완충액 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0을 첨가하여 단백질을 용리 / V NP-40 10 MM의 β-머 캅토 에탄올). 칼 모듈 린 용출 버퍼 200 μL의 6 배 추가를 반복합니다. </li><li> 용리 1 내지 3의 경우, 컬럼에 볼륨을 적용하고 즉시 용출액을 수집한다. 용출 4 칼럼의 바닥을 밀봉하고 2.5 분 동안 용출 완충액으로 부화 후 개봉 및 중력에 의해 용출 할 수있다. 용출 5, 5 분 동안 배양 한 후 봉인을 해제하고 용출. 용출 6, 10 분 동안 배양 한 후 봉인을 해제하고 용출. 참고 : 복잡한의 무결성 용리 다릅니다 / 분획 (대표 결과 섹션 참조) &lt;./ 리&gt; <li> 용리 2 개별적 밤새 적절한 마이크로 투석 법을 이용하여 투석을 6. 투석 버퍼에 대한 분수 투석 (10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터의 KCl을 1 밀리미터의 MgCl 2, 5 mM의 이미 다졸, pH가 8; 10 MM의 β-머 캅토 에탄올). 참고 : NP-40은 투석막을 통해, 모든 경우에, 상당히 전달하지 않습니다. </li></ol></li></ol> 4. 후 정화 분석은 복잡한 품질을 평가하는 <ol><li> 기본 젤과 실버 염색 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 단지의 분석을 위해 16 % 프리 캐스트 기본 젤 - 4를 준비합니다. 젤 위에 투석 칼 모듈 린의 용출 / 분수의 각각의 적절한 분자량 단백질 표준 및로드 15 μl를 사용합니다. </li><li> 약 3 시간 (4 °에 C) 150 V에서 젤을 Electrophorese. </li><li> 실버 여섯 용리 각각의 품질을 평가하는 젤을 염색. 또는, 동등하게 중요한 상업을 사용형광 염색 (들). 이 단계에서, 착물의 농도는 쿠마시 블루 염색의 검출 레벨 이하 대부분이다. </li></ol></li><li> 추가 젤 분석 방법 <ol><li> 웨스턴 블로 팅에 의해 단백질을 감지하기 위해, SDS 또는 기본 PAGE에 의해 복잡한을 해결 한 후 제조업체의 지침에 따라 같은 TAP 태그 항체를 사용하여 칼 모듈 린 바인딩 펩타이드 (CBP) 에피토프의 젤을 조사. </li><li> 특정 형광 염색 (들)을 사용하여, 정제 TAP 컴플렉스의 존재하에 단백질 및 / 또는 핵산의 무결​​성을 확인한다. 더 스펙트럼 중첩이 얼룩 사이에 감지되지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 네거티브 얼룩 전자 현미경 시각화 <ol><li> 복잡한 응용 프로그램의 30 분 이내에, 글로우 방전 30 초 동안 -15 mA에서 연속 탄소 격자를 사용합니다. </li><li> 그리드에 (일반적으로 1 nm의 농도) TAP 정제 단지의 3 μl를 적용합니다. 분 동안 품어. 오 F여분의 버퍼를 제거하는 격자의 측면 ROM. </li><li> 탈 이온수 20 μl의 방울 두 번 씻으십시오. 세척과 측면 오. </li><li> 50 μl의 부정적인 얼룩 드롭에 그리드를 적용하고 분 동안 품어. 우라 닐 아세테이트 (2 %) 또는 우라 닐 포르 메이트 (0.75 %)와 염색을 권장합니다. 주의 : 우라 닐 염 및 솔루션은 약하게 방사성하고 중금속이 포함되어 있습니다. 이러한 관심과 제도적 권장 폐기물 지침에 따라 폐기해야합니다 이러한 솔루션과 접촉하는 모든 물질로 처리해야합니다. </li><li> 블로 팅하지 않고, 신선한 50 μl의 부정적인 얼룩 드롭에 그리드를 적용합니다. A 최소, 다음 측 오 부화, 그리고 마지막으로 건조 공기 및 시각화. </li></ol></li><li> 극저온 전자 현미경 (극저온 EM) 시각화 <ol><li> 최적화해야 할 수도 있지만 제조 업체의 프로토콜에 따라, TAP 정제 복합체 냉동-EM을 수행합니다. 참고 : 세제의 존재를 높은 농도의 엄마에Y 진행을 방해하고 아래에 설명되어 있습니다. </li></ol></li></ol> 5. 복잡한 스토리지 <ol><li> 스토리지에 대한 복잡한 준비 <ol><li> 필요한 경우 복합체에 대한 적절한 분자량 컷 - 오프를 갖는 원심 필터를 사용하여, 상기 복합체를 농축시킨다. 원하는 농도에 도달 할 때까지 1 분 간격으로 14,000 XG 스핀. 참고 : 필터도 투석 막을 통과하지 않는 NP-40 농도는 집중하는 동안 농도가 증가 할 것이다. </li><li> 플래시는 액체 질소 나 드라이 아이스에 30 μL 씩의 복잡한 에탄올 욕을 냉각 동결하고 -80 ° C에 저장합니다. </li></ol></li><li> 세제의 선택 후 정제 제거 </li></ol> 참고 사항 : NP-40 및 방해 또는 일부 애플리케이션에 대한 진행을 억제 할 수는 임계 미셀 농도의 상기 농도의 세제의 존재. 프로토로부터 제거의 결과다른 첨가제 또는 공용 매와 ​​COL뿐만 아니라 교체는 아래에 설명되어 있습니다. 더 NP-40가 요구되지 않는 경우, 옵션은 예 바이오 비드, 제거를위한 상용 프로그램을 사용하는 것이다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 투석 버퍼에 미리 평형 시판 세제 흡수 구슬. (일반적으로 10 nM의 농도에서) 단지의 30 μL에 5 구슬을 섞는다. </li><li> 얼음에 15 분 동안 TAP 정제 단지와 단계 5.2.1에서 평형 구슬을 품어. 세제의 제거 다음 몇 시간 내에 복잡한을 사용합니다. </li></ol>

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탭 방식 꽉 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을 두 개의 태그를 이용한다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 또한, 개별 TAP 한 어떤 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있도록하는 ORF는 상용 소스에서 사용할 수있는 태그. 복합체의 무결성 및 정제에 대한 복소 상이한 태그 된 단백질 서브 유닛의 사용을 테스트 할 수있는 자원의 가용성을 보존하는 천연 복합체를 정제 용 TAP 방법을 이용하는 두 가지 장점이있다. 그러나 원래 TAP 방식 프로토콜은 복잡한 정제가 구조적으로 그리고 구조적으로 균일하도록 고안되지 않았다. 이 목표를 달성하기 위하여, 위에서 설명한 바와 같이 TAP 방식은 따라서 수정되었다. 여러TAP 방법의 단계는 조성 및 구조 균일 한 복합체를 정화 할 수있는 최적의 방법과 조건을 설정하...

다수의 주요 세포 과정 큰 단백질 및 단백질 RNA 복합체 (1)에 의해 수행된다. 같은 단지의 생물 물리학 및 구조 연구를 수행에 중요한 병목 현상은 적절한 품질 (즉, 균질성)의 적절한 농도를 얻을 수있다. 기본 소스에서 복합체를 분리하는 것은 서브 유닛의 관련 포스트 전사 및 / 또는 번역 후 변형을 유지하고 적절한 복잡한 어셈블리를 보장 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 그러나, 큰 세포 복합체는 낮은 카피 수에서 종종 세포에 존재하고 정화는 고도로 효율적인하고 복잡한 무결성을 유지하기 위해 주변의 생리적 조건에서 발생해야합니다. 진핵 소스에서 복잡한 정제 특별히 도전하고 재정적으로 금지 될 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 균일 한 복합체를 수득 전략 또는 방법이 매우 바람직하다. 된 전략초기 특성화 진핵 세포에서 네이티브 단지를 정화에 성공적 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방법 2,3입니다. 탭 방법은 처음 인자 (들)이 상호 작용하는 복잡한의 신진 효모 (S. cerevisiae의)에서 천연 단백질을 정제하기 위해 고안되었다. 탭 방식은 두 개의 태그, 동일한 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 나란히 융합 각 태그를 이용했다. 타이트 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을하도록 태그를 선택 하였다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 태그가 단지 위에 20 kDa의의 부가 - genomically 혼입 TAP 태그 끝에 배치하고, 단백질 - 코딩 유전자 (단말 C)의 단백질 A 뒤에 펩타이드 (CBP)을 바인딩 모듈 린을 코딩하는 서열로 구성된 단백질. CBP는이 짧다(6) 아미노산 및 의해 인식 ~ 17 kDa의 단백질, 칼 모듈 린 10-9 M의 순서 (4)에 K D와 칼슘의 존재 (CAM). 단백질 A는 ​​태그의 반복 사이에 짧은 링커 잔기의 58 개의 반복 이루어진 크다. 각 58 아미노산 반복은 K D ~ 10 -8 M (5) 면역 글로불린 G (IgG의)에 의해 인식된다. 이 두 태그 사이에 TEV 단백질 분해 효소, 담배 엣지 바이러스 6, 7에서 엔도 펩 티다 제에 대한 인식 사이트를 통합했다. 탭 단백질 태그에있어서의 제 연관 단계에서,도 1에 도시 된 바와 같이 태그 단백질 TEV 단백질 분해 효소, 특히 사이트 사이의 절단의 첨가시 열 절단에 의해 용출 된 단백질 A. 통해 IgG의 수지에 바인딩 두 태그입니다. 이것의 IgG의 상호 작용 등의 필요한 단계 및 단백질 A가 매우 강해에만 적절 변성 용액 조건 교란 될 수있다. 홍보 부족태그 otein 단백질은 칼슘의 존재 캠 수지에 결합 된 금속 이온 킬 레이터의 EGTA (에틸렌 글리콜 테트라 산) (도 1)을 첨가하여이 수지로부터 용출시켰다. 탭 방식의 도입은 그것이 생성하는 대규모 연구에 사용 된 바로 후에 S. 복잡한 상호 작용 &#39;맵핑&#39; cerevisiae의 8. 중요한 것은 이러한 노력 전체 효모-TAP 태그 오픈 리딩 프레임 (ORF) 라이브러리의 결과뿐만 아니라 개별 TAP로 (9)는 상용 소스에서 사용할 수 개의 ORF 태그. 따라서, 하나는 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있습니다. 상기 탭 방법도 포함 변형 또는 TAP 태그의 변형 가했다 기타 진핵뿐만 아니라 박테리아 세포 10,11에서 착물 정제의 사용; 단백질 A 및 CBP는 다른 단백질 (12)에 배치되는 것을 특징으로 &quot;분할 태그&quot;의 디자인; 그리고 타예컨대 칼슘 또는 EGTA (13) 복합체의 감도, 연구자의 ​​필요를 수용하도록 GS가 바뀌었다. 모두 계측 및 방법론의 최근 발전은 거대 분자 복합체 (14)의 원자 해상도의 이미지에 가까운 높은 주도 한 구조 결정을위한 전자 현미경 (EM)의 응용 프로그램에서 상당한 진보를 주도하고있다. EM에 의해 복잡 얻어지는 해상도는, 그러나, 연구중인 복합물의 품질을 조건으로 유지된다. 이 연구는 S.에서 정화 할 수있는 TAP 태그 방식을 사용하고있다 cerevisiae의 U1 snRNP는 spliceosome (15, 16)의 일부인 18 서브 유닛 (~ 0.8 MDA) 낮은 사본 번호 리보 복잡한. 다수의 단계는 균일하고 적절한 농도가되도록이 복합체를 정제 취해왔다. 정화의 여러 단계에서 발생하는 잠재적 인 문제를 설명하고 전략 chall을 극복하기 위해 촬영enges는 강조했다. 주의 깊게 평가 및 정제 단계를 최적화함으로써, U1 snRNP 정제 품질의 음의 얼룩에 적합 전자 냉동 현미경 (냉동-EM) 연구 양이다. 구조 연구를위한 기본 복합체의 정제를위한 최적화 된 TAP 방식 프로토콜이 설명된다.

<table><tbody><tr><td>S. cerevisiae TAP 태그 균주</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>TAP 프로토콜을 개발하는 데 사용되는 1차 효모 균주입니다. 배경은 S288C입니다 : ATCC 201388 : MATa, his3 & Delta; 1, leu2&Delta; 0, met15&Delta; 0, ura3 &델타; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>커피 그라인더</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>세포 용해</td></tr><tr><td>혈구계에 사용, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>세포 용해 평가에 사용</td></tr><tr><td>JA 9.100 원심분리기 로터&nbsp;</td><td>벡크만 쿨터, Inc.</td><td></td><td>효모 세포 채취에 사용</td></tr><tr><td>JA 20 고정각 원심분리기 로터</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>불용성 세포 물질</td></tr><tr><td>Ti 60 고정각 원심분리기 로터</td>의 세포 추출물을 제거하는 데 사용됩니다<td>.</td><td></td><td>용해성 세포 추출물을 더욱 투명하게 하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>온도 조절 쉐이커</td></tr><tr><td>Novex 젤 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG 수지</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 고속 흐름</td></tr><tr><td>칼모듈린 수지</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>친화성 수지</td></tr>, <tr><td>프로테아제 억제제 칵테일, 미니 정제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini cOmplete ultra EDTA</td></tr><tr><td>억제제 칵테일, 대형 정제</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA free 정제</td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td></td><td></td><td>이소프로판올</td></tr><tr><td>2ml Bio-spin column</td><td>Bio-Rad에 용해 연구소, Inc.</td><td>7326008</td> Calmodulin 수지 10ml poly-prep column Bio-Rad Laboratories, Inc.<td>를 포장하고 세척하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>7311550</td> IgG 수지 프리캐스트 네이티브 PAGE Bis-Tris 젤 Life Technologies BN1002 Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔 NativeMark 단백질 표준물 Thermo Fisher Scientific LC0725 네이티브 PAGE에 사용되는 염색되지 않은 단백질 표준물을 <td>포장하고 세척하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>. 로드 7.5 &mu; L 실버 스테인드 젤 및 5 &mu; SYPRO 루비 스테인 젤</td></tr><tr><td>Precast SDS PAGE Bis-Tris 젤</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 젤&nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler 단백질 표준물질</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td> 웨스턴 블로팅 SDS 러닝 버퍼<td>에 사용되는 염색되지 않은 단백질 표준물질</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS 버퍼</td></tr><tr><td>TAP 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>CBP 태그에 대한 1차 항체</td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>염소 항-토끼 알칼리 인산가수분해효소 결합</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium&nbsp;</td></tr><tr><td>투석 장치</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer 미니 투석 장치</td></tr><tr><td>원심 필터 장치, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 Ultracel-100 멤브레인 세제 흡수 비드가 있는 원심 필터 장치</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 absorbants</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>핵산 염색용 형광 염료, SYPRO Ruby 존재로 검출 시 488 nm의 excitation 파장 및 532 nm의 방출 파장 사용</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>단백질 염색을 위한 형광 염료, SYBR Green II가 존재하는 상태에서 검출 시 457nm의 여기 파장과 670nm 구리 그리드의 방출 파장을 사용합니다</td></tr><tr><td>.</td><td>전자 현미경 과학</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

선호도 정화 방법은 단백체 특성에 대한 기본 복합체를 분리에 성공했다. 구조 이질성과 단지의 조성 이질성의 정도는 일반적으로 연구를 수행의 진행을 방해하지 않습니다. 반대로, 구조적 특성을위한 복합 구성물은 구조적으로 균일뿐만 아니라 프로테오믹스에 필요한 것보다 더 높은 농도 인 상태에서 정제한다. 최근 큰 거대 분자 복합체의 구조 결정을위한 전자 현미경의 적용에 상당한 발전이 있었다. 이것은 전자 현미경으로 구조 결정을위한 충분한 품질과 양의 천연 복합체를 정제하는 방법에 대한 관심이 높아지고있다. 탠덤 선호도 정화 (TAP) 메소드가 18 서브 유닛을 추출하고 정제 최적화되었습니다 ~ 신진 효모에서 0.8 MDA의 리보 어셈블리 (사카로 마이 세스 세레 비지) </EM&gt; 부정적인 얼룩 및 전자 냉동 현미경에 적합합니다. 여기 TAP 방법, 이러한 변화를 만들기위한 이론적 근거에 대한 수정 사항을 자세히 설명하고, 접근 방식은 구성 상과 구조적으로 균일 복잡한에 대한 분석로 이동합니다.

수정 된 TAP 방법 S.로부터 정제 하였다 U1 snRNP, 18 서브 유닛의 리보 핵산 단백질 복합체를 cerevisiae의. 게시 된 프로토콜 2,3 다음 단지의 초기 TAP 정화는 실버 세 밴드는 천연 폴리 아크릴 아미드 겔 (그림 2A)을 염색으로 마이그레이션, 이기종 등장 복합체를 얻었다. 탭 방식의 최적화의 여러 라운드는보다 균일 어셈블리 (그림 2A)를 나타내는 기본 겔로 주로 단일 밴드를 마이그레이션 복합체를 얻었다. 형광 염료를 사용하여 단백질 및 핵산 모두에 대해 염색하기 위해서는 정제 된 복합체가 모두 생체 고분자 본 (도 2b)을 설치 한 것으로 하였다. 정제 된 복합체는 SDS 페이지와 TAP ...

TAP(Tandem Affinity Purification) 방법은 단백질체학을 위해 주로 진핵생물인 세포 추출물에서 천연 복합체를 분리하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 구조 연구를 위한 천연 복합체의 정제에 최적화된 TAP 방법 프로토콜을 제시합니다.

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 생물물리학적 연구에 적합한 품질의 천연 거대분자 복합체를 정제하는 것입니다. 이 프로토콜은 단순히 복합체를 정제하는 방법일 뿐만 아니라, 정제 과정 중에 샘플의 구조적 품질을 평가하기 위한 상세한 가이드 역할을 합니다. 본 프로토콜의 주요 장점은 조성의 균질성을 보장하기 위해 생리적 조건에 가까운 완충액 환경에서 천연 결합체를 쉽고 빠르게 정제할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 S.cerevisiae 세포를 원심분리하고 상층액을 따라낸 후, 차갑게 보관한 용해 버퍼 2 mL를 넣고 소용돌이 형태로 섞거나 10 mL 세롤로지컬 파이펫을 사용하여 펠렛을 현탁합니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 둔 빈 50 mL 원뿔형 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 차가운 용해 버퍼 2 mL를 추가로 사용하여 각 원심분리 병을 세척하고, 해당 용액을 50 mL 튜브에 추가합니다.세포 펠릿의 습중량을 측정한 후, 50 mL 원추형 폴리프로필렌 원심분리 튜브 내부와 주변에 액체 질소 조(bath)를 만듭니다. 다음으로, 부유 세포를 5 mL 주사기에 흡입하고 주사기에 16 gauge 바늘을 연결합니다. 그런 다음, 세포 현탁액을 주사기와 바늘을 통해 액체 질소 조로 분당 약 1 mL의 속도로 통과시켜 액적을 생성함으로써 급속 동결시킵니다.효모 세포를 용해하려면, 먼저 액체 질소를 사용하여 커피 그라인더를 예냉하십시오. 그런 다음 최대 40 g의 효모 세포를 넣고 25초 동안 분쇄하며, 이 분쇄 과정을 8~9회 반복합니다. 한 번에 10 L 이상의 세포 배양액을 정제하는 것은 권장되지 않습니다.이를 통해 정제 시간을 최소화하고 복합체의 구조적 무결성이 유지되도록 합니다. 분쇄 과정을 두 차례 반복할 때마다 그라인더에 액체 질소를 얇게 층지어 붓고 증발하도록 둡니다. 세포가 뭉치는 것을 방지하기 위해, 액체 질소로 냉각시킨 스패튤라로 세포를 저어 세포가 녹지 않도록 유지합니다.용해 후, 세포는 고운 흰색 가루 형태로 나타나야 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포 용해 여부를 확인하고 PMSF, DTT 및 프로테아제 억제제가 포함된 용해 버퍼를 준비한 후, 액체 질소로 냉각시킨 스패튤라를 사용하여 냉동된 용해 세포 가루를 준비된 50 milliliter 버퍼 튜브에 조금씩 떠서 넣으십시오. 가루를 추가할 때마다 50 milliliter 튜브를 실온에서 부드럽게 회전시켜 세포를 해동 및 용해시키고 기포가 형성되는 것을 방지하십시오.세포가 용해됨에 따라 세포 분말을 더 추가합니다. 모든 세포를 추가한 후, 튜브 내에 얼어 있는 세포 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 세포의 해동 및 용해 과정을 계속합니다. 이 과정은 약 50분 정도 소요됩니다.다음으로, 세포 용해물을 25,000 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심 분리합니다. 세포가 용해되고 원심 분리가 완료되면, 불용성 펠렛에서 작은 어두운 층이 관찰될 수 있습니다. 상층액을 폴리카보네이트 초원심 분리 튜브로 옮기고, 각 튜브에 200 mM PMSF 10 µL를 추가합니다.샘플을 100,000 ×g, 4 °C에서 1시간 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 4개의 층이 관찰되어야 합니다. 주로 리보솜 복합체를 포함하는 단단하고 투명한 펠렛, 지질이 풍부한 부드러운 펠렛, 세포의 가용성 단백질과 복합체의 대부분을 포함하는 크고 투명하며 노란빛을 띠는 층, 그리고 지질로 구성된 비늘 모양의 최상층이 나타납니다.4 °C의 냉장실에서 1 mL 피펫을 사용하여 상단의 비늘 모양 지질층을 가능한 한 많이 제거하여 버립니다. 10 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 투명한 노란색 층의 대부분을 회수합니다. 그런 다음, 하단의 두 층이 섞이지 않도록 1 mL 피펫을 사용하여 이 층의 나머지 몇 mL를 회수합니다.40 g의 젖은 세포 펠렛으로부터 일반적으로 약 48 mL의 중간층이 회수됩니다. 텍스트 프로토콜에 따라 IgG sepharose를 준비한 후, IgG 레진과 중간층 상층액, 그리고 세포 40 g당 2정의 미니 프로테아제 억제제 정제를 혼합합니다. 그 다음 4 °C의 로테이터에서 2시간 동안 반응시킵니다.이것은 IgG 배치 솔루션입니다. 컬럼의 끝부분을 잘라 평평한 개구부를 만들어 10 mL polyprep 컬럼 두 개를 준비합니다. 24 mL의 현탁 IgG 레진 슬러리 또는 배치 솔루션을 각 컬럼에 붓고, 중력에 의해 침전되도록 둡니다.이는 충진된 IgG 레진 200 µL에 해당합니다. 침전 시간이 30분보다 더 오래 걸린다면, 중간 층이 지질에 의해 오염되었을 가능성이 있습니다. 침전이 완료되면, IgG D150 버퍼 10 mL를 4회 연속으로 사용하여 충진된 컬럼을 세척하십시오.컬럼 내에서 담배 에칭 바이러스(tobacco etch virus) 또는 TEV 프로테아제 절단을 수행하려면, 컬럼 바닥을 밀봉하고 1 mL의 IgG D150 버퍼와 100 µL의 TEV 프로테아제를 첨가합니다. 컬럼 상단을 밀봉하고 750 RPM, 18 °C로 설정한 써멀 믹서를 사용하여 20분 동안 혼합합니다. 레진을 다시 현탁시킨 후 20분 동안 다시 혼합합니다.그런 다음 재현탁하고 20분간의 혼합 과정을 세 번째로 반복합니다. 컬럼을 4 °C로 되돌리고 중력을 이용하여 단백질 복합체를 용출합니다. 그 후, IgG D150 200 µL를 첨가하여 dead volume을 용출합니다.텍스트 프로토콜에 따라 칼모듈린 친화성 수지를 준비한 후, 칼모듈린 결합 버퍼와 샘플을 수지에 추가하고 튜브 회전기를 사용하여 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 컬럼의 끝부분을 잘라 평평한 개구부를 만들어 100 µL의 칼모듈린 슬러리당 2 mL polyprep 컬럼을 준비합니다. 본 프로토콜은 복합체의 농도를 유지하고 수지 체류 시간을 최소화하기 위해 선택된 특정 버퍼 및 체류 부피를 상세히 설명합니다.배양액 부피가 변경될 경우, 해당 변경 사항을 반영하여 중력 컬럼의 레진 및 버퍼 부피를 조정하는 것이 권장됩니다. 100 µL 이하의 calmodulin 슬러리로 컬럼을 충전하고, 중력을 이용하여 5 mL의 calmodulin 결합 버퍼로 레진을 3회 세척하십시오. 200 µL의 calmodulin 용출 버퍼를 사용하여 단백질을 3회 용출하십시오.그 다음, 컬럼 바닥을 밀봉하고 20 µL의 용출 버퍼를 첨가한 뒤 2.5분 동안 배양하고, 밀봉을 해제하여 단백질이 중력에 의해 용출되도록 합니다. 컬럼 바닥을 다시 밀봉하고 200 µL의 용출 버퍼를 첨가한 뒤 5분 동안 배양합니다. 이어서 컬럼 바닥의 밀봉을 해제하고 용액을 용출합니다.여섯 번째이자 마지막 용출을 위해, 컬럼 하단을 밀봉하고 용출 버퍼와 함께 10분 동안 배양합니다. 그런 다음, 밀봉을 해제하고 용출합니다. 정제 후 분석을 수행하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 보관하십시오.여기서 보는 바와 같이, 기발표된 프로토콜에 따라 복합체의 초기 TAP 정제를 수행한 결과, 은 염색 젤에서 세 개의 밴드로 이동하는 복합체가 얻어졌습니다. TAP 방법을 여러 차례 최적화하여 native 젤에서 단일 밴드로 이동하는 복합체를 얻었으며, 이는 더 균질한 어셈블리가 이루어졌음을 나타냅니다. native 젤 결과와 일치하게, 기발표된 프로토콜에 따라 정제된 복합체를 대상으로 TAP 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 수행한 결과, TAP 태그 단백질인 SNU-71의 단백질 분해가 검출되었습니다.TAP 방법의 수정으로 단백질 분해가 현저히 감소하였으며, 그 결과 U1 snRNP 복합체의 17가지 단백질 거의 전체가 SDS-PAGE로 분리되었고 멀티 질량 분석법을 통해 긍정적으로 확인되었습니다. 음성 염색 전자 현미경 관찰 결과, TAP의 1단계 및 2단계 이후 성공적인 정제가 이루어진 경우 단분산 입자들이 나타납니다. 반대로, 정제가 실패했을 때는 적절한 크기의 입자가 관찰되지 않습니다.최종 복합체의 품질은 여기 제시된 정제된 입자들의 론(lawn)을 통해 평가되었으며, 음성 염색 EM 원본 이미지에서 입자들이 단분산된 것으로 나타납니다. 또한, 입자들의 클래스 평균(class averages)을 통해 샘플이 구조 연구에 적합할 가능성이 있음을 나타내는 뚜렷한 특징들이 확인되었습니다. 이 프로토콜에 숙달되면, 냉동 용해된 세포 분말을 해동한 후 10~12시간 이내에 완료할 수 있습니다.본 프로토콜을 수행할 때 모든 용액에 프로테아제와 뉴클레아제가 없음을 확인하는 것이 중요하며, 복합체의 응집이나 해리를 방지하기 위해 신속하게 작업해야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 구조 연구에 적합한 품질의 천연 복합체를 정제하는 방법과 정제 성공 여부를 평가하는 방법을 이해하게 될 것입니다.

purification-native-complexes-for-structural-study-using-tandem

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

방법은 (연쇄상 구균 - Tactin) 수지가 공유 비스 (술포 숙신 이미 딜) 수베 (BS3)와 가교 수정 스트렙 타비 딘에 트윈 패 혈성 태그가 융합 단백질 및 특정 단지의 효율적인 정제에 설명되어 있습니다. 방법은 빠른 속도, 좋은 표적 단백질의 회수 및 고순도의 이점을 갖고, 질량 분석법에 의한 후속 분석과 호환된다.

한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

여기 선물이 엽록체의 정화에 대 한 검증 및 테스트 프로토콜 가져오기 단백질 복합물 (복잡 한 TIC TOC) 탭-태그를 사용 하 여. 1 단계 선호도 격리 프로토콜 잠재적으로 어떤 단백질에 적용 될 수 있습니다 그리고 질량 분석에 의해 새로운 상호 파트너를 식별 하는 데.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

학습하세요 탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 S. cerevisiae에서 기본 공단을 정화하고 구조 연구에 적합한 샘플 품질을 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 생리학적 버퍼 조건에서 신속하게 정화하여 구성 균질성을 보장합니다.

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

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