의식 쥐의 사구체 여과율의 측정을위한 높은 처리량 방법

이 절차의 전반적인 목표는 깨어 있는 쥐에서 신장 기능을 결정하는 방법을 다른 연구자에게 보여주는 것입니다. 이는 먼저 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FSE 이눌린을 24시간 동안 투석하고 주사를 위한 농도를 측정함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 마우스의 무게를 측정하고, 후구강 주사를 위해 정확한 양의 fitzy 이눌린을 준비하고, 마우스를 마취하는 것입니다.

다음으로, Retrobulbar Fitzy 이눌린 주사를 시행하고 75분 동안 8개의 혈액 샘플을 채취합니다. 마지막 단계는 마이크로 볼륨 형광 분광계를 사용하여 Fitz Nulin을 측정하고 2상 지수 붕괴 모델을 사용하여 신장 기능을 계산하는 것입니다. 궁극적으로 Fiti Nulin 단일 볼루스 주입 방법의 감도와 형광 분광계의 마이크로 볼륨 기능을 결합하면 마우스의 유전자 변형, 식이 변화 또는 약물 적용으로 인한 신장 기능의 차이를 감지할 수 있습니다.

지속적인 주입 및 마취 상태와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 방사성 이눌린을 사용하여 삼투압 미니 펌프를 이식하는 것입니다. 이것은 종말적인 실험이 아닙니다. 소변을 채취할 필요가 없으며 하루에 최대 24M까지 측정할 수 있습니다.

저는 Fitzy Nulin 주입 용액을 준비하기 위해 제 연구실의 연구원인 Maria Azimo와 함께 이 절차를 시연할 것입니다. 5% 용액의 2밀리리터에 충분한 ZI 이눌린의 무게를 측정하고 완전히 용해될 때까지 섭씨 90도까지 가열하여 라벨이 부착된 이눌린을 0.85% 염화나트륨 용액에 용해시킵니다. 20cm 투석막 조각을 이중 증류수에 30분 동안 넣어 투석막에 남아 있는 나트륨산을 제거하고, 그 후 멤브레인을 몇 번 세척한 다음 마개를 사용하여 용해된 fitzy inulin 씰로 투석막을 적절하게 채운 다음 전체 멤브레인의 무게를 잰다.

용해된 피지 이눌린을 0.85% 염화나트륨 용액 1리터에 투석하고 투석 후 실온에서 24시간 동안 빛을 차단한 채 천천히 저어준 후 전체 투석막의 무게를 다시 측정하고 새로운 농도를 계산합니다. 물은 삼투압으로 멤브레인으로 이동하고 결합되지 않은 FSI는 멤브레인 밖으로 이동합니다. 따라서 FSI 이눌린의 농도가 크게 감소합니다.

이 공식을 사용하여 새로운 적합 e 이눌린 농도를 계산합니다. 여기서 C는 새로운 농도입니다. N은 초기 적합 E 이눌린 양이고, V는 투석 전과 후의 투석 튜브의 무게 차이에 초기 fitzy 이눌린 용액의 부피를 더한 새로운 부피입니다. 다음으로, 0.22 미크론 주사기 필터를 통한 여과로 투석 용액을 살균합니다.

실험 전에 광표백을 피하기 위해 항상 fitzy 이눌린을 빛으로부터 보호하는 것을 잊지 마십시오. 4-5%ISO 불소로 짧게 마취 후 생쥐의 체중을 취하십시오. 토인 반사로 마취 깊이를 확인하고 기포를 제거하기 위해 100 마이크로 리터 길이의 26 게이지 바늘이있는 100 마이크로 리터 해밀턴 주사기를 사용하여 투석 된 fitzy nulin의 체중 1 그램 당 2 마이크로 리터를 흡인 한 다음 주입을 위해 1/2 인치 길이의 30 게이지 바늘로 전환하십시오.

투석된 fitzy 이눌린을 후안와신경총에 주입합니다. 생쥐가 집 케이지에서 자발적으로 회복할 수 있도록 합니다. 1mm의 쥐 꼬리를 가위로 한 번 컵에 넣고 헤파린 나트륨 미니 모세혈관에 주입한 후 여러 시점에서 혈액을 채취합니다.

채혈 후 cha seal로 미니 모세혈관을 밀봉하고 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. 밀봉된 미니 모세혈관을 헤마토크릿 모세혈관 안에 넣고 원심분리 후 5분 동안 원심분리기를 합니다. 다이아몬드 커터를 사용하여 미니 모세관을 부수고 0.2ml 튜브에 피펫팅하여 전체 플라즈마를 옮깁니다.

새로운 0.2 밀리리터 튜브에 2 마이크로 리터의 플라즈마와 18 마이크로 리터의 0.5 몰 / 리터 힙을 사용하여 1에서 10 희석을 만듭니다. 다음으로, 6개 마우스의 높은 처리량을 위해 NanoDrop 3, 300을 중복하여 희석된 샘플 2마이크로리터를 측정합니다. 단일 볼루스 주사 방법으로 전체 신장 GFR을 측정하려면 텍스트 프로토콜에 제공된 순서도 프로토콜을 따르십시오: FSE 눌린 주사 후 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 및 75분에 8개의 혈액 샘플을 채취해야 합니다.

이 순서도에서 숫자는 수집 시점을 나타내고, 괄호 안의 숫자는 샘플 번호를, 빨간색 세로선 왼쪽의 시점은 주입 시점을 나타냅니다. 각 마우스는 다른 색상으로 표시됩니다. 순차적인 혈액 수집을 얻으려면 화살표를 따르십시오.

회색 상자는 이 프로토콜을 사용하여 주입하기 전에 다음 마우스가 불소 마취를 준비해야 하는 시기를 나타냅니다. 서로 다른 마우스에서 두 개의 혈액을 채취하기까지의 최소 시간은 텍스트 프로토콜에 나열된 표준 희석액을 얻기 위해 희석된 마우스 혈장으로 1분 희석된 fitzy nulin 주입 용액입니다. 표준의 농도는 투석에 따라 다르며 FSI nulin의 각 준비마다 항상 다릅니다.

따라서 매번 표준 곡선에 대한 농도를 입력해야 합니다. 의식이 있는 마우스에서 GFR을 측정하기 위해 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 2단계 지수 감쇠 함수를 사용하여 적절한 소프트웨어로 사구체 여과율 또는 GFR을 계산하기 위해 데이터를 분석합니다. 단일 용량 정맥 주사 후 ZI 이눌린의 혈장 동역학은 GFRA 2 격실 모델의 계산에 사용되며 2 격실 모델에서 사용됩니다.

초기의 급속 붕괴 단계는 fitzy inulin이 혈관 내 구획에서 세포 외액으로 재분포되는 것을 나타냅니다. fitzy 이눌린 농도에서 천천히 감소하는 후기 단계는 주로 혈장으로부터의 전신 제거를 반영합니다. 제1형 당뇨병은 스트렙토조토신(streptozotocin)의 복강내 적용에 의해 유발되었다.

사구체여과여과(GFR)는 당뇨병 1형 당뇨병 유발 전과 5주 후에 결정되었으며, 당뇨병 동물은 사구체 과여과를 명확하게 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 단일 볼루스 주입 기법을 사용하고 2상 지수 DK 모델을 사용하여 큰 마우스에서 GFR을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.