탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

본 프로토콜의 전반적인 목표는 생물물리학적 연구에 적합한 품질의 천연 거대분자 복합체를 정제하는 것입니다. 이 프로토콜은 단순히 복합체를 정제하는 방법일 뿐만 아니라, 정제 과정 중에 샘플의 구조적 품질을 평가하기 위한 상세한 가이드 역할을 합니다. 본 프로토콜의 주요 장점은 조성의 균질성을 보장하기 위해 생리적 조건에 가까운 완충액 환경에서 천연 결합체를 쉽고 빠르게 정제할 수 있다는 점입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 S.cerevisiae 세포를 원심분리하고 상층액을 따라낸 후, 차갑게 보관한 용해 버퍼 2 mL를 넣고 소용돌이 형태로 섞거나 10 mL 세롤로지컬 파이펫을 사용하여 펠렛을 현탁합니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 둔 빈 50 mL 원뿔형 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 차가운 용해 버퍼 2 mL를 추가로 사용하여 각 원심분리 병을 세척하고, 해당 용액을 50 mL 튜브에 추가합니다.

세포 펠릿의 습중량을 측정한 후, 50 mL 원추형 폴리프로필렌 원심분리 튜브 내부와 주변에 액체 질소 조(bath)를 만듭니다. 다음으로, 부유 세포를 5 mL 주사기에 흡입하고 주사기에 16 gauge 바늘을 연결합니다. 그런 다음, 세포 현탁액을 주사기와 바늘을 통해 액체 질소 조로 분당 약 1 mL의 속도로 통과시켜 액적을 생성함으로써 급속 동결시킵니다.

효모 세포를 용해하려면, 먼저 액체 질소를 사용하여 커피 그라인더를 예냉하십시오. 그런 다음 최대 40 g의 효모 세포를 넣고 25초 동안 분쇄하며, 이 분쇄 과정을 8~9회 반복합니다. 한 번에 10 L 이상의 세포 배양액을 정제하는 것은 권장되지 않습니다.

이를 통해 정제 시간을 최소화하고 복합체의 구조적 무결성이 유지되도록 합니다. 분쇄 과정을 두 차례 반복할 때마다 그라인더에 액체 질소를 얇게 층지어 붓고 증발하도록 둡니다. 세포가 뭉치는 것을 방지하기 위해, 액체 질소로 냉각시킨 스패튤라로 세포를 저어 세포가 녹지 않도록 유지합니다.

용해 후, 세포는 고운 흰색 가루 형태로 나타나야 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포 용해 여부를 확인하고 PMSF, DTT 및 프로테아제 억제제가 포함된 용해 버퍼를 준비한 후, 액체 질소로 냉각시킨 스패튤라를 사용하여 냉동된 용해 세포 가루를 준비된 50 milliliter 버퍼 튜브에 조금씩 떠서 넣으십시오. 가루를 추가할 때마다 50 milliliter 튜브를 실온에서 부드럽게 회전시켜 세포를 해동 및 용해시키고 기포가 형성되는 것을 방지하십시오.

세포가 용해됨에 따라 세포 분말을 더 추가합니다. 모든 세포를 추가한 후, 튜브 내에 얼어 있는 세포 덩어리가 관찰되지 않을 때까지 세포의 해동 및 용해 과정을 계속합니다. 이 과정은 약 50분 정도 소요됩니다.

다음으로, 세포 용해물을 25,000 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심 분리합니다. 세포가 용해되고 원심 분리가 완료되면, 불용성 펠렛에서 작은 어두운 층이 관찰될 수 있습니다. 상층액을 폴리카보네이트 초원심 분리 튜브로 옮기고, 각 튜브에 200 mM PMSF 10 µL를 추가합니다.

샘플을 100,000 ×g, 4 °C에서 1시간 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 4개의 층이 관찰되어야 합니다. 주로 리보솜 복합체를 포함하는 단단하고 투명한 펠렛, 지질이 풍부한 부드러운 펠렛, 세포의 가용성 단백질과 복합체의 대부분을 포함하는 크고 투명하며 노란빛을 띠는 층, 그리고 지질로 구성된 비늘 모양의 최상층이 나타납니다.

4 °C의 냉장실에서 1 mL 피펫을 사용하여 상단의 비늘 모양 지질층을 가능한 한 많이 제거하여 버립니다. 10 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 투명한 노란색 층의 대부분을 회수합니다. 그런 다음, 하단의 두 층이 섞이지 않도록 1 mL 피펫을 사용하여 이 층의 나머지 몇 mL를 회수합니다.

40 g의 젖은 세포 펠렛으로부터 일반적으로 약 48 mL의 중간층이 회수됩니다. 텍스트 프로토콜에 따라 IgG sepharose를 준비한 후, IgG 레진과 중간층 상층액, 그리고 세포 40 g당 2정의 미니 프로테아제 억제제 정제를 혼합합니다. 그 다음 4 °C의 로테이터에서 2시간 동안 반응시킵니다.

이것은 IgG 배치 솔루션입니다. 컬럼의 끝부분을 잘라 평평한 개구부를 만들어 10 mL polyprep 컬럼 두 개를 준비합니다. 24 mL의 현탁 IgG 레진 슬러리 또는 배치 솔루션을 각 컬럼에 붓고, 중력에 의해 침전되도록 둡니다.

이는 충진된 IgG 레진 200 µL에 해당합니다. 침전 시간이 30분보다 더 오래 걸린다면, 중간 층이 지질에 의해 오염되었을 가능성이 있습니다. 침전이 완료되면, IgG D150 버퍼 10 mL를 4회 연속으로 사용하여 충진된 컬럼을 세척하십시오.

컬럼 내에서 담배 에칭 바이러스(tobacco etch virus) 또는 TEV 프로테아제 절단을 수행하려면, 컬럼 바닥을 밀봉하고 1 mL의 IgG D150 버퍼와 100 µL의 TEV 프로테아제를 첨가합니다. 컬럼 상단을 밀봉하고 750 RPM, 18 °C로 설정한 써멀 믹서를 사용하여 20분 동안 혼합합니다. 레진을 다시 현탁시킨 후 20분 동안 다시 혼합합니다.

그런 다음 재현탁하고 20분간의 혼합 과정을 세 번째로 반복합니다. 컬럼을 4 °C로 되돌리고 중력을 이용하여 단백질 복합체를 용출합니다. 그 후, IgG D150 200 µL를 첨가하여 dead volume을 용출합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 칼모듈린 친화성 수지를 준비한 후, 칼모듈린 결합 버퍼와 샘플을 수지에 추가하고 튜브 회전기를 사용하여 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 컬럼의 끝부분을 잘라 평평한 개구부를 만들어 100 µL의 칼모듈린 슬러리당 2 mL polyprep 컬럼을 준비합니다. 본 프로토콜은 복합체의 농도를 유지하고 수지 체류 시간을 최소화하기 위해 선택된 특정 버퍼 및 체류 부피를 상세히 설명합니다.

배양액 부피가 변경될 경우, 해당 변경 사항을 반영하여 중력 컬럼의 레진 및 버퍼 부피를 조정하는 것이 권장됩니다. 100 µL 이하의 calmodulin 슬러리로 컬럼을 충전하고, 중력을 이용하여 5 mL의 calmodulin 결합 버퍼로 레진을 3회 세척하십시오. 200 µL의 calmodulin 용출 버퍼를 사용하여 단백질을 3회 용출하십시오.

그 다음, 컬럼 바닥을 밀봉하고 20 µL의 용출 버퍼를 첨가한 뒤 2.5분 동안 배양하고, 밀봉을 해제하여 단백질이 중력에 의해 용출되도록 합니다. 컬럼 바닥을 다시 밀봉하고 200 µL의 용출 버퍼를 첨가한 뒤 5분 동안 배양합니다. 이어서 컬럼 바닥의 밀봉을 해제하고 용액을 용출합니다.

여섯 번째이자 마지막 용출을 위해, 컬럼 하단을 밀봉하고 용출 버퍼와 함께 10분 동안 배양합니다. 그런 다음, 밀봉을 해제하고 용출합니다. 정제 후 분석을 수행하고 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 보관하십시오.

여기서 보는 바와 같이, 기발표된 프로토콜에 따라 복합체의 초기 TAP 정제를 수행한 결과, 은 염색 젤에서 세 개의 밴드로 이동하는 복합체가 얻어졌습니다. TAP 방법을 여러 차례 최적화하여 native 젤에서 단일 밴드로 이동하는 복합체를 얻었으며, 이는 더 균질한 어셈블리가 이루어졌음을 나타냅니다. native 젤 결과와 일치하게, 기발표된 프로토콜에 따라 정제된 복합체를 대상으로 TAP 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 수행한 결과, TAP 태그 단백질인 SNU-71의 단백질 분해가 검출되었습니다.

TAP 방법의 수정으로 단백질 분해가 현저히 감소하였으며, 그 결과 U1 snRNP 복합체의 17가지 단백질 거의 전체가 SDS-PAGE로 분리되었고 멀티 질량 분석법을 통해 긍정적으로 확인되었습니다. 음성 염색 전자 현미경 관찰 결과, TAP의 1단계 및 2단계 이후 성공적인 정제가 이루어진 경우 단분산 입자들이 나타납니다. 반대로, 정제가 실패했을 때는 적절한 크기의 입자가 관찰되지 않습니다.

최종 복합체의 품질은 여기 제시된 정제된 입자들의 론(lawn)을 통해 평가되었으며, 음성 염색 EM 원본 이미지에서 입자들이 단분산된 것으로 나타납니다. 또한, 입자들의 클래스 평균(class averages)을 통해 샘플이 구조 연구에 적합할 가능성이 있음을 나타내는 뚜렷한 특징들이 확인되었습니다. 이 프로토콜에 숙달되면, 냉동 용해된 세포 분말을 해동한 후 10~12시간 이내에 완료할 수 있습니다.

본 프로토콜을 수행할 때 모든 용액에 프로테아제와 뉴클레아제가 없음을 확인하는 것이 중요하며, 복합체의 응집이나 해리를 방지하기 위해 신속하게 작업해야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 구조 연구에 적합한 품질의 천연 복합체를 정제하는 방법과 정제 성공 여부를 평가하는 방법을 이해하게 될 것입니다.