Affinity Chromatography를 사용한 자체 조립 단백질 나노 입자의 정제

폴리히스티딘 태그가 있는 재조합 자가 조립 단백질 나노입자를 발현하는 조작된 박테리아의 현탁액을 취하십시오.

초음파 처리하여 세포 내 성분을 방출합니다.

단백질 나노입자를 함유한 상청액을 수집하기 위해 원심분리합니다. 이미다졸이 없는 완충액으로 희석하십시오.

고정화된 니켈 양이온이 있는 아가로스 비드가 포함된 친화성 크로마토그래피 컬럼을 가져 가십시오.

컬럼 평형을 위해 이미다졸 농도가 낮은 완충액을 추가합니다.

박테리아 용해물을 컬럼에 추가합니다.

실행 중에 단백질 나노입자의 폴리히스티딘은 니켈 양이온과 강하게 결합합니다.

한편, 박테리아 지질다당류 및 기타 단백질과 같은 오염 물질은 컬럼에 약하게 결합합니다.

결합된 단백질을 제거하기 위해 낮은 이미다졸 농도를 함유한 완충액으로 세척합니다.

이소프로판올을 도입하여 지질다당류를 제거한 후 세척합니다.

다음으로, 중간 이미다졸 농도의 완충액을 도입합니다. 이미다졸은 니켈 양이온에 결합하기 위해 히스티딘과 경쟁하여 결합된 단백질 나노입자를 방출합니다.

다음으로, 단백질 나노입자를 완전히 용리하기 위해 높은 이미다졸 농도를 포함하는 완충액을 첨가합니다.

추가 적용을 위해 정제된 단백질 나노입자를 수집합니다.

6 나선 번들 SAPN을 발현하는 수확 된 대장균의 용해를 위해, 초음파 처리 출력이 150 와트인 프로브를 사용하여 4 초의 초음파 처리 및 6 초의 휴식과 함께 재현탁 된 박테리아 펠릿을 얼음 위의 40 밀리리터의 이미다졸이없는 완충액에 5 분 동안 초음파 처리합니다.

세포 용해물을 원심분리하여 정화된 상청액을 생성하고 상청액을 멸균 150밀리리터 플라스크로 옮깁니다. 그런 다음 신선한 이미다졸이 없는 완충액으로 샘플을 최종 부피 100밀리리터까지 가져옵니다.

관심 있는 단백질을 분리하려면 FPLC 소프트웨어를 열고 새 방법 옵션을 클릭합니다. Method Settings(분석법 설정) 메뉴에서 Column Position(컬럼 위치) 드롭다운 메뉴를 열고 C1 Port 3(C1 포트 3)을 선택합니다. 기술별 표시 드롭다운 메뉴에서 선호도를 선택합니다. 열 유형 드롭다운 메뉴에서 기타, HisTrap HP 및 5밀리리터를 선택합니다. 컬럼 부피와 압력 상자는 자동으로 적절한 값으로 설정됩니다.

Method Outline을 클릭하고 Phase Library 메뉴를 닫기 전에 Phase Library 팝업 메뉴에서 Equilibration 및 Sample Application 버튼, Column Wash 버튼 3개 및 Elution 버튼을 화살표 옆에 드래그합니다. Equilibration을 클릭하고 표에 나열된 값을 Initial Buffer B, 4%, Final Buffer B, 4% 및 Column Volume, 5로 설정합니다.

샘플 응용 프로그램을 클릭합니다. Sample Loading(샘플 로딩) 상자에서 Inject Sample on Column with Sample Pump(샘플 펌프를 사용하여 컬럼에 샘플 주입)에 대한 라디오 버튼을 클릭하고 Use Flow Rate From Method Settings(분석법 설정에서 유량 사용) 옆의 상자가 Sample Injection(샘플 주입)에서 선택되어 있는지 확인합니다 시스템 펌프 박스와 함께. 볼륨 상자 값을 100밀리리터로 변경하고 분수 수집 체계를 활성화로 변경합니다.

분석법 설정에서 분수 크기 사용 상자를 클릭 취소하고 분수 크기를 4밀리리터로 변경합니다. 첫 번째 컬럼 세척 버튼을 클릭합니다. 표에 나열된 값을 초기 완충액 B, 4%, 최종 완충액 B, 4% 및 컬럼 부피, 10으로 설정합니다. 분획 수집 체계 활성화(Fraction Collection Scheme Enable) 상자를 클릭하고 분석법 설정에 분획 크기 사용(Use Fraction Size for Method Settings)을 선택 취소합니다. 분획 크기를 4밀리리터로 변경하고 두 번째 컬럼 세척 버튼을 클릭합니다.

표의 값을 초기 버퍼 B, 0%, 최종 버퍼 B, 0% 및 컬럼 부피, 5로 설정합니다. 분획 수집 체계 활성화 상자를 클릭하고 분석법 설정에서 분획 크기 사용을 선택 취소합니다. 분획 크기를 4밀리리터로 변경하고 세 번째 열 세척 버튼을 클릭합니다. 표의 값을 초기 버퍼 B, 0%, 최종 버퍼 B, 0% 및 컬럼 부피, 10으로 설정합니다. 분획 수집 체계 활성화 버튼을 클릭하고 분석법 설정에 분획 크기 사용 상자를 클릭 취소합니다. 그런 다음 분수 크기를 4밀리리터로 변경합니다.

용출 버튼을 클릭하고 표의 정보를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 팝업 메뉴에서 [단계 삭제]를 클릭하고 [등용매 그라디언트] 버튼을 테이블로 두 번 드래그하여 두 개의 항목이 있도록 합니다. 첫 번째 항목의 값을 초기 버퍼 B, 30%, 최종 버퍼 B, 30% 및 컬럼 부피, 10으로 설정합니다.

두 번째 항목의 값을 초기 버퍼 B, 100%, 최종 버퍼 B, 100% 및 컬럼 부피 10으로 설정합니다. 분획 수집 체계 활성화 버튼을 클릭하고 분석법 설정에 분획 크기 사용 상자를 클릭합니다. 그런 다음 다른 이름으로 저장을 클릭하고 파일 이름을 Purification으로 지정합니다.

FPLC의 펌프 A 튜브를 이미다졸이 없는 세척 완충액에 넣고 펌프 B 튜브를 500밀리몰 이미다졸 완충액에 넣습니다. 샘플 펌프 튜브를 100밀리리터 샘플에 넣고 정제 프로그램을 실행합니다. 60% 이소프로판올 세척이 필요한 경우 프로그램을 일시 중지하고 펌프 튜브를 이미다졸 프리 세척에서 60% 이소프로판올 세척으로 이동한 다음 프로그램을 다시 시작합니다. 세척이 끝나면 프로그램을 다시 일시 중지하고 펌프 A 튜브를 이미다졸이 없는 세척 완충액으로 되돌린 다음 정제 프로그램을 다시 시작합니다.