니켈 친화성 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 박테리아 세포 용해물에서 폴리히스티딘 표지 재조합 단백질을 정제하는 기술

박테리아 세포 용해물에서 폴리-히스티딘 태그(한 말단에 있는 일련의 히스티딘 잔기)에 융합된 재조합 단백질을 정제하려면 먼저 세포 용해물을 희석하여 크로마토그래피 실행 중 컬럼 막힘을 방지합니다.

킬레이트제인 니트릴로트리아세트산을 사용하여 아가로스 비드 매트릭스에 고정화된 2가 니켈 양이온을 포함하는 친화성 컬럼을 조립합니다. 니트릴로트리아세트산은 4개의 배위 공유 부위를 통해 니켈 양이온에 결합하는 반면, 금속 이온의 두 부위는 관심 단백질의 폴리-히스티딘 태그와 상호 작용하는 데 계속 사용할 수 있습니다.

효과적인 금속-단백질 상호 작용을 위한 조건을 최적화하기 위해 적절한 완충액으로 컬럼을 평형화합니다. 세포 용해물을 컬럼에 로드합니다.

접근 가능한 말단 히스티딘 잔기를 운반하는 재조합 단백질은 히스티딘의 측쇄인 이미다졸에 대한 금속 이온의 높은 친화력으로 인해 니켈 양이온과 배위 결합을 형성하고 매트릭스에 결합합니다. 재조합 단백질의 연속적인 히스티딘 수가 많으면 매트릭스에 대한 부착이 강화됩니다.

이에 비해 히스티딘 잔기가 없는 단백질은 컬럼에 부착되지 않고 플로우 스루에서 용리됩니다. 저농도 이미다졸 완충액으로 컬럼을 세척합니다.

이미다졸은 폴리펩티드 사슬의 히스티딘 잔기를 통해 매트릭스에 비특이적으로 부착되어 이를 대체하고 용출을 촉진할 수 있는 약하게 결합된 단백질 오염 물질과 경쟁합니다. 고농축 이미다졸 완충액으로 컬럼을 세척하여 니켈 이온 킬레이트에서 강하게 결합된 히스티딘 태그 재조합 단백질을 해리하여 플로우 스루로 용출합니다.

추가 분석을 위해 정제된 재조합 단백질 분획을 수집합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 히스티딘 태그 단백질의 유도 가능한 과발현으로 이 프로토콜을 시작합니다. 단백질을 정제하기 위해 중력 컬럼에 니켈-니트릴로아세트산 수지 1밀리리터를 준비합니다. 사용 전날, 2밀리리터의 평형 완충액으로 컬럼을 섭씨 4도에서 밤새 평형화합니다.

다음날, 정화된 용해물을 로드하기 전에 컬럼을 섭씨 4도에서 실온으로 가져오고 약 2-3시간 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 용해 완충액에 펠릿을 다시 현탁합니다.

10 초 간격으로 얼음 위에 세포를 초음파 처리하고 펄스 사이에 30 초 동안 일시 중지합니다. 마이크로 원심분리기를 사용하여 섭씨 4도에서 30분 동안 3080 x g에서 원심분리하여 용해물을 정화합니다.

동일한 부피의 용해 완충액으로 정화 용해물을 준비한 다음 준비된 정화 용해물을 컬럼에 적용하고 플로우 스루를 수집합니다. 정화된 용해물 플로우 스루를 컬럼에 다시 적용하고 2차 플로우 스루를 수집합니다.

그런 다음 5밀리리터의 세척 완충액 #1로 컬럼을 세척하고 유동을 수집합니다. 5밀리리터의 세척 완충액 #2로 컬럼을 다시 세척하고 흐름을 수집합니다. 이제 2밀리리터의 용출 완충액을 도포합니다. 각각 1밀리리터씩 두 부분으로 흐름을 수집합니다.