저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석

본 절차의 전반적인 목적은 망막 박리의 전사체 분석을 위해 인간 망막 수술 검체로부터 RNA를 정제하는 것입니다. 이를 위해 필요한 시약과 재료를 실험실에서 준비하여 병원으로 보냅니다. 수술 과정 중에 검체를 채취하여 다시 실험실로 회수합니다.

그 후 표준화된 염화세슘 밀도 구배법을 사용하여 RNA를 정제하고, 정제된 RNA의 품질을 평가합니다. 최종적으로 mRNA 발현 분석을 통해 주요 유전자의 발현 변화로 나타나는 망막 박리 과정에 염증과 광수용체 퇴행이 모두 관여함을 확인합니다. 전사체 분석으로 식별된 이러한 과정에서, 기존의 GTIN chlor와 같은 RNA 정제법(ole로도 알려짐)과 비교했을 때 이 저널 방식의 주요 장점은 결과물인 RNA에 DNA가 오염되지 않는다는 점입니다.

이 기술의 응용 범위는 망막 박리 치료까지 확장되며, 이는 새로운 보조 요법을 개발하기 위한 기술적 수단을 제공합니다. 수집할 각 시료에 대해, RNase-free 피펫을 사용하여 5 mL 멸균 폴리에틸렌 라운드 바텀 튜브에 6 M RNase-free guanine chloride 용액 2.4 mL를 채웁니다. 아르곤 가스를 사용하여 튜브의 상단을 채웁니다.

그 다음 캡을 빠르게 닫고 꽉 눌러 밀봉되었는지 확인합니다. 이렇게 하면 수술용 보관함에서 수년간 보관하는 동안 염화 구아닌의 산화를 방지할 수 있습니다. 다음으로, 5 mL 튜브 각각을 50 mL 멸균 폴리프로필렌 원추형 바닥 튜브에 넣습니다.

조직을 넣고 캡을 돌려 잠근 후, 50 milliliter 튜브를 폴리스티렌 랙에 배치합니다. 그런 다음 랙과 준비된 봉투, 작성된 배송 양식을 병원 내의 판지 상자에 넣습니다. 수술 보관함에서 판지 상자를 꺼내 수술실로 가져옵니다.

수술 중에 망막 표본을 chloride 용액이 채워진 튜브에 넣습니다. 튜브를 단단히 닫습니다. 튜브를 짧게 혼합합니다.

그런 다음 튜브를 혈액 튜브 로커에 놓고 10분 동안 흔들어 줍니다. 동봉된 검체 양식에 환자 식별 정보, 수술 날짜 및 추가 비고 사항을 기입하십시오. 그런 다음 해당 번호가 매겨진 50 milliliter 튜브에 식별 번호를 적습니다.

그런 다음 수술 검체가 담긴 5 mL 튜브를 50 mL 튜브 안에 넣습니다. 종이 티슈를 다시 채우고 튜브의 캡을 닫습니다. 그 후 50 mL 튜브와 검체 접수 양식을 적절한 완충 봉투에 넣고 밀봉합니다.

샘플이 실험실에 도착하면, 튜브를 위아래로 움직이면서 Polytron™ 균질기를 최대 설정으로 1분 동안 작동시켜 5 mL 튜브 내의 검체를 균질화합니다. 샘플 균질화가 완료되면, 다당류를 추출하기 위해 2 M 아세트산 칼륨 270 µL를 첨가하고 튜브를 쉐이커 위에 수평으로 놓습니다. 10분 동안 강하게 흔들어 섞은 후, 20 °C에서 6,500 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다.

원심분리 후, 피펫을 사용하여 펠렛이 섞이지 않도록 가용성 분획을 조심스럽게 흡입합니다. 상층액을 14 milliliter 멸균 RNase-free 튜브로 옮깁니다. 상층액에 100 millimolar Tris 내의 1% Sodium Lauroyl Sarcosine 5.3 milliliters와 cesium chloride 3.2 grams를 추가합니다.

사르코신(sarcosine)은 막을 가용화하며, 염화세슘(cesium chloride)은 농도 구배를 생성하는 데 사용됩니다. 튜브를 1분 동안 볼텍싱하여 혼합하십시오. 멸균된 11 ml 폴리머 원심분리 튜브에 염화세슘 EDTA 1.8 ml를 추가하십시오.

그 다음 10 milliliter 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여, RNA 용액이 튜브의 내벽을 타고 흘러내리게 하여 세슘 클로라이드 EDTA 용액 위에 층을 이룹니다. 튜브를 원심분리기에 넣습니다. 필요한 경우 레티나가 포함되지 않은 버퍼가 들어 있는 두 번째 튜브를 균형추로 사용하며, 20 degrees Celsius에서 225, 000 G로 24시간 동안 원심분리합니다.

다음 날, 원심분리 후 튜브 상단에 지질층이 형성됩니다. DNA는 중간층에 위치하며, RNA는 튜브 바닥에 펠릿 형태로 가라앉게 됩니다.

멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상단의 지질층을 조심스럽게 제거하고, 두 번째 멸균 파스퇴르 피펫으로 이를 버립니다. 점성이 있는 DNA가 흡입될 때까지 용액을 점진적으로 제거합니다. 해당 용액과 DNA를 버립니다.

그 다음, 세 번째 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 남은 용액을 제거하고 버립니다. 이때 RNA 펠렛이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 화염 멸균한 메스로 여기 보이는 것처럼 튜브를 절단하고 윗부분을 버립니다.

남은 부분을 멸균 거즈 위에 거꾸로 놓습니다. 튜브를 뒤집고 피펫을 사용하여 160 µL의 guine chloride로 조심스럽게 헹굽니다. 펠릿을 10분 동안 건조시킵니다.

펠렛이 건조되면 150 µL의 Tris-EDTA-SDS에 다시 현탁합니다. 다음으로 150 µL의 Tris-EDTA와 30 µL의 3 M sodium acetate를 첨가한 후, 볼텍싱하여 RNA를 침전시킵니다. 얼음처럼 차가운 100% ethanol 900 µL를 첨가합니다.

튜브를 볼텍싱한 후 녹고 있는 얼음 위에 30분 동안 둡니다. 그런 다음 4°C에서 18,000 G로 30분 동안 튜브를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 아주 작은 흰색 펠렛이 보일 수도 있고 보이지 않을 수도 있습니다.

펠릿의 가시 여부와 상관없이 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그다음 과량의 염을 제거하기 위해 실온의 70% ethanol 500 µL를 첨가하고 볼텍싱한 후, 4 °C에서 18,000 G로 20분간 튜브를 원심분리합니다. 70% ethanol 세척과 원심분리 과정을 반복한 후, P 200 피펫을 사용하여 남아 있는 ethanol을 모두 제거합니다.

펠렛을 10분 동안 공기 건조시킵니다. 50 µL의 탈이온수(dey treated water)에 펠렛을 재부유시킨 후, 볼텍싱으로 2분간 강하게 혼합합니다. 그 다음, 샘플을 45 °C 항온수조에 15분 동안 둡니다.

RNA를 완전히 재부유시킵니다. 마지막으로 260 nanometers에서의 흡광도로 RNA 농도를 결정하고, 프로토콜에 따라 젤 전기영동으로 RNA를 분석합니다. 첨부 문서에서는, 망막 박리의 전사체를 조사하기 위해 저널 절차를 사용하여 망막 박리 환자 18명과 사후 망막으로 준비된 연령 일치 대조군 18명으로부터 망막 RNA를 회수하고 분석하였습니다.

이후 RNA를 정제하고 본 보고서에 기술된 대로 젤 전기영동과 rettino base를 사용하여 분석하였습니다. 여기에 표시된 레이더 그래프는 단핵구 화학성 유인 물질인 M CP one 유전자 CCL two의 발현량을 나타냅니다. 그림의 오른쪽 RD로 표시된 부분은 망막 박리 환자의 RNA에 해당하며, 왼쪽의 N으로 표시된 부분은 대조군의 RNA에 해당함을 확인할 수 있습니다. 오른쪽의 대부분의 RD 검체에서 왼쪽의 대조군에 비해 높은 C 값이 나타난 것에서 알 수 있듯이, 망막 박리는 CCL two의 상향 조절을 유발합니다.

여기서 볼 수 있듯이, 이러한 증가는 망막 박리 환자의 염증을 나타냅니다. 막대 광수용체 신호 전달 유전자인 GNAT 1의 발현은 CCL 2와 반대로 감소했으며, 오른쪽의 RD 시료에서 낮은 수치를 보입니다. 단파장 원추세포 옵신인 OPN 1SW와 항상성 유전자인 CRX의 발현 감소 또한 관찰되었으며, 이는 망막 박리 환자에서 막대세포와 원추세포 모두의 광수용체 퇴행이 일어났음을 시사합니다. 이 방법을 통해 망막 박리 후의 유전자 발현 변화에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 또한 유전성 망막 퇴행과 같은 동물 모델의 다른 망막 병리에도 적용할 수 있습니다.

이 방법에 익숙하지 않은 개인은 핵산 Cy.A에 대한 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 인증 후 RNA 작업이 까다롭기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 보완 학습으로서 매우 중요합니다.