Name: 저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 인간 망막 수술 표본에서 RNA 정제 및 전사체 분석 방법을. 세슘 염화물 그래디언트 기법으로 염증과 광수용체 퇴행 관련 유전자 발현 변화를 연구하여 망막 박리 메커니즘을 규명합니다.

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우리는 RNA 정화 프로토콜을 편집 그들의 도움을 사챠 Reichman 도미니크 Santiard - 남작 감사합니다.

1. 저널 : 외과 블록에서 표본을 복구하는 절차 실험실에서 <ol><li> 급행 선박 회사로부터 수입 계약을 얻는다. </li><li> 연구실 (전화 번호 및 이메일 주소)에서 담당자를 나타내는 실험실 우편 주소 (또는 25) 배송 ​​형태 10를 채우십시오. </li><li> (또는 25) 10 준비 샘플 양식은 10 (또는 25)에 숫자 1. 이러한 양식), 환자의) 익명 ID에 알리기 위해 수술 날짜와 C) 추가 비고란에 의사 추가을 원하십니까 B 전용 공간이 (가) 있습니다. 10 (또는 25) 덧대 진 봉투를 (150 X 210mm) 준비합니다. </li><li> (DEPC) H 2 O (GHCl를) 처리 diethylpyrocarbonate 6 M 구아니딘 클로라이드의 RNase가없는 시약 25 (또는 65) mL를 사용하여 제조. </li><li> 채우기 10 25 GHCl 용액 2.4 ml의 5 ML 멸균 폴리에틸렌 둥근 바닥 튜브를 번호. </li><li> 프레스 TI보다,이 튜브의 상단 부분을 채우기 위해 아르곤 가스를 사용ghtly 수술 캐비닛에 스토리지 몇 년 동안 GHCl 용액의 산화를 방지하기 위해 뚜껑에. </li><li> 50 ML 멸균 폴리 프로필렌 원뿔 밑바닥 관 나사 모자로 매 5 ML 튜브를 소개합니다. 50 ML 튜브에 10 ML 튜브를 보유하는 깨끗한 종이 조직의 조각을 사용하여 튜브를 닫습니다. </li><li> 패딩 봉투, 운송 양식, 샘플 형태와 골 판지 상자 폴리스티렌 랙과 랙에 50 ML 튜브를 놓습니다. </li><li> 자신의 읽기를 촉진하는 골 판지 상자 뚜껑의 안쪽에 : 지시 사항을 (1.12-1.19 참조) 붙여 넣습니다. </li><li> 병원 담당자에게 우편으로 골판지 상자를 보냅니다. </li></ol> 병원에서 <ol start="11"><li> 수술 방에 수술 장에서 골판지 상자를 가져옵니다. 주의주의 : 절차는 면역 손상 환자를 포함하는 경우, 마분지는 수술 방으로 데려 수 없습니다. </li><li> 수술하는 동안, 망막 specim 배치번호가 5 ML 멸균 폴리 프로필렌에 엉 GHCl 솔루션으로 가득합니다. 단단히 튜브를 닫습니다. </li><li> 간단히 튜브를 반환합니다. </li><li> 10 분 동안 혈액 튜브 로커에 튜브를 놓습니다. </li><li> 첨부 된 샘플 번호의 양식을 작성하십시오. </li><li> 해당 번호의 50 ML 튜브 위에 식별 번호를보고합니다. </li><li> 50 ML 튜브에 수술 시편 10 ML 튜브를 소개 티슈를 교체하고 튜브를 고정합니다. </li><li> 첨부 된 패딩 봉투 중 하나 관과 그것으로 채워진 샘플 양식을 소개합니다. 닫습니다. </li><li> 픽업 특급 운송 회사를 호출합니다. </li></ol> 2. RNA 정화 실험실에서 <ol><li> 튜브를 상하로 이동하는 동안 1 분간 균질화와 GHCl 솔루션의 5 ML 튜브 폴리 프로필렌 시료를 균질화. </li><li> 2 M 칼륨 아세테이트 산도 5.0 270 μl를 추가합니다. 그것의 뿌리에 튜브를 삽입하여 10 분 동안 격렬하게 흔들어수평 위치 (420 분 -1). </li><li> 20 ℃에서 5,000 rpm으로 (6,500 XG)에서 10 분 원심 분리 </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 부드럽게 용해 비율을 대기음. </li><li> 14 ML 멸균 튜브에 전송합니다. </li><li> 100 MM 트리스 산도 8.0, N-Lauroylsarcosine 1 %의 5.3 ML를 추가합니다. </li><li> 세슘 클로라이드 (CSCL) 3.2 g을 소용돌이로 교반하여 튜브를 섞는다. </li><li> 멸균 11 ML의 polyallomer 원심 튜브에 CSCL / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 1.8 ML를 추가합니다. </li><li> 10 ㎖ 멸균 파스퇴르 피펫, 밀도 쿠션을 방해하지 않도록 튜브의 가장자리에 천천히 밀어 1.8 ML CSCL / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 RNA 솔루션을 전송합니다. </li><li> 회 전자에 튜브를 (망막 필요없이 버퍼를 포함하는 두 번째 튜브) 놓습니다. </li><li> 20 ℃에서 32,000 rpm으로 (225,000 XG)에서 24 시간을 원심 분리기 </li><li> 멸균 파스퇴르 피펫 솔루션의 우수한 부분을 제거하고 폐기합니다. </li><li> 을 확인하면서 서서히 제거DNA가 (점성) 두 번째 멸균 파스퇴르 피펫으로 흡입하고, 그것을 폐기되어 순간. </li><li> 제 멸균 파스퇴르 피펫과 RNA 펠렛을 풀어 않도록주의하면서 남아있는 용액을 제거. </li><li> 와 튜브의 섹션 하단 메스 화염 멸균 후 거꾸로 멸균 시선 튜브의 나머지 부분을 넣어. </li><li> 튜브를 반대로 GHCl 160 μL로 섬세하게 헹구십시오. </li><li> 10 분 동안 펠릿 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 150 μL (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 0.1 % SDS 10 MM 트리스 산도 7.5)에서 펠렛을 resuspend을. </li><li> 2 ㎖ 멸균 microcentrifuge 관에 솔루션을 전송 한 후 30 ㎕의 (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 0.1 % SDS 10 MM 트리스 산도 7.5)과 잔류 펠렛을 수확. </li><li> 150 μl를 (- 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 MM 트리스 산도 7.5)을 추가합니다. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.0, 소용돌이 관의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 에탄올 100 % (-20 ° C), 소용돌이 관 900 μl를 추가합니다. </li><li> 녹는 얼음에 튜브 30 분 놓습니다. </li><li> CEN4에서 15,000 rpm으로 튜브 30 분 ° C.를 trifuge </li><li> 미묘 분획을 흡입하고, 그것을 폐기. </li><li> 500 μL 70 % 에탄올 (RT), 소용돌이 튜브를 추가합니다. </li><li> 4 15,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 20 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 세척 단계 (70 % 에탄올)를 반복합니다. </li><li> 간단히 원심 분리 P200 피펫에 남아있는 에탄올을 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 펠렛 공기가 건조 보자. </li><li> 50 μL DEPC 처리 된 H 2 O의 펠렛을 resuspend을 </li><li> 로 소용돌이 적극적으로 섞는다. </li><li> 물을 욕조에 45에서 15 분 ° C를 품어. </li></ol> 3. 젤 전기 영동으로 RNA 분석 <ol><li> 화학 후드 내부의 아가로 오스 젤을 붓는다. </li><li> 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 분석 할 수있는 RNA의 2 μL 및 샘플 준비 버퍼의 6.4 μl를 추가합니다. </li><li> 두 번째 1.5 ML 튜브에 RNA 표준의 3 μL 및 샘플 준비 버퍼의 9.6 μl를 추가합니다. </li><li> 65 튜브 15 분을 가열 ° C얼음에 넣어. </li><li> RNA 샘플 튜브와 RNA 표준 관 염료로 1 μL EB로드 버퍼에 염료없이 1 μL ethidium의 브로마이드 (EB) 로딩 버퍼를 추가합니다. </li><li> 염료 중 하나 (브롬 페놀 블루) 젤 아래의 2 / 3를 도달 할 때까지 버퍼를 실행에있는 화학 후드 안쪽에 100 V, - 80 이하 젤을 실행합니다. </li><li> 젤 250 ML 데 DEPC 처리 2X SSC로 두 번 15 분을 씻어. </li><li> UV 조명 아래에서 디지털화 된 이미지를 가져 가라. </li><li> 위 밴드 (23S rRNA의)과 낮은 대역 (16 초 rRNA의) 사이의 비율을 계산합니다. </li></ol> 4. RNA의 최종 정화 <ol><li> DEPC 처리 된 H 2 O (필요한 경우) 100 μL로 RNA 샘플의 볼륨을 조정합니다. </li><li> 100 페놀 산 μL (1 ML 페놀 나트륨 아세테이트, 산도 5.2의 50 mm의 DEPC 처리 된 H 2 O + 130 μL에서 포화) 적극적으로 소용돌이. 추가 </li><li> 상온에서 13,000 rpm으로 (15,000 XG)에서 10 분 원심 분리기. </li><li> Recove연구는 새로운 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 수성 단계 (상층)을 신중하게 전송할 수 있습니다. </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.2 에탄올 250 μL 100 % (-20 ° C)의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 녹는 얼음에 튜브 30 분 알을 품다. </li><li> 4에서 14,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 30 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 주의 깊게 분획을 흡입하고, 그것을 폐기. </li><li> 500 70 % 에탄올 μL (실내 온도)와 소용돌이 튜브를 추가합니다. </li><li> 4에서 14,000 RPM (18,000 XG)에서 튜브 20 분 ° C.를 원심 분리 </li><li> 세척 단계 (70 % 에탄올)를 반복합니다. </li><li> 간단히 원심 분리 P200 피펫에 남아있는 에탄올을 제거합니다. </li><li> 공기가 10 분 동안 펠렛을 건조 할 수 있습니다. </li><li> DEPC 처리 된 H 2 O 50 μL로 펠렛을 resuspend을 </li><li> 다음 45 관 15 분 ° C.를 품다 </li><li> RNA 샘플 2 μL에 260 nm의 280 nm에서 흡광도 (ABS)을 측정한다. 비율 Abs260/Abs280을 계산 하였다. </li> &lt;리&gt; 스토어 -80에서 RNA 샘플 ° C (몇 년 동안 안정적). </li></ol> 5. 솔루션 및 청소 절차 <ol><li> 칼륨 아세테이트 2 M, pH를 5.0 : DEPC 처리 된 H 2 O의 70 ML에 19.6 g 칼륨 아세테이트 용해 DEPC 처리 된 H 2 O 5 개의 린스 다음, 15 분간 1M NaOH를 가진에 몸을 담글으로 ph-미터 프로브를 청소 아세트산과 pH를 5.0으로 조정 후 DEPC 처리 된 H 2 O와 100 ML에 볼륨을 조정 </li><li> 트리스 - 염산 100 밀리미터, 산도 8.0, N-Lauroylsarcosine 1 %는 0.5 M 트리스 - 기본 산도 8.0 40 ML에 N-Lauroylsarcosine 2 g의 (후드) 용해. ) DEPC 처리 된 H 2 O로 200 ML에 볼륨을 조정 CSCL / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : DEPC 처리 된 H 2 O로 준비 50 ML 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 7.5 CSCL의 96g 압력솥과 DEPC 처리 된 H 2 O와 100 ML에 볼륨을 조정 pH가 &lt;7.5을 확인합니다. </li><li> 아가로 오스 겔 1 %는 : 62 ML DEPC 처리 된 H 2 O의 아가 약 1 g을 넣어 전자 레인지에서 가열한다. 12.3 M의 18 ML을 추가합니다포름 알데히드, 배 MOPS 20 ㎖. 화학 후드 안쪽에 붓는다. </li><li> 시료 전처리 버퍼 : 준비 즉흥적 수 있습니다. 배 MOPS, 12.3 M 포름 알데히드 및​​ 포름 아미드 40 μL의 16 μL의 화학 후드 8 μL 내부 섞는다. </li><li> EB 로딩 버퍼 (염료없이) : 준비 즉흥적 수 있습니다. DEPC 처리 된 H 2 O로 준비 80 % 글리세롤의 20 μL로 4 μl를 10 ㎎ / ㎖ ethidium의 브로마이드를 추가 </li><li> EB 로딩 버퍼 (염료) : 준비 즉흥적 수 있습니다. 0.25 % xylen cyanol, DEPC 처리 된 H 2 O 0.25 % 브롬 페놀 블루를 포함하는 80 % 글리세롤의 10 μL에 2 μL 10 ㎎ / ㎖ ethidium의 브로마이드를 추가 </li><li> 버퍼 실행 : 60 ML 배 MOPS로, 12.3 M 포름 알데히드의 54 ML과 DEPC 처리 된 H 2 O 186 ML를 추가 </li><li> 교반하면서 37 2 시간 동안 0.1 % v / V를 diethylpyrocarbonate에 품어 증류수 ° C : H 2 O를 DEPC - 처리. 오토 클레이브 멸균. </li><li> 균질 청소 : 1 L로 세척 용액의 25 ML (RBS)를 추가 DEPC-H 2 O를 처리하고, 교반 축이 1 분 immerge 일. 60 2 시간을 품어 ° C. 알루미늄에 DEPC 처리 된 H 2 O 랩 계기로 완전히 헹구고 장비 상자에 넣어. 상자를 포장. 오토 클레이브 멸균. </li><li> 전기 장치를 청소 : 장치, 트레이 15 우물 빗을 씻으십시오. 3 % 과산화수소에 15 분 알을 품다. 100 % 에탄올로 한 번 씻어. 건조한 공기. </li><li> 유리 접시를 청소하는 : 모든 밤 유리 접시에게 RBS 2 %를 청소 한 후 200 ℃에서 살균하기 전에 증류수로 씻어 </li></ol>

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</ol>

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수술 블록의 조직 복구를위한 절차의 개발은 망막 박리의 사체 분석에 필수적이다. 하나는 수술이 유형의 비상 사태와 안과 운영들이 조작 할 때 생물학 연구 프로그램에 참여하려면 약간의 시간을 가지고 연습을 통지해야한다. 이 retinectomy는 통계 수치에 도달하는 쉬운 방법은 네트워크에서 작동하는 것입니다, 그래서 각 서비스에 확률 론적으로 수행됩니다. 이러한 네트워크, 조직 컬렉션의 표준화 생물학적 분석의 성공에 필수적이다. 매우 사용하기 쉽고 수술 장에서 상온에서 저장할 수있는 정확한 지침, 수술 블록에 가까운 자료를 제공함으로써, 우리는 외과 의사가 본 연구에 참여하도록 격려했다. 또한, RNA의 정화의 표준화는이 귀중한 CL의 최고를 얻을 수 달성했다inical 표본. 순수한 RNA를의 컬렉션은 -80 ° C에서 동안 저장 될 수 있으며, 새로운 게놈 기술이 등장 할 추가 연구를 위해 사용됩니다. 프로토콜은 망막 수술 시편 제공뿐만 아니라 절개 한 후 쥐의 망막에서 ...

망막 박리의 주요 치료 목표 (RD)은 망막 색소 상피 세포에서 광 수용체의 분리로 인한 광 수용체 세포의 손상과 망막 염증을 제한하는 방법을 찾을 수 있습니다. RD 동안 RPE 세포는 dedifferentiate, 마이그레이션, 활성화되고, 합병증으로 이어지는 수축 힘을 발휘, 분리 된 망막의 표면에 확산. RD의 전사 체학 분석 RD 수술과 함께있는 최종 시력 예후를 향상시킬 수 있습니다 따라서 향후 치료 분자에 따라 수정 된 표정으로 표적 유전자를 확인하는 방법입니다. 그것은 잘 디옥시리보 핵산 (DNA)이 그대로 리보 핵산 (RNA)이 안정되지 알려진 유전 연구에 광범위하게 사용되는 후자의 안정성은 2 세 이상의 30,000 년 생물학적 샘플에서 네안데르탈 인 게놈의 시퀀싱을 허용했다. 메신저 RNA에 게놈에서 유전자의 DNA의 전사입니다주요 유전자 발현 과정 및 발현는 신호를 구성하기 위해 불안정한입니다. RNA를이 신호를 종료 RNase의 효소에 의해 매우 빠르게 분해합니다. 식을 연구 실험실에서 연구되기 전에 조직이 유기체에서 고립되면, RNA를 매우 자주 저하됩니다. 성능이 저하 된 RNA 분석을 유전자 발현에 적합하지 않습니다. 실험실 직원이 수술에 참여할 수 없기 때문에, 우리는 쉬운 절차를 개발하고 만 의사가 적절한 RNase가없는 솔루션으로 조직을 복구해야합니다. 조직의 RNA가 안정이 솔루션 실온에서 72 시간 후 분해의 부호없이 분석 할 수 있습니다. 시료에서 RNA를가 실험실 3에 전송 된 후 세슘 클로라이드 그라디언트 원심을 포함하는 표준화 된 방법에 의해 정제된다. 다음의 RNA 품질 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 및 RT-PCR에 의해 평가된다. RNA 정화 프로토콜을 가지고DNA와 RNA에 따라 다릅니다 및 RNA는 유전자 발현 연구에서 인공적인 신호를 생성하는 DNA 분자에 의해 오염되지 않도록 보장 그 밀도에 따라 분자를 분리 장점. 또한, 정량적으로 세포 내에서 가장 풍부한 RNA있는 전송 RNA를 (tRNAs를가), 리보솜 RNA (rRNAs)와 메신저 RNAs (mRNA가)되고 두 최근에서 같은 물리적 특성에 따라 분리 정제 공정의 제품을 끝낸다. 마이크로 어레이 분석 프로토콜의 대부분은 tRNA의 4-6 저해하는 역전사와 RNA 중합 효소의 사용을 포함 이후 준비에서의 tRNA의 제거에 유용합니다. 수술 표본에서 정제 된 RNA는 표준 프로토콜을 사용하여 레이블 및 마이크로 어레이 칩을 교배 그 결과는 두 개의 보완적인 방법으로, 거짓 발견 속도 방법을 사용하여 상호 정보 visuali에 따라 새로운 방법을 사용하여 분석하는웹 기반 서버 Retinobase 7,8에 데이빗.

<table><tbody><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Aventi J-E</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JS-5.3</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>LE 80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW41</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Biorad</td><td>Pac 3000</td><td></td></tr><tr><td>PolytronTM</td><td>Kinematica</td><td>PT 2100</td><td>공급 with PT-DA 2105:2</td></tr><tr><td>Agarose gel 전기영동 장치</td><td>Biorad</td><td>MiniGel Cell GT</td><td></td></tr><tr><td>이미징 시스템 </td><td>Biorad</td><td>GelDoc-It Imager</td><td></td></tr><tr><td>5 ml sterile polyethylene tube</td><td>Greiner</td><td>115261</td><td></td></tr><tr><td>sterile polyallomer centrifuge tube </td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Chemical reagents</td><td>Sigma</td><td></td><td>분자생물학 등급 (RNase 및 DNase 프리 제품)</td></tr><tr><td>세정 용액 </td><td>VWR</td><td>RBS</td><td></td></tr><tr><td>Microarray chip</td><td>Affymetrix</td><td>Human U133 plus 2 array</td><td></td></tr></tbody></table>

저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 transcriptomic 분석

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

망막 박리 (RD)은 망막 색소 상피 (RPE)에서 감각 신경 망막의 분리를 설명합니다. RPE는 빛에 민감한 뉴런, 광 수용체의 정상적인 기능에 필수적입니다. RPE에서 망막 박리 세포 외액으로 가득 물리적 차이를 만듭니다. RD는 감각 신경 망막 이온과 대사 산물의 생리적 교환이 심각하게 교란되기 때문에 RPE 모두에 영향을 세포 및 분자 불리한 이벤트를 시작합니다. 비전에 대한 결과는 비전 1의 복원의 두 조직 결과의 신속한 reapposition 이후 박리의 기간에 관련되어 있습니다. RD의 치료는 단독으로 수술이다. 유리체 겔 (유리체 절제술)의 제거는 망막 박리를 선호하는 분리 된 주변 망막의 제거에 필수적이지 않은 부분옵니다. 제거 된 망막 표본은 고해상도 nullius (1 개)이며, 따라서 일반적으로 버려.이러한 수술 표본에서 RNA를 복구하려면, 우리는 실험실 수술 블록 전송하는 동안 RNA 보존 할 수있는 절차 일기를 개발했다. 우리는 또한 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜은 정제 된 RNA를 글로벌 유전자 발현 분석에 적합하다는 것을 보증한다. RNA의 품질은 모두 RT-PCR과 마이크로 어레이 분석에 의해 확인되었다. 데이터의 분석은 RD 동안 염증과 시세포 변성의 동시 참여를 보여줍니다.

프로 저널 (그림 1)는 우리가 정제 된 RNA에 수술 블록에서 망막의 표본을 복구하고, 망막 박리의 사체를 분석 할 수 있습니다. 단핵구 화학 주성 MCP1 유전자 CCL2의 상향 조절과 유전자 GNAT1, 단파 콘 옵신 OPN1SW 및 homeogene CRX (그림 2) transducing에로드 광 수용체의 발현 감소 망막 박리가 발생합니다. GNAT1, OPN1SW 및 CRX의 감소를 동반는 시세포 변성, 막대와 원뿔 모두의 결과 동안 CCL2의 유도, 염증 9 일부터 발생한다. 콘의 손실은 NXNL2 유전자에 의해 인코딩 된로드 파생 콘 생존 요인 7,10, 또는 paralogue RdCVF2에 대한 인코딩 NXNL1의 표현의 손실에서 발생할 수 있습니다. 놀랍게도, ...

우리는 망막 박리의 transcriptomic 분석 retinectomy에서 망막 샘플을 사용했습니다. 우리는 수술 블록과 실험 사이의 RNA 절약 할 수있는 절차를 개발했다. 우리는 정제 된 RNA를이 마이크로 어레이 분석에 적합하다는 것을 보장하기 위해 세슘 염화물 원심하여 RNA를 정화하는 표준 프로토콜입니다.

저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

본 절차의 전반적인 목적은 망막 박리의 전사체 분석을 위해 인간 망막 수술 검체로부터 RNA를 정제하는 것입니다. 이를 위해 필요한 시약과 재료를 실험실에서 준비하여 병원으로 보냅니다. 수술 과정 중에 검체를 채취하여 다시 실험실로 회수합니다.그 후 표준화된 염화세슘 밀도 구배법을 사용하여 RNA를 정제하고, 정제된 RNA의 품질을 평가합니다. 최종적으로 mRNA 발현 분석을 통해 주요 유전자의 발현 변화로 나타나는 망막 박리 과정에 염증과 광수용체 퇴행이 모두 관여함을 확인합니다. 전사체 분석으로 식별된 이러한 과정에서, 기존의 GTIN chlor와 같은 RNA 정제법(ole로도 알려짐)과 비교했을 때 이 저널 방식의 주요 장점은 결과물인 RNA에 DNA가 오염되지 않는다는 점입니다.이 기술의 응용 범위는 망막 박리 치료까지 확장되며, 이는 새로운 보조 요법을 개발하기 위한 기술적 수단을 제공합니다. 수집할 각 시료에 대해, RNase-free 피펫을 사용하여 5 mL 멸균 폴리에틸렌 라운드 바텀 튜브에 6 M RNase-free guanine chloride 용액 2.4 mL를 채웁니다. 아르곤 가스를 사용하여 튜브의 상단을 채웁니다.그 다음 캡을 빠르게 닫고 꽉 눌러 밀봉되었는지 확인합니다. 이렇게 하면 수술용 보관함에서 수년간 보관하는 동안 염화 구아닌의 산화를 방지할 수 있습니다. 다음으로, 5 mL 튜브 각각을 50 mL 멸균 폴리프로필렌 원추형 바닥 튜브에 넣습니다.조직을 넣고 캡을 돌려 잠근 후, 50 milliliter 튜브를 폴리스티렌 랙에 배치합니다. 그런 다음 랙과 준비된 봉투, 작성된 배송 양식을 병원 내의 판지 상자에 넣습니다. 수술 보관함에서 판지 상자를 꺼내 수술실로 가져옵니다.수술 중에 망막 표본을 chloride 용액이 채워진 튜브에 넣습니다. 튜브를 단단히 닫습니다. 튜브를 짧게 혼합합니다.그런 다음 튜브를 혈액 튜브 로커에 놓고 10분 동안 흔들어 줍니다. 동봉된 검체 양식에 환자 식별 정보, 수술 날짜 및 추가 비고 사항을 기입하십시오. 그런 다음 해당 번호가 매겨진 50 milliliter 튜브에 식별 번호를 적습니다.그런 다음 수술 검체가 담긴 5 mL 튜브를 50 mL 튜브 안에 넣습니다. 종이 티슈를 다시 채우고 튜브의 캡을 닫습니다. 그 후 50 mL 튜브와 검체 접수 양식을 적절한 완충 봉투에 넣고 밀봉합니다.샘플이 실험실에 도착하면, 튜브를 위아래로 움직이면서 Polytron™ 균질기를 최대 설정으로 1분 동안 작동시켜 5 mL 튜브 내의 검체를 균질화합니다. 샘플 균질화가 완료되면, 다당류를 추출하기 위해 2 M 아세트산 칼륨 270 µL를 첨가하고 튜브를 쉐이커 위에 수평으로 놓습니다. 10분 동안 강하게 흔들어 섞은 후, 20 °C에서 6,500 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다.원심분리 후, 피펫을 사용하여 펠렛이 섞이지 않도록 가용성 분획을 조심스럽게 흡입합니다. 상층액을 14 milliliter 멸균 RNase-free 튜브로 옮깁니다. 상층액에 100 millimolar Tris 내의 1% Sodium Lauroyl Sarcosine 5.3 milliliters와 cesium chloride 3.2 grams를 추가합니다.사르코신(sarcosine)은 막을 가용화하며, 염화세슘(cesium chloride)은 농도 구배를 생성하는 데 사용됩니다. 튜브를 1분 동안 볼텍싱하여 혼합하십시오. 멸균된 11 ml 폴리머 원심분리 튜브에 염화세슘 EDTA 1.8 ml를 추가하십시오.그 다음 10 milliliter 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여, RNA 용액이 튜브의 내벽을 타고 흘러내리게 하여 세슘 클로라이드 EDTA 용액 위에 층을 이룹니다. 튜브를 원심분리기에 넣습니다. 필요한 경우 레티나가 포함되지 않은 버퍼가 들어 있는 두 번째 튜브를 균형추로 사용하며, 20 degrees Celsius에서 225, 000 G로 24시간 동안 원심분리합니다.다음 날, 원심분리 후 튜브 상단에 지질층이 형성됩니다. DNA는 중간층에 위치하며, RNA는 튜브 바닥에 펠릿 형태로 가라앉게 됩니다.멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상단의 지질층을 조심스럽게 제거하고, 두 번째 멸균 파스퇴르 피펫으로 이를 버립니다. 점성이 있는 DNA가 흡입될 때까지 용액을 점진적으로 제거합니다. 해당 용액과 DNA를 버립니다.그 다음, 세 번째 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 남은 용액을 제거하고 버립니다. 이때 RNA 펠렛이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이제 화염 멸균한 메스로 여기 보이는 것처럼 튜브를 절단하고 윗부분을 버립니다.남은 부분을 멸균 거즈 위에 거꾸로 놓습니다. 튜브를 뒤집고 피펫을 사용하여 160 µL의 guine chloride로 조심스럽게 헹굽니다. 펠릿을 10분 동안 건조시킵니다.펠렛이 건조되면 150 µL의 Tris-EDTA-SDS에 다시 현탁합니다. 다음으로 150 µL의 Tris-EDTA와 30 µL의 3 M sodium acetate를 첨가한 후, 볼텍싱하여 RNA를 침전시킵니다. 얼음처럼 차가운 100% ethanol 900 µL를 첨가합니다.튜브를 볼텍싱한 후 녹고 있는 얼음 위에 30분 동안 둡니다. 그런 다음 4°C에서 18,000 G로 30분 동안 튜브를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 아주 작은 흰색 펠렛이 보일 수도 있고 보이지 않을 수도 있습니다.펠릿의 가시 여부와 상관없이 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그다음 과량의 염을 제거하기 위해 실온의 70% ethanol 500 µL를 첨가하고 볼텍싱한 후, 4 °C에서 18,000 G로 20분간 튜브를 원심분리합니다. 70% ethanol 세척과 원심분리 과정을 반복한 후, P 200 피펫을 사용하여 남아 있는 ethanol을 모두 제거합니다.펠렛을 10분 동안 공기 건조시킵니다. 50 µL의 탈이온수(dey treated water)에 펠렛을 재부유시킨 후, 볼텍싱으로 2분간 강하게 혼합합니다. 그 다음, 샘플을 45 °C 항온수조에 15분 동안 둡니다.RNA를 완전히 재부유시킵니다. 마지막으로 260 nanometers에서의 흡광도로 RNA 농도를 결정하고, 프로토콜에 따라 젤 전기영동으로 RNA를 분석합니다. 첨부 문서에서는, 망막 박리의 전사체를 조사하기 위해 저널 절차를 사용하여 망막 박리 환자 18명과 사후 망막으로 준비된 연령 일치 대조군 18명으로부터 망막 RNA를 회수하고 분석하였습니다.이후 RNA를 정제하고 본 보고서에 기술된 대로 젤 전기영동과 rettino base를 사용하여 분석하였습니다. 여기에 표시된 레이더 그래프는 단핵구 화학성 유인 물질인 M CP one 유전자 CCL two의 발현량을 나타냅니다. 그림의 오른쪽 RD로 표시된 부분은 망막 박리 환자의 RNA에 해당하며, 왼쪽의 N으로 표시된 부분은 대조군의 RNA에 해당함을 확인할 수 있습니다. 오른쪽의 대부분의 RD 검체에서 왼쪽의 대조군에 비해 높은 C 값이 나타난 것에서 알 수 있듯이, 망막 박리는 CCL two의 상향 조절을 유발합니다.여기서 볼 수 있듯이, 이러한 증가는 망막 박리 환자의 염증을 나타냅니다. 막대 광수용체 신호 전달 유전자인 GNAT 1의 발현은 CCL 2와 반대로 감소했으며, 오른쪽의 RD 시료에서 낮은 수치를 보입니다. 단파장 원추세포 옵신인 OPN 1SW와 항상성 유전자인 CRX의 발현 감소 또한 관찰되었으며, 이는 망막 박리 환자에서 막대세포와 원추세포 모두의 광수용체 퇴행이 일어났음을 시사합니다. 이 방법을 통해 망막 박리 후의 유전자 발현 변화에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 또한 유전성 망막 퇴행과 같은 동물 모델의 다른 망막 병리에도 적용할 수 있습니다.이 방법에 익숙하지 않은 개인은 핵산 Cy.A에 대한 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 인증 후 RNA 작업이 까다롭기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 보완 학습으로서 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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위한 간편한 기법<em&gt; 현장에서</em인간 안구 글로브에서 각막 및 망막 조직의 내장 적출의&gt; 절단

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저널을 사용하여 인간의 망막 수술 표본의 Transcriptomic 분석

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