저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석
August 14th, 2013
우리는 망막 박리의 transcriptomic 분석 retinectomy에서 망막 샘플을 사용했습니다. 우리는 수술 블록과 실험 사이의 RNA 절약 할 수있는 절차를 개발했다. 우리는 정제 된 RNA를이 마이크로 어레이 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위해 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜입니다.
이 절차의 전반적인 목표는 망막 박리에서 전사체 분석을 위해 인간 망막 수술 표본에서 RNA를 정제하는 것입니다. 이를 위해 저널을 사용하여 수술 표본 수집에 필요한 시약과 재료를 실험실에서 준비하여 병원으로 보냅니다. 수술 과정에서 검체를 채취하여 실험실로 반환합니다.
그런 다음 표준화된 염화세슘 구배 절차를 사용하여 RNA를 정제하고 정제된 RNA의 품질을 평가합니다. 결국. mRNA 발현 분석은 염증과 광수용체 변성이 모두 주요 유전자 발현의 변화로 나타나는 망막 박리에 관여한다는 것을 보여줍니다. 전사체 분석에 의해 확인된 이러한 공정에서, 올레라고도 하는 추출에서 GTIN chlor와 같은 기존 orna 정제에 비해 저널의 주요 장점은 orna가 DNA로 오염되지 않은 결과입니다.
이 기술의 적용은 새로운 보조 요법을 개발하기 위한 기술적 수단을 제공하기 때문에 망막 박리 치료법으로 확장됩니다. 수집할 각 샘플에 대해 RNA가 없는 피펫을 사용하여 5ml의 멸균 폴리에틸렌 둥근 바닥 튜브에 2.4ml의 6몰 RNA가 없는 guine chloride 용액을 채웁니다. 아르곤 가스를 사용하여 튜브의 상단 부분을 채웁니다.
그런 다음 캡을 단단히 눌러 빠르게 놓아 밀봉되었는지 확인합니다. 이것은 수술 캐비닛에 수년간 보관하는 동안 염화굿구이가 산화되는 것을 방지합니다. 다음으로, 5 밀리리터 튜브 각각을 50 밀리리터 멸균 폴리 프로필렌, 원뿔형 바닥 튜브에 넣습니다.
티슈를 추가하고 캡을 조인 후 50ml 튜브를 폴리스티렌 랙에 넣습니다. 그런 다음 랙과 준비된 봉투를 준비된 배송 양식과 함께 병원의 판지 상자에 넣습니다. 수술 캐비닛에서 골판지 상자를 수술실로 가져옵니다.
수술 중에는 망막 표본을 양과 염화물 용액으로 채워진 튜브에 넣습니다. 튜브를 단단히 닫으십시오. 튜브를 짧게 섞습니다.
그런 다음 튜브를 혈액 튜브 로커에 10분 동안 놓습니다. 동봉된 샘플 양식에 환자 식별, 수술 날짜 및 추가 참고 사항을 작성하십시오. 그런 다음 해당 번호가 매겨진 50밀리리터 튜브에 식별 번호를 씁니다.
그런 다음 수술 표본과 함께 5mm 튜브를 50ml 튜브에 넣습니다. 종이 티슈를 교체하고 튜브를 덮습니다. 그런 다음 50ml 튜브와 샘플 흡입 양식을 적절한 패딩 봉투에 넣고 밀봉합니다.
실험실에서 시료를 받으면 튜브를 위아래로 움직이면서 최대 설정에서 1분 동안 poly tron TM 균질기를 사용하여 5ml 튜브의 표본을 균질화합니다. 샘플이 균질화되면 다당류를 추출하기 위해 270마이크로리터의 2몰 초산칼륨을 추가하고 튜브를 수평 위치의 셰이커에 놓습니다. 10분 동안 세게 흔든 다음 10°C에서 6분, 500G에서 20분 동안 원심분리합니다.
스핀 후 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 용해성 분획을 조심스럽게 흡인합니다. 상등액을 14ml 멸균 RNA가 없는 튜브로 옮깁니다. 상층액 옆에 5.3ml의 1%와 100밀리몰 트리몰 및 3.2g의 염화세슘에 Laurel Sarcosine을 추가합니다.
사르코신은 멤브레인을 용해시키고 염화세슘은 구배를 생성하는 데 사용됩니다. 1분 동안 볼텍싱하여 튜브를 혼합합니다. 1.8ml의 염화세슘 EDTA를 멸균 11ml 폴리머 원심분리 튜브에 추가합니다.
그런 다음 10 밀리리터 멸균 목사 피펫을 사용하여 RNA 용액을 염화 세슘 EDTA 용액에 층을 이루어 튜브의 내부 표면을 따라 내려가도록합니다. 튜브를 원심분리기에 넣습니다. 필요한 경우 망막이 없는 완충액이 들어 있는 두 번째 튜브를 저울로 사용하고 섭씨 20도에서 225, 000G에서 24시간 동안 회전합니다.
다음 날. 스핀 후에 튜브 상단에 지질층이 형성됩니다. DNA는 중간에 있고 RNA는 튜브 바닥에서 펠릿화됩니다.
멸균 파스터 피펫을 사용하여 두 번째 멸균 파스터 피펫으로 상부 지질층을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 점성 DNA가 흡인될 때까지 용액을 점차적으로 제거합니다. 용액과 DNA를 폐기합니다.
그런 다음 세 번째 멸균 목사 피펫을 사용하여 남은 용액을 제거하고 폐기합니다. RNA 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다. 이제 화염 살균 메스를 사용하여 여기에 그림과 같이 튜브를 자르고 윗부분을 버립니다.
나머지 부분을 멸균 거즈에 거꾸로 놓습니다. 튜브를 뒤집고 피펫을 사용하여 160마이크로리터의 염화기로 섬세하게 헹굽니다. 펠릿을 10분 동안 건조시킵니다.
펠릿이 건조되면 150 마이크로 리터의 트리스, E-D-T-A-S-D-S. 다음으로, 150 마이크로 리터의 tris, EDTA 및 3 몰 아세트산 나트륨 30 마이크로 리터를 추가 한 다음 와류를 추가하여 RNA를 침전시킵니다. 900마이크로리터의 차가운 얼음, 100% 에탄올을 추가합니다.
튜브를 소용돌이치고 녹는 얼음 위에 30분 동안 놓습니다. 그런 다음 튜브를 18, 섭씨 4도에서 000G로 30분 동안 원심분리합니다. 스핀 후 작은 흰색 펠릿이 보이거나 보이지 않을 수 있습니다.
펠릿을 볼 수 있는지 여부는 상등액을 섬세하게 흡인하고 버립니다. 그런 다음 과잉 소금을 제거하기 위하여는, 실내 온도, 70%ethanol 및 와동의 관 분리기, 18에 20 분 동안 관, 4 섭씨 온도에 000 G의 500 마이크로리터를 추가하십시오. 70% 에탄올 세척 및 탈수를 반복한 후 P 200 피펫을 사용하여 남아 있는 에탄올을 제거합니다.
펠릿을 10분 동안 자연 건조시킵니다. 펠릿을 50마이크로리터의 데이 처리된 물 혼합물에 2분 동안 볼텍싱하여 격렬하게 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 45도의 수조에 15분 동안 넣습니다.
RNA를 완전히 재현탁합니다. 마지막으로 260나노미터에서 흡광도에 의해 RNA의 농도를 측정하고 프로토콜에 따라 겔 전기영동으로 RNA를 분석합니다. 함께 제공된 문헌인 망막 박리의 전사체를 조사하기 위해 저널 절차는 망막 박리가 있는 18명의 환자와 사후 망막을 사용하여 준비된 18명의 연령 일치 대조군에서 망막 RNA를 회수하고 분석하는 데 사용되었습니다.
이후 RNA를 정제하고 본 보고서에 기재된 바와 같이 겔 전기영동 및 레티노 염기를 사용하여 분석하였으며, 여기에 표시된 것은 단핵구 화학주성 M CP 1 유전자 CCL 2의 발현을 나타내는 레이더 그래프입니다. RD로 표시된 그림의 오른쪽 부분은 망막 박리 환자의 RNA에 해당하고, N으로 표시된 왼쪽 부분은 여기에서 볼 수 있듯이 대조군의 RNA입니다. 망막 박리는 CCL 2의 상향 조절을 초래하며, 이는 왼쪽의 대조군에 비해 오른쪽에 있는 대부분의 RD 표본에서 높은 C 값으로 나타납니다.
이러한 증가는 여기에서 볼 수 있듯이 망막 박리 환자의 염증을 나타냅니다. GNAT 1 유전자를 전달하는 막대 광수용체의 발현은 CCL 2와 반대로 감소하였고, 우측의 RD 표본은 값이 낮았으며, 단파 원뿔 옵신 O PN 1 SW의 발현이 감소하였으며, 호메오 유전자 CRX도 관찰되었는데, 이는 망막 박리 환자에서 간상체와 원추체 모두의 광수용체 변성을 시사하는 것으로, 이 방법을 통해 망막 박리 후 유전자 발현 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 또한 유전성 망막 변성과 같은 동물 모델의 다른 망막 병리학에도 적용할 수 있습니다.
이 방법을 처음 접하는 개인은 핵산에 대한 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. Cy.이 방법의 시각적 시연은 인증 후 RNA가 까다로워지는 작업(workover)으로 매우 중요합니다.
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개요
본 연구는 망막 박리 사례에서 인간 망막 수술 시편으로부터 RNA를 정제하여 전사체를 분석하는 데 중점을 둡니다. RNA의 품질을 보장하기 위해 표준화된 세슘 염화물 구배 절차가 사용됩니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 망막 생물학
- 전사체학
배경
- 망막 박리는 중대한 시력 상실로 이어질 수 있습니다.
- 유전자 발현 변화를 이해하는 것은 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다.
- RNA 품질은 정확한 전사체 분석을 위해 필수적입니다.
- 기존의 RNA 정제 방법은 오염으로 이어질 수 있습니다.
연구 목적
- 망막 샘플로부터 RNA를 정제하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 망막 박리와 관련된 mRNA 발현을 분석합니다.
- 염증 및 광수용체 퇴행의 관여를 평가합니다.
사용된 방법
- 망막 절제술 중 망막 샘플 수집.
- RNA 추출을 위한 시약 및 자재 준비.
- RNA 정제를 위한 표준화된 세슘 염화물 구배 절차.
- 마이크로어레이 분석을 위한 RNA 품질 평가.
주요 결과
- 망막 박리와 관련된 주요 유전자 발현 변화 식별.
- 전사체 분석에서 염증 및 광수용체 퇴행의 증거.
- 새로운 방법이 DNA 오염을 방지한다는 증명.
- 마이크로어레이 분석에 적합한 향상된 RNA 품질.
결론
- 개발된 RNA 정제 방법은 망막 샘플에 효과적입니다.
- 전사체 분석은 망막 박리의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 미래 연구는 이 방법을 망막 질환 연구에 활용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Retinal detachment triggers concurrent inflammation and photoreceptor degeneration, creating a complex pathophysiological environment that complicates therapeutic development. The jouRNAl method enables high-fidelity transcriptomic profiling of surgically discarded human retinal specimens, providing a scalable source of disease-relevant tissue for target validation. This approach supports mechanistic de-risking by linking molecular signatures to clinical phenotypes, informing go/no-go decisions in ophthalmology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous detection of inflammatory and degenerative pathways in human retinal tissue.
- Operational Value: Transforms discarded surgical specimens into validated biological systems, reducing reliance on animal models for early target assessment.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing human-derived expression data on CCL2, GNAT1, OPN1SW, and CRX as biomarkers of RD progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers DNA-free RNA suitable for microarray and RT-PCR, ensuring assay specificity for gene expression readouts.
- Operational Value: Standardized cesium chloride gradient protocol ensures reproducibility across batches and sites, enabling scalable screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified RNA quality validated by gel electrophoresis and absorbance, supporting reliable compound evaluation in phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by using human retinal specimens to validate findings in animal models of inherited retinal degeneration.
- Biomarker Alignment: Identifies CCL2 upregulation and photoreceptor gene downregulation as translatable signatures for therapeutic monitoring.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic insight into RD progression, informing biomarker-stratified clinical trial design.
Pipeline & Workflow Integration
The jouRNAl method integrates into the discovery continuum from early target identification through preclinical validation, enabling human tissue-based de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of inflammation and degeneration pathways via transcriptomic analysis of human retinal specimens.
- Screening: Delivers standardized, quantitative RNA outputs suitable for high-throughput gene expression profiling.
- Analytics: Generates measurable readouts (e.g., CCL2 upregulation, GNAT1 downregulation) that allow cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects human specimen data to preclinical continuity by enabling comparative analysis in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA extraction from surgical tissues, applicable across retinal pathologies and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct human tissue transcriptomics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via cesium chloride purification, minimizing batch variability in multi-site studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-derived molecular evidence, reducing late-stage biological risk in ophthalmology programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concurrent inflammation and degeneration signatures in patient-derived samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and gradient ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to cesium chloride, ultracentrifuges, and RNase-free laboratory infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgical, pathology, and molecular biology units for specimen tracking.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of homogenization and lysis steps.
- Practical limitation: RNA yield depends on timely specimen transfer and avoidance of RNase exposure during surgical collection.
